盧玉琳，胡 娟，李 智，何紅鵬

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

乳腺癌作為女性重大惡性腫瘤，其發(fā)病率有逐年升高趨勢，且發(fā)病年齡呈年輕化傾向[1].乳腺癌對生命的主要威脅來自腫瘤細胞的轉移，包括肺轉移、腦轉移等.腫瘤轉移是一個復雜的、多步驟過程.細胞遷移能力的增強是腫瘤轉移的必要條件之一[2].

一氧化氮(NO)是重要的生物活性氣體分子，在細胞內主要以 L-精氨酸為底物，由一氧化氮合酶(NO synthase，NOS)催化合成[3].正常情況下，NOS僅在血管內皮細胞和神經細胞中表達，分別被稱為神經型 nNOS/NOS1和上皮型 eNOS/NOS3.在炎癥發(fā)生時，巨噬細胞也能表達 NOS；另外，惡性腫瘤細胞也能高水平表達 NOS，在巨噬細胞和惡性腫瘤細胞表達的是誘導型 NOS，即 iNOS/NOS2.iNOS/NOS2在炎癥和惡性腫瘤中通過催化 NO合成發(fā)揮促炎和促癌作用[4-5].

在體內，NO主要通過兩種方式發(fā)揮其作用：一是通過經典的NO-cGMP信號途徑；二是通過對蛋白質進行翻譯后修飾作用，即蛋白質的硝基化和亞硝基化修飾，繼而影響蛋白質活性、細胞內定位以及蛋白質相互作用[6-7].在惡性腫瘤發(fā)病中，NO可以誘導腫瘤血管生成，影響腫瘤細胞增殖、凋亡和轉移[6-8]，但是到目前為止，NO影響乳腺癌轉移的分子機制仍不確定.

MRTF-A(myocardin-related transcription factor-A)是血清反應因子(serum response factor，SRF)的轉錄輔助因子.大量研究證明，MRTF-A能夠調節(jié)細胞遷移相關基因 MYL9(myosin regulatory light chain 9)、MYH9(non-muscle myosin heavy chain 9)和CYR61(cysteine-rich angiogenic inducer 61)等基因的表達，增強細胞的遷移能力，在腫瘤轉移中發(fā)揮重要作用[9-11].雖然NO與MRTF-A均促進乳腺癌轉移，但是二者之間的關系未見文獻報道.

硝普鈉(sodium nitroprusside，SNP)是一種硝酸酯類的擴血管藥物，常用于高血壓的治療.在體內，SNP轉化為NO氣體分子并與血管平滑肌受體結合，使血管平滑肌松弛；在實驗室中，SNP是一種常用的NO供體，常用于NO功能研究.

在乳腺癌患者中，70%～80%為雌激素受體陽性，故本研究以 SNP作為 NO供體處理雌激素受體陽性的乳腺癌 MCF-7細胞，探究 NO對癌細胞遷移的影響，并在分子水平研究 NO促進 MCF-7細胞遷移的作用機制.

1 材料與方法

1.1 材料

乳腺癌細胞 MCF-7購自中國科學院細胞庫.胎牛血清，天津康源生物技術有限公司；細胞完全培養(yǎng)基 F12，HyClone公司；SNP、Hemoglobin(NO 清除劑)、Hoechst、一氧化氮檢測試劑盒(S0021)，上海碧云天生物技術有限公司；TurboFectTM體外轉染試劑，Thermo Fisher公司；Trizol試劑、M-MLV 逆轉錄試劑盒，美國 Invitrogen 公司；SYBR GREEN染料，德國 DBI 公司；青霉素、鏈霉素等，北京索萊寶科技有限公司.iNOS/NOS2的小干擾RNA由廣州銳博公司設計并合成(siNOS2 1#GUGCGUUACUCCACCAAC AdTdT；siNOS2 2#CGUGCAAACCUUCAAGGCAdT dT；siNOS2 3#CCAGAAGCGCUAUCACGAAdTdT).MRTF-A敲低質粒shMRTF-A由本實驗室構建[12].

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與轉染

F12培養(yǎng)基添加 10%滅活胎牛血清、100U/mL青霉素和 100μg/mL鏈霉素，細胞置于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

轉染前 1d用 6孔板進行細胞接種，2d時細胞密度約為70%.用TurboFect轉染試劑按說明書步驟轉染 siRNA或 shRNA，使 siRNA的終濃度為100nmol/L，shRNA質粒用量為每孔 4μg.將 6孔板轉移至 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 6h，更換培養(yǎng)基為含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h.

1.2.2 Griess法檢測NO濃度

采用 NO檢測試劑盒，按照說明書推薦步驟操作.首先，用細胞培養(yǎng)液稀釋試劑盒提供的標準品NaNO2，使對應 NO 濃度范圍為 1～100μmol/L.然后，按每孔50μL，在 96孔板中分別加入標準品及樣品.再依次加入等體積的 Griess試劑Ⅰ和Ⅱ，在常溫下反應 10min.將反應后的產物轉移到酶標板內，在酶標儀上檢測 540nm處的吸光度.根據標準曲線計算細胞培養(yǎng)基的NO濃度.

1.2.3 MTT法檢測細胞活性

對數生長期細胞懸浮并計數，取 100μL接種于96孔板，使細胞密度為 2000個/孔.于 CO2培養(yǎng)箱孵育至細胞密度為70%，加入不同濃度SNP，繼續(xù)培養(yǎng) 24h.每孔加入 20μL MTT溶液(5mg/mL)，繼續(xù)孵育 4h.吸去培養(yǎng)液，每孔加入 150μL二甲基亞砜(DMSO)，避光低速振蕩 10min，使結晶物充分溶解.在酶聯(lián)免疫檢測儀測定 490nm處各孔的吸光度，計算細胞活性.

1.2.4 Hoechst法和流式細胞術檢測細胞凋亡

MCF-7細胞加藥處理24h后，用PBS洗3次；每孔加入 1mL 4%多聚甲醛，室溫放置 15min，PBS洗 3次；加適當比例稀釋的 Hoechst，37℃避光孵育1h；PBS洗3次，每次5min；在共聚焦顯微鏡下觀察細胞核形態(tài)并拍照記錄結果.

貼壁生長的細胞經胰酶消化后，用 PBS漂洗吹懸.按PI-Annexin V凋亡檢測試劑盒步驟，加入1×binding buffer，800r/min離心10min；加入500μL binding buffer吹懸細胞，使細胞濃度為105～106mL-1；加入5μL Annexin V-FITC和5～10μL PI染色，輕輕混勻，室溫避光孵育15min；根據設定好的程序使用C6型流式細胞儀(BD公司)進行檢測，并用CFlow Plus軟件分析結果.

1.2.5 細胞劃痕愈合實驗

將細胞按每孔 1×105個細胞接種于 6孔板，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24h后在每孔中央用 10μL吸頭形成劃痕.用 PBS充分洗去漂浮細胞.向各孔細胞中加入含不同濃度的 SNP的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng).劃痕完成后每隔 12h在顯微鏡下觀察劃痕寬度變化情況，拍照并計算細胞遷移率.

1.2.6 Transwell細胞遷移實驗

將狀態(tài)良好的 MCF-7細胞按照每孔約 5×105個細胞鋪在 24孔 Transwell上層小室；下室加含10% FBS的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24h后，用棉簽將上室中未遷移的細胞擦掉，用4%多聚甲醛溶液固定，DAPI染核，通過激光掃描共聚焦顯微鏡拍照并計數上、下、左、右、中 5個視野下的細胞數，計算相對細胞遷移率.

1.2.7 實時熒光定量PCR(Real-time PCR)

4℃條件下用 Trizol裂解細胞，提取總 RNA，進行逆轉錄得到cDNA，隨后進行Real-time PCR.引物序列為 GAPDH 上游 5′-ATTCAACGGCACAGTCA AGG-3′，下游 5′-GCAGAAGGGGCGGAGATGA-3′；MYL9 上游 5′-ATTCAACGGCACAGTCAAGG-3′，下游 5′-GCAGAAGGGGCGGAGATGA-3′；NOS2 上游5′-AGCGGTAACAAAGGAGATAGA-3′，下游 5′-CTT GGTGGCGAAGATGAG-3′；MRTF-A 上游 5′-ACCG TGACCAATAAGAATGC-3′，下游 5′-CCGCTCTGA ATGAGAATGTC-3′；MYH9 上游 5′-AGCGTTACT ACTCAGGGCTCATC-3′，下游 5′-TCATACTCCTGT AGGCGGTGTCT-3′；CYR61 上游 5′-AGGATAGTAT CAAGGACCCC-3′，下游 5′-TCCATTCCAAAAACA GGGAG-3′.Real-time PCR 反應條件：95℃預變性2min，40個循環(huán)，每個循環(huán) 95℃變性 10s，60℃退火 30s，95℃延伸 1min，95℃終止反應 10s，以ΔΔCt法對結果進行計算，GAPDH為內參.

1.2.8 免疫印跡(Western blot)檢測蛋白表達水平

收集處理組及對照組的細胞，加入SDS裂解液，提取細胞總蛋白，進行SDS-PAGE電泳，通過半干電轉移法將蛋白轉移至硝酸纖維素膜.用封閉液室溫封閉1h，分別用MYH9抗體(Santa Cruz)、MYL9抗體(Santa Cruz)、CYR61 抗體(Santa Cruz)、MRTF-A抗體(Proteintech)、GAPDH 抗體(Santa Cruz)孵育，4℃過夜，洗膜后加入相對應的二抗(山羊抗兔熒光二抗、山羊抗鼠熒光二抗)室溫避光孵育 1.5～2h，洗膜3次，用Oddysey成像系統(tǒng)掃膜記錄結果.

1.3 統(tǒng)計學分析

實驗數據使用 SPSS v13.0軟件處理；各組實驗數據以“均值±標準差”表示.組間統(tǒng)計學差異分析采用t檢驗，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01.

2 結果與分析

2.1 不同濃度NO對MCF-7細胞增殖的影響

為了確定 SNP作為細胞外 NO供體的有效性，利用 Griess法檢測加 SNP 24h后培養(yǎng)基中 NO含量，結果如圖 1所示.與未加藥組相比，不同濃度SNP均可以釋放 NO，且 NO含量隨著加入 SNP濃度升高而增加，確定了 SNP作為 NO供體藥物的有效性.

圖1 SNP處理后細胞培養(yǎng)基中NO含量測定Fig. 1 Concentrations of NO in culture medium after SNP treatment

為觀察 SNP對 MCF-7細胞活性的影響，進行MTT實驗，結果如圖 2所示.當 SNP濃度低于0.5mmol/L時，對 MCF-7細胞活性無顯著抑制；但SNP濃度高于 0.5mmol/L時，活細胞數量明顯下降.這表明高濃度NO抑制MCF-7細胞增殖.

圖2 SNP對MCF-7細胞增殖的影響Fig. 2 Effect of SNP on MCF-7 cell proliferation

2.2 高濃度NO對MCF-7細胞凋亡的影響

上述 MTT實驗結果顯示，當 SNP濃度高于0.5mmol/L時細胞活性降低.在實驗中觀察到高濃度SNP處理導致細胞漂浮，提示發(fā)生了細胞凋亡.為了證明這一猜測，首先，通過流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況，結果如圖 3所示，用 1mmol/L或 2mmol/L SNP處理24h后，凋亡細胞比率明顯升高，且與SNP濃度正相關，表明高濃度NO誘導MCF-7細胞凋亡.

為了進一步確定SNP誘導MCF-7細胞凋亡，采用Hoechst染色觀察高濃度SNP對細胞核形態(tài)的影響，結果如圖4所示.

圖3 高濃度SNP對MCF-7細胞凋亡的影響Fig. 3 High concentration SNP inducing the apoptosis of MCF7 cells

圖4 Hoechst染色觀察細胞核內DNA聚集狀態(tài)Fig. 4 DNA aggregation visualized with Hoechst staining

用 1mmol/L或 2mmol/L SNP處理后，MCF-7細胞核明顯皺縮，DNA在核膜下聚集并出現“冒狀”結構，提示細胞凋亡發(fā)生.Hoechst染色結果和 PIAnnexin V檢測結果一致，證實NO供體SNP濃度高于0.5mmol/L時誘導乳腺癌MCF-7細胞凋亡.

2.3 低濃度NO對MCF-7細胞遷移的影響

圖 2—圖 4的結果證明：SNP濃度高于0.5mmol/L時具有細胞毒性，誘導細胞凋亡.為觀察NO對 MCF-7細胞遷移能力的影響，選擇低濃度SNP處理細胞.首先，進行了劃痕愈合實驗.結果顯示：與對照組相比，當加入的 SNP濃度低于0.5mmol/L時，SNP促進乳腺癌細胞系 MCF-7的遷移(圖5).

圖5 劃痕實驗觀察SNP對MCF-7遷移的影響Fig. 5 Wound-healing assay of SNP-treated MCF-7 cells

為了進一步證明此結果，則進行 Transwell實驗，結果如圖6所示.SNP濃度為0.25mmol/L時可以明顯促進 MCF-7細胞的遷移，細胞遷移率增加至3倍左右，與劃痕實驗結果一致.以上結果證明 SNP對乳腺癌細胞MCF-7的影響取決于SNP濃度，提示低濃度NO促進MCF-7細胞遷移.

圖6 Transwell實驗觀察SNP對MCF-7遷移的影響Fig. 6 Transwell assay of SNP-treated MCF-7 cells

2.4 低濃度NO對遷移相關基因表達的影響

為了探究低濃度NO影響MCF-7細胞遷移的分子機制，用 0.1mmol/L或 0.25mmol/L SNP處理細胞，提取RNA，利用Real-time PCR方法檢測遷移相關基因MYH9、MYL9和CYR61的mRNA水平，結果如圖7所示.

圖7 SNP促進細胞遷移相關基因mRNA表達Fig. 7 SNP stimulated the expression of migration-related genes in MCF-7 cells

SNP增強了遷移標志基因的表達.結合圖 5和圖6所示的細胞遷移率的變化可以推測，低濃度NO可能是通過上調細胞內遷移相關基因表達促進MCF-7的遷移.

2.5 NO清除劑對遷移相關基因表達的影響

血紅蛋白(Hemoglobin，HB)是一種常用的 NO清除劑.為了證明 SNP通過產生 NO影響細胞遷移能力，用HB預處理細胞 1h后再加0.25mmol/L的SNP 繼續(xù)處理 24h，分別檢測 mRNA和蛋白表達水平.結果如圖 8所示，0.25mmol/L SNP 促進遷移相關基因表達(比較第2組與第1組)，但HB處理后，SNP不再促進遷移相關基因表達(比較第3組與第1組)，因此推測SNP通過釋放NO上調細胞遷移相關基因表達.

圖8HB消減 SNP對遷移相關基因 mRNA表達的上調作用Fig. 8 Effect of HB on SNP-induced upregulation of migration-related genes

前期研究證明 MYH-9、MYL-9和 CYR61基因表達受轉錄輔助因子 MRTF-A調控[9].本實驗也檢測了 MRTF-A表達水平，發(fā)現 0.25mmol/L的 SNP促進 MRTF-A表達(圖 8).此結果提示 MRTF-A可能介導了 NO對遷移相關基因 MYH-9、MYL-9和CYR61表達的促進作用.

2.6 敲低 NOS2對 MRTF-A及其調控的遷移相關基因表達的影響

乳腺癌細胞內源性 NO的產生主要由誘導型一氧化氮合酶，即 iNOS/NOS2催化.為了證明細胞內源性NO在乳腺癌轉移中的作用，本研究利用siRNA敲低 iNOS/NOS2，檢測 MRTF-A及其下游遷移相關基因的表達變化.首先，檢測 siRNA工作效率，結果如圖 9(a)所示，NOS2的 3個 siRNA序列的敲低效率分別在 45%～65%.選取敲低效率最高的 1#序列用于后續(xù)實驗.在此條件下，MRTF-A及其靶基因的mRNA 表達水平不同程度下降(圖 9(b))，說明乳腺癌細胞內源性 NO對遷移相關基因表達發(fā)揮促進作用.

圖9 敲低NOS2對遷移相關基因mRNA表達的影響Fig. 9 Effects of NOS2 knockdown on the mRNA expression of migration-related genes

2.7 敲低MRTF-A對NO誘導遷移相關基因表達的影響

MRTF-A 是遷移相關基因 MYH9、MYL-9和CYR61表達的重要調控因子，而且外源性和內源性NO均誘導 MRTF-A表達(圖 8和圖 9).為了驗證NO對遷移相關基因表達的影響是否與 MRTF-A有關，利用 shRNA質粒敲低 MRTF-A，再加入0.25mmol/L SNP處理 12h，檢測遷移相關基因表達的變化，結果如圖10所示.

轉染 shMRTF-A質粒導致 MRTF-A的 mRNA水平下降約 70%(圖 10(a))，蛋白水平也顯著下降(圖 10(c))；轉染 shMRTF-A 同時加 0.25mmol/L SNP處理后，與對照組相比，MRTF-A的 mRNA水平無明顯下降((圖 10(a))，蛋白水平無明顯變化((圖 10(c))，提示 shMRTF-A 抵消 SNP對 MRTF-A表達的促進作用.

同樣條件下檢測遷移相關基因表達(圖 10(b)和(c))，結果顯示：敲低 MRTF-A，MYH9、MYL-9和CYR61的mRNA水平和蛋白水平均下降；加SNP共處理組，與對照組相比，MYH9、MYL-9和CYR61的mRNA和蛋白水平均無明顯變化.此結果說明：MRTF-A表達水平低時，遷移相關基因表達下降；而在 shMRTF-A和 0.25mmol/L SNP共處理細胞中，MRTF-A蛋白水平不變，此時，SNP不能誘導MYH9、MYL9和CYR61表達，證明MRTF-A對NO促進遷移相關基因表達非常重要.

圖10 敲低MRTF-A同時加SNP對遷移相關基因表達的影響Fig. 10 Effects of shMRTF-A and SNP co-treatment on the expression of migration-related genes

3 討 論

一氧化氮是重要的生物活性分子，在生理和病理條件下都有重要作用.在乳腺癌細胞中，內源性 NO主要由iNOS催化產生.由于iNOS在腫瘤細胞中高表達，而且 iNOS表達水平與乳腺癌臨床分期相關，在惡性度高的組織中，iNOS表達水平高[10-11]，所以一般認為NO是促進癌細胞增殖和轉移、促進腫瘤血管增生的促癌因子，使iNOS成為乳腺癌治療的靶分子[12-16].但是，也有研究[11,17]表明 NO對腫瘤的影響取決于NO的濃度和腫瘤微環(huán)境，高濃度NO誘導腫瘤細胞凋亡，低濃度 NO促進腫瘤細胞轉移.本研究結果也證實了這一現象.關于低濃度NO促進癌細胞轉移的分子機制頗為復雜，目前有幾種學說：(1)NO激活腫瘤細胞內多個信號途徑，如PI3K/PKB信號途徑、MAPK信號途徑、EGFR信號途徑等促進腫瘤細胞發(fā)生上皮-間質表型轉化，增強腫瘤細胞轉移能力；(2)NO增強缺氧誘導因子HIF蛋白穩(wěn)定性，促進腫瘤組織血管形成；(3)NO調節(jié)細胞外基質金屬蛋白酶活性，改變腫瘤微環(huán)境，促進腫瘤侵襲和轉移；(4)調節(jié)腫瘤細胞代謝[16,18].基于低濃度 NO在腫瘤發(fā)病中的作用，iNOS被認為是乳腺癌治療的靶分子[19].

本課題組前期研究證明轉錄輔助因子 MRTF-A調控的遷移相關基因表達在乳腺癌轉移中發(fā)揮重要作用[11].為探索 MRTF-A在 NO誘導乳腺癌轉移中的作用，檢測了 NO對轉錄調控因子 MRTF-A及其下游的遷移標志基因 MYH9、MYL9和 CYR61表達的影響，發(fā)現低濃度 NO促進 MRTF-A及其下游靶基因的表達，而NO對這些基因表達的促進作用依賴于 MRTF-A的存在.此結果提示利用 siRNA敲低MRTF-A表達水平或用小分子化合物抑制 MRTF-A活性可能對iNOS高表達的乳腺癌轉移有抑制作用.

浸潤性生長和遠距離轉移是包括乳腺癌在內惡性腫瘤的病理特征，也是惡性腫瘤致死的主要原因.探究在乳腺癌轉移的分子機制對于乳腺癌的預防和治療具有重要意義.本研究主要在細胞水平和分子水平初步探索了MRTF-A在NO誘導乳腺癌轉移中的作用，下一步將進行更深入的分子機制研究和動物水平研究，以期為乳腺癌治療提供新的思路.