游 航，唐 華，唐 華

隨著我國(guó)工業(yè)化與城市化水平快速發(fā)展，霧霾已成為我國(guó)面臨的一大難題。 暴露于過(guò)量的顆粒物(particulate matter，PM)中可增加罹患各種疾病的風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致死亡率上升[1]。 短期內(nèi)大量接觸PM 會(huì)提高因呼吸系統(tǒng)疾病而住院的風(fēng)險(xiǎn)。 2 d 內(nèi)PM 的平均濃度升高10 μg/m3將會(huì)增加2.07%的呼吸系統(tǒng)相關(guān)疾病住院率[2]。 相反，當(dāng)PM 平均濃度降低10 μg/m3時(shí)，平均壽命將會(huì)增加0.35年[3]。 PM 中導(dǎo)致肺組織損傷的主要成分是空氣動(dòng)力學(xué)直徑≤2.5 μm 的細(xì)顆粒物(PM2.5)。 目前已有許多研究探討PM2.5 對(duì)肺組織損傷的機(jī)制，伍曉麗等[4]發(fā)現(xiàn)PM2.5 引起肺組織損傷的機(jī)制主要是誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。 PM2.5 中的Mn、Zn、Pb 等金屬成分可引起肺上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激，大量產(chǎn)生并釋放脂質(zhì)過(guò)氧化物，而超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)則顯著降低[5-6]。 PM2.5 上附著的多種病原體導(dǎo)致肺組織產(chǎn)生炎癥并顯著提高肺組織中乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的濃度[7]。 殼低聚糖也稱(chēng)殼寡糖，是殼聚糖經(jīng)過(guò)特殊處理降解得到的聚合度為2～10 的氨基葡萄糖低聚物[8]。 由于殼低聚糖糖鏈短，所以具有溶解性好和生理?xiàng)l件下粘度低的特點(diǎn)。 殼低聚糖具有抑菌、抗氧化應(yīng)激、抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，也可以促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)和傷口愈合[9]。 本研究主要探討殼低聚糖對(duì)PM2.5 暴露下急性肺損傷(acute lung injury，ALI)的干預(yù)作用，為治療PM2.5 所致ALI 的臨床用藥提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、材料與儀器

1.1.1 動(dòng)物 選用(30±2)g 雄性昆明種小鼠。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)自西南醫(yī)科大學(xué)SPF 級(jí)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào):SYXK(川)2018-065。

1.1.2 材料與試劑 殼低聚糖(脫乙酰度＞90%，分子量＜3000)購(gòu)自山東奧康生物科技有限公司；總蛋白(TP)檢測(cè)試劑盒、LDH、TNF-α ELISA 試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；蛋白酶抑制劑購(gòu)自上海羅氏制藥有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備 低速離心機(jī)(TDZ6B-WS，上海盧湘儀離心機(jī)有限公司)；超聲波清洗器(KB-250B，40 kHz，250 W，昆山舒美超聲儀器有限公司)；K-C120H 型智能中流量采樣器(青島宜蘭環(huán)保股份有限公司)；濾膜(d＝0.15 μm，上海興亞凈化材料廠)。

1.2 方法

1.2.1 PM2.5 樣品采集和懸液制備 顆粒物采樣點(diǎn)在西南醫(yī)科大學(xué)圖書(shū)館樓頂，采集時(shí)間2018年12 月，連續(xù)采集1 個(gè)月。 無(wú)菌條件下將濾膜切至1 cm×3 cm 小片，浸泡在蒸餾水中，超聲波震蕩3 次，每次20 min，充分洗脫顆粒物。 含顆粒物液體經(jīng)8層無(wú)菌紗布過(guò)濾，以轉(zhuǎn)速12000 r/min，離心20 min。離心后的沉淀物經(jīng)真空冷凍干燥后在-20 ℃保存。將顆粒物溶解于生理鹽水，制成10 mg/mL 的PM2.5 混懸液，4 ℃保存。

1.2.2 小鼠分組與造模 健康雄性昆明種小鼠30只，隨機(jī)分為5組，每組6 只，即空白對(duì)照組、ALI組、低劑量治療組、中劑量治療組及高劑量治療組。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，以10 mg/mL PM2.5 懸液進(jìn)行氣管滴注。 空白對(duì)照組用等量生理鹽水代替，1 /d，連續(xù)3 d。

1.2.3 小鼠給藥 末次染毒24 h 后，低、中、高劑量治療組參考Liu 等[10]和郭劍平等[11]的方法，分別用濃度為10、20 和40 mg/mL 的殼低聚糖溶液灌胃，1 /d，連續(xù)10 d，空白對(duì)照組和ALI組用等量生理鹽水代替。 最后一次灌胃24 h 后處死所有小鼠。

1.3 標(biāo)本采集和指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1 肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF) 用4 ℃預(yù)冷的無(wú)菌生理鹽水對(duì)左肺進(jìn)行肺泡灌洗，每次0.6 mL，共3 次；全部收集后離心(3000 r/min，10 min)，取上清液檢測(cè)LDH，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.3.2 肺組織勻漿 取右肺0.3 g，在冰浴中，用組織剪剪碎后加入9 倍體積預(yù)冷生理鹽水，再加入1體積的酶抑制劑，研磨制成勻漿，離心(3500 r/min，10 min)，取上清液檢測(cè)LDH 和TNF-α，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.3.3 心臟血清 取血1 mL，在室溫下靜置30 min 后離心(3000 r/min，10 min)，取上清液，檢測(cè)SOD，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.3.4 肺組織病理切片 取余下右肺組織，用20倍體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的甲醛溶液固定，48 h 后送至西南醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科制作病理學(xué)切片和HE 染色，觀察肺組織形態(tài)學(xué)變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0 和Graph Pad 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間比較使用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理切片形態(tài)學(xué)觀察 對(duì)照組肺泡結(jié)構(gòu)完整，大小分布均勻，肺泡間隔無(wú)增厚，肺泡腔無(wú)炎性滲出(圖1A)。 ALI組未見(jiàn)完整肺泡結(jié)構(gòu)，分布紊亂，肺泡間隔明顯增厚，肺泡腔內(nèi)有炎性滲出物伴有大量中性粒細(xì)胞炎性浸潤(rùn)(圖1B)。 ALI組可見(jiàn)PM2.5 分散顆粒物沉積于氣管灌注后的肺泡區(qū)，被肺巨噬細(xì)胞吞噬，表明PM2.5 可以到達(dá)肺泡區(qū)(圖1C)。 低劑量治療組肺泡大部分融合，但可見(jiàn)部分正常肺泡結(jié)構(gòu)，肺泡間隔增厚減輕，肺泡腔內(nèi)炎性滲出減少(圖1D)。 中劑量治療組大部分的肺泡結(jié)構(gòu)完整，分布較均勻，間隔增厚明顯減輕，肺泡腔內(nèi)滲出物少，伴輕微中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1E)。 高劑量治療組正常肺泡結(jié)構(gòu)少，多數(shù)肺泡融合，肺泡炎性滲出和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)減輕(圖1F)。 結(jié)果表明，殼低聚糖能明顯改善PM2.5 所致的肺損傷。 其中中劑量治療組效果相較于其他兩個(gè)治療組效果更好。

2.2 殼低聚糖對(duì)PM2.5 暴露下肺組織中LDH、TNF-α 和血清中SOD 活性的影響 與空白對(duì)照組比較，ALI組BALF 和肺組織勻漿中LDH 活性均顯著增高(P＜0.01)，TNF-α 含量也明顯升高(P＜0.01)，同時(shí)SOD 活性顯著降低(P＜0.01)。 與ALI組比較，低、中、高劑量治療組LDH 活性(BALF)分別降低8.68 U/gprot、10.51 U/gprot、8.70 U/gprot(P＜0.01)；LDH 活性(肺組織勻漿)分別降低59.56 U/g、79.53 U/g、47.20 U/g(P＜0.01)；TNF-α 含量分別降低111.70 pg/mL、222.60 pg/mL、116.60 pg/mL(P＜0.01)；SOD 活性分別升高36.52 U/mL、32.50 U/mL、19.52 U/mL(P＜0.01)。 各治療組間比較，中劑量治療組BALF 以及肺組織勻漿中LDH活性和TNF-α 含量降低更明顯(P＜0.01)；低劑量治療組SOD 活性升高更顯著(P＜0.05)，圖2。

圖1 肺組織病理學(xué)改變(×200 倍)

圖2 各組肺組織中LDH、TNF-α 和血清中SOD 活性測(cè)定結(jié)果

3 討論

有研究表明，PM2.5 造成ALI 的機(jī)制主要包括氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[12]。 TNF-α 是公認(rèn)的促炎細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生早且作用顯著，它通過(guò)激活NF-κB 傳導(dǎo)通路，誘導(dǎo)IL-1B、IL-6 等多種炎性細(xì)胞因子釋放，加快炎癥反應(yīng)進(jìn)程，增加趨化因子的表達(dá)，呈現(xiàn)出級(jí)聯(lián)瀑布效應(yīng)[13]，進(jìn)而造成組織細(xì)胞損傷[14]。 LDH 是一種胞質(zhì)酶，在質(zhì)膜損傷時(shí)大量釋放[15]。 臨床上常通過(guò)檢測(cè)LDH 活性水平來(lái)輔助診斷組織器官損傷[16]。 SOD 是體內(nèi)重要的抗氧化因子，其水平的提高被視為清除自由基的重要細(xì)胞防御機(jī)制[17]。 殼低聚糖糖鏈較短，分子量小，所以具有溶解性好，生理?xiàng)l件下粘度低的特點(diǎn)。 Zhang等[18]發(fā)現(xiàn)，殼低聚糖能有效地清除羥基自由基和超氧自由基。 Gai 等[19]發(fā)現(xiàn)在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中，一定劑量的殼低聚糖不僅能抵抗過(guò)氧化氫的強(qiáng)氧化，而且能增加SOD 和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的含量，從而抑制過(guò)氧化氫等氧化物誘導(dǎo)的活性氧生成。Chen 等[20]發(fā)現(xiàn)殼低聚糖能增強(qiáng)靜息中性粒細(xì)胞的活性，抑制中性粒細(xì)胞的過(guò)度活化，以保護(hù)身體免受急性炎癥。 本研究旨在驗(yàn)證服用殼低聚糖可以減輕PM2.5 所致ALI 的假設(shè)。 殼低聚糖對(duì)PM2.5 暴露下肺組織中LDH、TNF-α 和血清中SOD 活性的變化及肺組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果表明:殼低聚糖可以通過(guò)降低肺組織中LDH 活性和TNF-α 水平，來(lái)減輕PM2.5 對(duì)肺組織的炎性損傷；還可以通過(guò)升高抗氧化因子SOD 的活性來(lái)減輕PM2.5 引起的氧化應(yīng)激損傷。 另外，結(jié)果顯示，肺組織勻漿和BALF 中的LDH 活性以及TNF-α 含量均在中劑量治療組中降低最為顯著，這與肺組織病理形態(tài)學(xué)改變結(jié)果一致。而肺組織勻漿中SOD 活性卻在低劑量治療組中增高最明顯。 對(duì)于造成這種不同趨勢(shì)的原因，本研究推測(cè):①殼低聚糖對(duì)PM2.5 暴露下肺損傷的保護(hù)作用可能主要通過(guò)抗炎癥反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)；②殼低聚糖對(duì)PM2.5 暴露下肺損傷的保護(hù)作用機(jī)制隨濃度不同而存在差異，即在低濃度時(shí)，可能主要通過(guò)抗氧化應(yīng)激，而在較高濃度時(shí)，則主要通過(guò)抗炎性損傷。 Timmerman 等[21]發(fā)現(xiàn)BALF 中炎癥細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)可定量反映肺炎癥反應(yīng)，通過(guò)檢測(cè)各組BALF 中的炎癥細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)可進(jìn)一步驗(yàn)證本研究結(jié)果。

綜上所述，本研究結(jié)果初步表明殼低聚糖可通過(guò)降低炎性損傷和抗氧化應(yīng)激減輕PM2.5 所致的肺損傷，且保護(hù)作用與給藥劑量存在一定的量效關(guān)系。 相關(guān)作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究證實(shí)。