師帥 欒凱迪 李虹霖 王玉玨 夏昆鵬 張金朋 馬祺昊 孫琦月 佟曉薇 韓盛旺

摘要 目的：觀察頭穴圍刺對(duì)缺血再灌注大鼠血管生成素-2（Ang2）和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）表達(dá)的影響。方法：選取30只健康雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和圍刺組，參照Z(yǔ)ea-Longa報(bào)道的線(xiàn)栓法制備大鼠腦缺血再灌注模型，圍刺組給予頭穴圍刺治療，3組分別于21 d取大鼠腦組織，采用HE染色觀察大鼠腦組織缺血結(jié)構(gòu)的變化;免疫組織化學(xué)觀察大鼠腦缺血陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)情況;采用Western檢測(cè)Ang-2、VEGF蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：針刺21 d后mNSS評(píng)分圍刺評(píng)分優(yōu)于模型組;與模型組比較，大鼠腦組織病理細(xì)胞數(shù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;針刺21 d后與模型組比較，大鼠腦組織缺血區(qū)域Ang-2、VEGF陽(yáng)性表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;針刺21 d后與模型組比較，大鼠腦組織Ang-2、VEGF蛋白增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：頭穴圍刺可上調(diào)大鼠缺血再灌注區(qū)腦組織Ang-2、VEGF蛋白的表達(dá)，促進(jìn)梗死區(qū)血管新生，幫助腦缺血再灌注損傷后的腦神經(jīng)修復(fù)，降低神經(jīng)功能缺損程度。

關(guān)鍵詞 頭穴圍刺;腦缺血再灌注;神經(jīng)功能缺損;促血管生成素-2;血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子;腦神經(jīng)修復(fù);血管新生

Effects of Scalp Acupoint Encircling Needling on the Expression of Ang-2 and VEGF in Brain Tissue of Rats with Ischemia-Reperfusion Injury

SHI Shuai1，2，LUAN Kaidi1，LI Honglin1，2，WANG Yujue1，2，XIA Kunpeng1，2，ZHANG Jinpeng1，2，Ma Qihao1，SUN Qiyue 1，TONG Xiaowei1，HAN Shengwang1，2

（1 The Second Affiliated Hospital of Heilongjiang University Of Chinese Medicine，Heilongjiang，Harbin 150001，China; 2 Heilongjiang University Of Chinese Medicine，Harbin 150000，China）

Abstract Objective：To observe the effects of scalp acupoint encircling needling on the expression of Ang-2 and VEGF in rats with ischemia-reperfusion injury.Methods：A total of 30 healthy male Wistar rats were randomly divided into a sham operation group，a model group and an encircling needling group，with 10 rats in each group.Rat cerebral ischemia-reperfusion model was prepared by thread embolization method reported by Zea-Longa.The encircling needling group was given scalp point encircling needling.The brain tissues of each group were taken from 21 days in 3 groups，and the changes of cerebral ischemic structure were observed by HE staining.Immunohistochemistry was used to observe the expression of positive cells in cerebral ischemia in rats，and Western Blot was used to detect the expression of Ang-2 and VEGF.Results：1）21 days later，the mNSS score and encircling needling were better than the model group.2）HE staining：Compared with the model group，the number of pathological cells in rat brain tissue decreased（P<0.05）.3）After 21 days of acupuncture，compared with the model group，the positive expression of Ang-2 and vascular endothelial growth factor in the ischemic area of rat brain tissue was significantly increased after immunohistochemical treatment（P<0.01）.4）Compared with the model group，the number of Ang-2 and vascular endothelial growth factor protein in the brain tissue of rats increased 21 days after acupuncture（P<0.01）.Conclusion：Scalp acupoint encircling needling can up-regulate the expression of Ang-2 and VEGF protein in brain tissue of rats with cerebral ischemia-reperfusion injury，promote angiogenesis in infarcted area，help the repair of brain nerve after cerebral ischemia-reperfusion injury，and reduce the degree of neurological deficit.

Western檢測(cè)：大鼠斷頭取腦，將組織勻漿裂解，離心去沉淀，取上層清液。按照BCA試劑盒要求測(cè)量蛋白質(zhì)濃度，取等濃度等體積上樣變性蛋白，SDS-PAGE（10%）電泳2 h以后，半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）上，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h，一抗孵育過(guò)夜，VEGF（1∶1 000稀釋?zhuān)?，Ang-2（1∶500），溫度保持4 ℃，TBST清洗膜5次×5 min，加入二抗（1∶8 000稀釋?zhuān)┦覝胤跤? h，TBST清洗5次×5 min，用ECL顯色，于數(shù)字成像系統(tǒng)下顯影，采用Image J檢測(cè)條帶密度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，在對(duì)比實(shí)驗(yàn)中涉及到2個(gè)數(shù)據(jù)集之間的數(shù)據(jù)，使用2個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)的，方差不齊時(shí)采用近似t檢驗(yàn)，陽(yáng)性率之間的比較采用卡方檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能障礙評(píng)分比較

針刺干預(yù)21 d后，與模型組比較，針刺組神經(jīng)功能卻訊評(píng)分明顯變小，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 HE染色結(jié)果

假手術(shù)組：大鼠大腦神經(jīng)細(xì)胞排列趨勢(shì)緊密，神經(jīng)元形態(tài)規(guī)則，無(wú)組織水腫現(xiàn)象，散見(jiàn)少量的凋亡小體和炎性細(xì)胞，血管無(wú)充血。模型組：大鼠大腦神經(jīng)細(xì)胞排列趨勢(shì)稀疏且紊亂，神經(jīng)元形態(tài)不甚規(guī)則，細(xì)胞數(shù)量顯著增加，可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞和凋亡小體，毛細(xì)血管腫脹。針刺組：大鼠大腦病理改變較模型組有明顯好轉(zhuǎn)。大鼠大腦神經(jīng)細(xì)胞排布更加規(guī)則、分布趨勢(shì)相對(duì)緊密，神經(jīng)元細(xì)胞核固縮數(shù)目及炎性細(xì)胞數(shù)目顯著增加，毛細(xì)血管腫脹情況也有所改善。見(jiàn)圖1。

2.3 各組免疫組織化學(xué)結(jié)果比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠Ang-2、VEGF陽(yáng)性表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）提示腦缺血后會(huì)誘導(dǎo)血管新生;與模型組比較，針刺組Ang-2、VEGF陽(yáng)性表達(dá)顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。提示在頭穴圍刺治療下血管新生明顯增多，且針刺組較模型組腦組織致密。見(jiàn)表2、圖2，3。

2.4 各組Western檢測(cè)結(jié)果

圖4從左至右灰度逐漸加深，說(shuō)明大鼠腦損傷后，Ang-2、VEGF蛋白表達(dá)逐漸增加，而針刺介入后，Ang-2、VEGF蛋白表達(dá)增加更明顯。由此表明頭穴圍刺可明顯上調(diào)Ang-2、VEGF蛋白的表達(dá)，促進(jìn)大鼠腦組織缺血半暗帶血管新生。

3 討論

腦缺血的治療中針灸作為一種臨床中廣泛應(yīng)用的治療手段取得了良好的療效，并廣泛受到學(xué)者的重視。頭穴圍刺療法屬于一種特殊針?lè)?，它基于腦梗死區(qū)在大腦皮質(zhì)的投影區(qū)域通過(guò)腧穴治療作用的“近治作用”，以達(dá)到改善腦缺血的目的，其理論來(lái)自于《靈樞·官針》篇的楊刺，取其用4根針圍剿病灶集中治療的理論基礎(chǔ)。圍刺也是通過(guò)多根針刺圍剿病灶以產(chǎn)生“針場(chǎng)效應(yīng)”來(lái)調(diào)整大腦皮質(zhì)功能，對(duì)于病灶集中圍刺以期在短時(shí)間內(nèi)縮小病灶減輕病損程度治療腦及神志相關(guān)性疾病。我們?cè)谠缙谘芯恐幸炎C實(shí)頭穴圍刺不僅能夠減低腦梗死大鼠神經(jīng)功能缺損程度，還能上調(diào)內(nèi)源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子，起到保護(hù)腦神經(jīng)的作用。因此，本實(shí)驗(yàn)采用頭穴圍刺療法對(duì)腦缺血再灌注大鼠模型進(jìn)行干預(yù)，觀察其對(duì)血管生成因子及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的影響，進(jìn)一步探討頭穴圍刺法促進(jìn)梗死區(qū)血管新生，改善梗死區(qū)血液供應(yīng)，促進(jìn)缺血半暗帶組織恢復(fù)，幫助代償梗死核心區(qū)循環(huán)功能，幫助快速建立有效血液循環(huán)，進(jìn)而幫助受損的神經(jīng)功能快速回復(fù)，最大化降低后遺癥狀。

血管與神經(jīng)既各司其職又相輔相成，血管輸送具有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的血液以營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)，神經(jīng)在神經(jīng)元神經(jīng)細(xì)胞的作用下又對(duì)血管起到調(diào)節(jié)的功能，因此，二者關(guān)系緊密。梗死區(qū)血管堵塞，周?chē)艹霈F(xiàn)系列炎性反映導(dǎo)致梗死中心及周?chē)軤顟B(tài)不佳，血液流通不暢，無(wú)法營(yíng)養(yǎng)周?chē)纳窠?jīng)細(xì)胞，進(jìn)而出現(xiàn)了腦組織的壞死。腦梗死的梗死灶周?chē)嬖诎肴毖獏^(qū)，我們稱(chēng)之為半暗帶，這些微血管密度與腦中風(fēng)患者的生存時(shí)間有密切關(guān)系，及時(shí)搶救半暗帶，開(kāi)放側(cè)支循環(huán)已成為治療腦梗死的必要環(huán)節(jié)。因此，誘導(dǎo)有效血管再生對(duì)于治療腦梗死是一種有前景的方法[8]。VEGF是一種通過(guò)內(nèi)皮組織細(xì)胞可以特異的有絲分裂原，目前被認(rèn)為是特異性最高、作用最強(qiáng)的促血管新生因子，它既可以使血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖又可以促進(jìn)形成新的血管，還可以改善已受損的神經(jīng)細(xì)胞成活狀態(tài)，營(yíng)養(yǎng)并保護(hù)部分神經(jīng)，促使血管和神經(jīng)重塑，對(duì)腦梗死的恢復(fù)及預(yù)后發(fā)揮著重要作用[9-11]。

新生血管由很多細(xì)胞因子共同作用形成，血管生成素（ANG）就是血管新生家庭細(xì)胞因子重要組成部分[12-14]，而Ang-2就是Ang家族中的非常重要一員，它能夠調(diào)節(jié)血管收縮和痙攣，位于血管內(nèi)皮的表面，是血管新生后管腔調(diào)節(jié)的重要因子。梗死后血管收縮和調(diào)節(jié)直接影響梗死周?chē)┭h(huán)境，因此Ang-2可以改善腦梗死區(qū)供血狀態(tài)[15-16]，研究表明，Ang-2對(duì)VEGF互相影響互相促進(jìn)，二者具有協(xié)同作用，對(duì)腦梗死受損后的組織有促進(jìn)血管新生的作用。

本研究表明，頭穴圍刺治療21 d后大鼠梗死區(qū)組織形態(tài)較前致密，神經(jīng)細(xì)胞排列均勻組織形態(tài)完整，血管密度較前增加，管腔較前完整。VEGF和Ang-2的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及蛋白表達(dá)均明顯上升[17]。說(shuō)明頭穴圍刺可以有效的促進(jìn)梗死區(qū)血管新生，并且建立有效的血液供應(yīng)，幫助損傷的腦組織恢復(fù)。

綜上所述，頭穴圍刺可通過(guò)上調(diào)VEGF和Ang-2表達(dá)，促進(jìn)缺血腦組織血管新生，提升新生血管有效功能，重構(gòu)梗死區(qū)及缺血半暗帶區(qū)微循環(huán)系統(tǒng)，減輕大鼠腦部梗死面積，降低大鼠神經(jīng)功能損傷程度，為研究臨床治療腦梗死的機(jī)制提供一種新的的思路。但是本研究尚存不足，頭穴圍刺在梗死區(qū)重新建立起的血液循環(huán)及新生血管是否均為有效血管均能提供有效血供，尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行量化證明。

參考文獻(xiàn)

[1]趙旭.前列地爾治療急性腦梗死患者的療效及其對(duì)超敏C反應(yīng)蛋白和纖維蛋白原水平的影響[J].中國(guó)藥物經(jīng)濟(jì)學(xué)，2018，13（2）：45-47.

[2]師帥，李雪巖，李元，等.頭穴圍刺治療腦出血顱骨摘除術(shù)后康復(fù)期患者60例臨床觀察[J].中國(guó)中醫(yī)藥科技，2015，22（4）：453-454.

[3]肖云，彭?yè)碥?電針對(duì)急性期腦梗死患者血清HIF-1α、VEGF水平的影響[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，34（2）：128-131.

[4]賴(lài)天寶.VEGF基因轉(zhuǎn)染MSCs移植對(duì)腦梗死大鼠模型的治療作用及機(jī)制研究[D].武漢：華中科技大學(xué)，2012.

[5]韓暉，王永剛，劉尚瑩.Ang-2和VEGF在腎細(xì)胞癌患者外周血中的表達(dá)及其意義[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2017，14（27）：110-112.

[6]朱宏.頭部圍刺法對(duì)腦出血吸收率影響及肢體功能障礙的臨床研究[D].哈爾濱：黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，2015.

[7]華興邦，李辭蓉，周浩良，等.大鼠穴位圖譜的研制[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，1991，5（1）：1-5.

[8]賴(lài)天寶.VEGF基因轉(zhuǎn)染MSCs移植對(duì)腦梗死大鼠模型的治療作用及機(jī)制研究[D].武漢：華中科技大學(xué)，2012.

[9]明華偉，何蕓，夏德林，等.VEGF 165基因轉(zhuǎn)染HUVEC促進(jìn)大鼠血管生成的實(shí)驗(yàn)研究[J].口腔頜面外科雜志，2017，27（3）：161-165.

[10]王智丹，霍媛，馬逸超，等.血管生成素2及CD105在急性心肌梗死大鼠中的表達(dá)及與梗死面積的關(guān)系探討[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2019，17（12）：1800-1803.

[11]魏芳.急性腦梗死患者血清IF-1α VEGF水平變化及臨床意義[J].浙江臨床醫(yī)學(xué)，2016，18（3）：445-447.

[12]陳文璐，吳小三，馬曉媛，等.血管生成素與動(dòng)脈粥樣硬化關(guān)系的研究進(jìn)展[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志，2014，43（4）：495-497.

[13]宋宜生，吳小三，王聰霞，等.血管生成素、基質(zhì)金屬蛋白酶-2在冠心病中的表達(dá)及相關(guān)性研究[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志，2014，43（3）：275-278.

[14]韓毛仁麗，陳麗，秦盼盼.加味防己黃芪湯對(duì)原發(fā)性腎病綜合征微炎狀態(tài)及血管生成素樣蛋白3的影響[J].世界中醫(yī)藥，2018，13（3）：624-627，631.

[15]楊廷海，張洪偉，殷建保，等.腦心通膠囊聯(lián)合尿激酶溶栓治療急性腦梗死的臨床療效及其對(duì)血清中VEGF、Ang-2的影響[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2017，12（10）：1405-1407.

[16]鄒文衛(wèi)，翟正平，趙連東，等.荷丹片聯(lián)合依達(dá)拉奉治療急性腦梗死的臨床效果及對(duì)血清IFN-γy，Ang-2，Hcy水平的影響[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2017，17（23）：4502-4505，4528.

[17]Xu X，Yan Y，Xun Q，et al.Combined silencing of VEGF-A and angiopoietin-2，a more effective way to inhibit the Ishikawa endometrial cancer cell line[J].On co Targets Ther，2019，12：1215-1223.