宋志姣，陳容，李鵬浩，謝雯穎，任麗梅，馬前濤，李悅

(保山學(xué)院 資源環(huán)境學(xué)院，云南 保山，678000)

紅泡刺藤(Rubusniveus)是薔薇科(Rosaceae)懸鉤子屬(Rubus)植物[1]，因其果實營養(yǎng)豐富被認為是極具開發(fā)潛力的植物[2-3]。懸鉤子屬植物果實為聚合果，是世界糧農(nóng)組織(Food and Agriculture Organization if the United Nations,FAO)向全世界推薦的“第三代水果”[4-5]，是目前發(fā)展最快的小漿果類果樹[6]。我國懸鉤子屬育種工作起步較晚，育成品種極少，與豐富的懸鉤子屬植物資源(201種98變種)形成鮮明對比[7]。而國外引進品種僅能在與原產(chǎn)地氣候相似的少數(shù)地區(qū)種植，加之懸鉤子屬植物果實采摘期短、保存時間不長，這些問題嚴重阻礙了我國懸鉤子產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和農(nóng)民增產(chǎn)增收。國內(nèi)優(yōu)質(zhì)懸鉤子品種缺乏已經(jīng)成為制約懸鉤子規(guī)模化、產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的重要障礙。

紅泡刺藤是廣布種，在我國西南地區(qū)廣泛分布，多個研究表明紅泡刺藤富含酚類物質(zhì)、花色苷、黃酮類物質(zhì)、維生素等生物活性成分[3]，有清除自由基[8]、改善糖尿病、抑制癌細胞增殖等作用，是良好的育種材料[9-10]。前人的研究多關(guān)注分類學(xué)，在種的水平探討懸鉤子的表型和營養(yǎng)成分[3,9]，但從未對種內(nèi)不同種源紅泡刺藤開展相關(guān)研究[3,6,9]。利用好珍貴的紅泡刺藤野生種質(zhì)資源，選育出適合我國推廣種植的紅泡刺藤種源、家系或無性系，將為我國懸鉤子產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供保障。本研究在實地調(diào)查和采集的基礎(chǔ)上結(jié)合野生紅泡刺藤果實表型和營養(yǎng)成分等數(shù)據(jù)，首次對滇西地區(qū)紅泡刺藤野生種質(zhì)資源開展綜合評價工作。研究結(jié)果可在理論上為懸鉤子屬種質(zhì)資源的有效選擇提供依據(jù)，為進一步雜交育種和良種選育打下基礎(chǔ)；應(yīng)用上為我國特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)提供優(yōu)良種質(zhì)資源，為農(nóng)林經(jīng)濟持續(xù)、快速、穩(wěn)定的發(fā)展提供保障。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2018年6～8月于天然分布區(qū)內(nèi)采摘野生狀態(tài)下的紅泡刺藤果實，相關(guān)信息見表1，編號并帶回實驗室，挑揀出有破損和未成熟的果實，將余下完整且成熟度高的果實混勻備用。隨機取果實30粒分別測量其橫、縱徑和30粒果重。測量后，密封并置于-20 ℃冰箱保存供后續(xù)實驗。

表1 試驗材料及來源Table 1 Materials and sources of experiment

無水乙醇、葡萄糖、牛血清白蛋白、考馬斯亮藍G-250、H3PO4、鹽酸、KCl、醋酸鈉、沒食子酸、Na2CO3、甲醇、NaOH、NaNO2、Al(NO3)3、FeSO4、水楊酸、檸檬酸和H2O2，均為分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；濃H2SO4，分析純，浙江臨平化工試劑廠；抗壞血酸、鄰苯二甲酸氫鉀，均為分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；酚酞、苯酚，浙江杭州雙林化工試劑廠；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

UV-2600紫外-可見分光光度計，日本島津公司；JYL-C012榨汁機，九陽股份有限公司；BCD 576 WDUP冰箱，海爾集團公司；TDL 5A離心機，上海安亭科學(xué)儀器有限公司；ZD-2型自動電位滴定儀，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；JK-119手持式折射儀，北京金科利達電子科技有限公司；手持折光儀，邦西儀器科技(上海)有限公司；電子游標(biāo)卡尺，艾瑞澤公司有限公司；CP214分析電子天平，奧豪斯儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 果實橫、縱徑測量和相關(guān)數(shù)據(jù)計算

根據(jù)《懸鉤子種質(zhì)評價標(biāo)準(zhǔn)》隨機抽取紅泡刺藤果實30粒，用電子游標(biāo)卡尺測量果底至果頂?shù)拈L度為縱徑，果最粗處的直徑為橫徑(精確0.01 mm)，縱橫徑比=縱徑/橫徑，重復(fù)3次[11]。

1.3.2 果實質(zhì)量測量

各個種源隨機抽取30粒紅泡刺藤果實，置于干燥的50 mL小燒杯中，以電子天平測量其質(zhì)量(精確0.01 g)，重復(fù)3次。

1.3.3 可溶性固形物測定

參照NY/T 2637—2014折射儀法進行，重復(fù)3次[12]。

1.3.4 可溶性糖含量測定

待測液的制備：稱取1.000 g鮮果于研缽研磨成勻漿，加入5 mL蒸餾水轉(zhuǎn)移至試管中，試管用保鮮膜封口后于沸水中加熱提取30 min(提取2次)，合并提取液，于3 000 r/min下離心20 min，上清液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中用蒸餾水反復(fù)沖洗試管及殘渣再離心，上清液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中并定容至刻度，每種源重復(fù)3次?？扇苄蕴呛繙y定采用蒽酮-硫酸法[13]，以105 ℃干燥至恒重的葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，測定并繪制一元線性回歸方程：y=6.168 0x+0.049 7，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 8。

1.3.5 總有機酸含量測定

鑒于紅泡刺藤果汁為紫紅色，參照GB/T 15038—2006中的電位滴定法進行測定，稱取15.000 g紅泡刺藤果實在榨汁機中高速研磨成勻漿，以4 000 r/min離心15 min,上清液即為待測樣品，每種源重復(fù)3次。以0.1 mol/L的NaOH溶液為滴定液，滴定結(jié)果以檸檬酸計[14]。

1.3.6 蛋白質(zhì)含量測定

待測液制備：稱取2.000 0 g鮮果于研缽內(nèi)研磨成勻漿，加入4 mL蒸餾水轉(zhuǎn)移到離心管中，移取3 mL蒸餾水沖洗研缽2次，并將沖洗液一并轉(zhuǎn)移至離心管中，以4 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移并定容上清液為待測液，每種源重復(fù)3次。蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍法進行測定[15]，以低溫烘干至恒重的牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，測定并繪制一元線性回歸方程：y=0.015 9x+0.031 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.989 7。

1.3.7 維生素C(VC)含量測定

待測液制備：稱取3.000 0 g鮮果于研缽中，加入10 mL 0.1 mol/L HCl，研磨成勻漿，以4 000 r/min離心10 min，取上清液，再加入5 mL 0.1 mol/L HCl沖洗沉淀，相同條件下離心,取上清液，將2次上清液合并，定容后即為待測液，每種源重復(fù)3次。參考馬宏飛等[16]的方法進行測定，以低溫烘干至恒重的抗壞血酸為標(biāo)準(zhǔn)品，測定并繪制一元線性回歸方程：y=0.044 2x+0.006 8，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6。

1.3.8 花色苷含量測定

待測液制備：稱取1.000 0 g鮮果于研缽中研磨成勻漿，加入15 mL提取液〔(V(0.1 mol/L 鹽酸)∶V(80%乙醇)=1∶1〕60 ℃水浴提取2 h，抽濾后濾渣以相同條件重復(fù)提取和抽濾1次，合并后定容濾液為待測液,每種源重復(fù)3次。取2 mL待測液2份，花色苷含量參考曹婷等[17]所用的pH示差法進行測定：分別用pH 1.0的KCl緩沖液和pH 4.5醋酸鈉緩沖液定容至10 mL，靜置90 min后，分別在521 nm和700 nm波長下測定吸光度，則吸光度值按公式(1)計算:

A=(A521 nm-A700 nm)pH 1.0-(A521 nm-A700 nm)pH 4.5

(1)

則花色苷濃度計算公式為：

C/(mg·g-1)=(A/εL)×MW×DF×V/m

(2)

式中：C,花色苷含量；MW=449(矢車菊-3-葡萄糖苷的分子量)；DF，樣液稀釋的倍數(shù)；ε,矢車菊-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)，26 900；L,比色皿厚度，cm；V,提取液的體積,mL；m,樣品質(zhì)量,g。

1.3.9 總酚含量測定

待測液制備：稱取2.000 0 g鮮果研磨成勻漿，加入體積分數(shù)30%的乙醇25 mL，在213 W，30 ℃條件下超聲提取30 min，提取2次，合并提取液并定容得到待測液，每種源重復(fù)3次。用福林-酚比色法[8]，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，在200～780 nm掃描中間濃度標(biāo)準(zhǔn)品的吸光曲線，發(fā)現(xiàn)在735.5 nm處有最大吸收峰，在此波長下測定并繪制一元線性回歸方程：y=1.830 8x+0.069 6，相關(guān)系數(shù)R2=0.995 3。

1.3.10 總黃酮量測定

待測液制備：稱取2.000 0 g鮮果研磨成勻漿，加入體積分數(shù)40%的乙醇10 mL，提取45 min，轉(zhuǎn)入離心管離心(4 000 r/min，15 min)，定容后得到待測液，每種源重復(fù)3次。以低溫烘至恒重的蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，采用NaNO2-Al(NO3)3絡(luò)合分光光度法測定總黃酮含量，為了避免粗提液顏色干擾總黃酮測定，以不加NaNO2的待測液作為參比[18]，顯色劑用量參考梁愛軍[19]的方法進行。經(jīng)過光譜掃描得到最大吸收波長為509 nm；在此波長下測定標(biāo)樣，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=0.563 4x+0.018 6，相關(guān)系數(shù)R2= 0.994 3。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2016制表，用SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進行方差分析、多重比較、主成分分析和聚類分析等。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種源紅泡刺藤果實表型指標(biāo)測定

11個不同種源紅泡刺藤果實的縱徑、橫徑、縱橫徑比和30粒果重指標(biāo)存在顯著差異。采自高井槽種源的果實縱徑最大，為9.90 mm；采自金廠河種源的果實縱徑最小，僅7.27 mm；高井槽和魚塘村的紅泡刺藤果實橫徑顯著大于其余種源，皆為13.29 mm；金廠河種源的紅泡刺藤果實橫徑最小，僅為10.00 mm。果實縱橫徑比是用來描述果實形狀的指標(biāo)，滇西地區(qū)紅泡刺藤的縱橫徑比在0.72～0.79，說明紅泡刺藤果實成扁圓形。30粒果質(zhì)量排名前3的種源分別是七零七種源33.15 g、小尖山種源25.69 g、山邑種源22.71 g。

表2 不同種源紅泡刺藤果實表型指標(biāo)比較Table 2 Comparison phenotype indicators of R. niveus from different provenances

2.2 不同種源紅泡刺藤果實營養(yǎng)成分比較

11個不同種源紅泡刺藤果實營養(yǎng)成分見表3。不同種源紅泡刺藤營養(yǎng)成分呈顯著差異。可溶性固形物一般反映漿果內(nèi)含物含量的多少[20]，滇西地區(qū)紅泡刺藤果實可溶性固形物含量最高的是高井槽和魚塘村種源，皆為13.00 °Bx，可溶性固形物含量最低的為山邑種源，僅為6.33 °Bx。不同種源紅泡刺藤果實可溶性糖含量在2.43%～7.94%，小尖山種源可溶性糖含量最高，山邑種源含量最低；總有機酸含量在1.45%～3.01%，金廠河種源總有機酸含量最高，九之坡種源總有機酸含量最低；蛋白質(zhì)含量在0.536～0.914 mg/g，其中九之坡種源蛋白質(zhì)含量最高，金雞種源蛋白質(zhì)含量最低。小尖山種源的花色苷、總酚和總黃酮的含量最高，分別為0.603、0.080和0.144 mg/g；山邑種源的總酚和總黃酮含量低于其他所有種源，分別為0.025和0.036 mg/g。

表3 不同種源紅泡刺藤果實營養(yǎng)成分比較Table 3 Nutritional compositions of R. niveus from different provenances

比較文獻中不同地區(qū)的懸鉤子屬植物果實的研究，發(fā)現(xiàn)紅泡刺藤果實表型和營養(yǎng)成分差異顯著：西藏地區(qū)紅泡刺藤的單果質(zhì)量為0.55 g，河南地區(qū)紅泡刺藤的單果質(zhì)量為0.50，；兩者皆小于滇西地區(qū)的平均單果質(zhì)量0.70 g(表4)；滇西地區(qū)紅泡刺藤果實的可溶性固形物、可溶性糖和VC含量最低，而花色苷含量最高[3,21-22]?？梢?，基于不同種源的果實表型和營養(yǎng)成分分析，既能全面了解紅泡刺藤的品質(zhì)，又能為進一步研究表型和營養(yǎng)成分變異來源提供參考。

表4 不同地區(qū)紅泡刺藤表型和成分分析Table 4 Phenotype and composition analysis of R. niveus from different provenances

2.3 紅泡刺藤營養(yǎng)成分相關(guān)分析

由表5可知：紅泡刺藤果實VC與所測其余營養(yǎng)成分之間不存在顯著的相關(guān)關(guān)系；總有機酸和其余營養(yǎng)成分相關(guān)性較弱，僅與花色苷呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.406；蛋白質(zhì)僅與可溶性糖、總酚呈極顯著相關(guān)。其余營養(yǎng)成分之間大多存在顯著或極顯著相關(guān)關(guān)系，其中總酚與可溶性糖之間的相關(guān)系數(shù)最高，為0.823；總黃酮與可溶性糖之間的相關(guān)系數(shù)次之，為0.822。說明紅泡刺藤果實各營養(yǎng)成分之間存在一定程度的相關(guān)性，雖然有的營養(yǎng)成分之間的相關(guān)性并未達到顯著相關(guān)，但是仍可對紅泡刺藤種源評價提供科學(xué)依據(jù)[23-24]。

表5 各營養(yǎng)成分Pearson相關(guān)分析Table 5 Pearson correlation analysis of nutritional compositions

2.4 基于營養(yǎng)成分選擇優(yōu)良紅泡刺藤種源

對于小漿果優(yōu)良種源、家系、無性系或品種的評價因涉及指標(biāo)眾多、指標(biāo)之間存在一定相關(guān)性而顯得尤為復(fù)雜，需要借助多元統(tǒng)計的方法對所測數(shù)據(jù)進行分析，主成分分析和綜合指數(shù)選擇法就是常用的方法之一[20,25]。表6為紅泡刺藤果實各營養(yǎng)成分的特征值及百分比(貢獻率)和累計百分比。特征值越大則因子的方差貢獻越大：第1主成分特征值為3.972，占營養(yǎng)成分特征值總和的49.644%，第2主成分特征值為1.415，占營養(yǎng)成分特征值總和的17.686%，第3主成分特征根為1.013，占營養(yǎng)成分特征值總和的12.659%，第4主成分特征根為0.773，占營養(yǎng)成分特征值總和的9.666%。前4個主成分累計貢獻率為89.654%(>85%)，故而提取這4個主成分就能較好地解釋原有變量的信息。

表6 各個主成分的特征根和貢獻率Table 6 Characteristic roots and contribution rate of main components

4個主成分的因子載荷矩陣如表7所示：第1主成分的可溶性固形物、可溶性糖、花色苷、總酚和總黃酮5個成分有較高的正載荷分別為0.756、0.911、0.769、0.933和0.915；第2和第3主成分中VC有較高正載荷；第4主成分中蛋白質(zhì)的載荷最高，為0.497。以主成分載荷矩陣(表7)中的各數(shù)值除以平方根特征值(表6)，可算出各個主成分的特征向量矩陣，得到4個主成分與各營養(yǎng)成分之間關(guān)系的表達式為：

表7 主成分載荷矩陣Table 7 Principal component loading matrix

y1=0.379x1+0.457x2+0.132x3+0.223x4-0.032x5+0.386x6+0.468x7+0.459x8

y2=0.098x1+0.204x2-0.657x3+0.417x4+0.478x5-0.332x6+0.056x7-0.042x8

y3=-0.196x1+0.009x2+0.026x3-0.532x4+0.750x5+0.300x6+0.057x7+0.146x8

y4=-0.498x1-0.047x2+0.511x3+0.565x4+0.276x5-0.013x6+0.243x7-0.183x8

采用綜合指數(shù)選擇法，根據(jù)不同種源紅泡刺藤果實營養(yǎng)成分和主成分表達式進行打分，不同種源紅泡刺藤果實得分見表8。以綜合評分=0.496 44×第1主成分得分+0.176 86×第2主成分得分+0.126 59×第3主成分+0.096 66×第4主成分，得到各個種源紅泡刺藤果實的綜合評分，按從大到小順序排列為：小尖山>高井槽>金廠河>九之坡>魚塘村>沙溪>七零七>猴橋>金雞>騰越>山邑。綜合評分高表示該種源紅泡刺藤果實的綜合品質(zhì)較高，小尖山種源得分最高，為1.987；山邑種源得分最低，為-1.500。

表8 因子得分及排序Table 8 Factor scores and ordering

2.5 不同種源紅泡刺藤營養(yǎng)成分聚類分析

紅泡刺藤果實營養(yǎng)成分豐富，不同種源之間存在極顯著差異，表明種源間存在一定的多樣性。本研究基于所測的8個營養(yǎng)成分指標(biāo)對11個種源的紅泡刺藤果實進行歐氏距離矩陣聚類分析。結(jié)果顯示：在距離為15的情況下，11個不同種源紅泡刺藤果實聚為3類，其中金廠河、騰越、金雞、猴橋、山邑、高井槽6個種源聚為Ⅰ類；沙溪種源為Ⅱ類；九之坡、七零七、小尖山、魚塘村4個種源，以逐步聚類的方式聚為Ⅲ類。Ⅰ類在距離為10的情況下又分為2個亞類，金廠河、騰越、金雞種源為第1亞類，猴橋、山邑、高井槽種源為第2亞類。Ⅱ類的特點是可溶性固形物、蛋白質(zhì)和VC含量較高，而總有機酸、花色苷和總酚含量較低。Ⅲ類的特點是可溶性固形物含量偏高，總有機酸和VC含量偏低。

圖1 不同種源紅泡刺藤營養(yǎng)成分聚類圖Fig.1 Cluster analysis of processing qualities of R. niveus from different provenances

3 結(jié)論與討論

11個不同種源紅泡刺藤果實的表型和營養(yǎng)成分均存在極顯著差異，且各營養(yǎng)成分之間存在一定相關(guān)性。試驗以主成分分析對11個不同種源紅泡刺藤果實的8種營養(yǎng)成分進行綜合評價，提取出4個主成分，累計貢獻率為89.654%，能夠較好地反映紅泡刺藤果實營養(yǎng)成分。根據(jù)綜合指數(shù)選擇法，得到各個種源紅泡刺藤果實的綜合評分順序為小尖山>高井槽>金廠河>九之坡>魚塘村>沙溪>七零七>猴橋>金雞>騰越>山邑，且前6個種源的綜合評分為正值。其中小尖山種源綜合評分第一，其30粒果重為25.69 g，可溶性固形物、可溶性糖、花色苷、總酚和總黃酮含量較高；綜合評分第2的高井槽種源的果實最大(橫、縱徑皆為最大)，可溶性固形物、可溶性糖、蛋白質(zhì)、總酚和總黃酮含量較高；綜合評分第3的金廠河種源果實最小(橫、縱徑皆為最小)，總有機酸和蛋白質(zhì)含量較高。按照30%的入選率[26-27]，建議將小尖山、高井槽和金廠河種源作為較有潛力種質(zhì)資源進行多點試驗等。

充分了解紅泡刺藤的表型和營養(yǎng)成分，不僅有利于我國懸鉤子產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展，而且能夠豐富水果種類，為觀光農(nóng)業(yè)的發(fā)展提供優(yōu)良種質(zhì)資源。本試驗所探討的11個紅泡刺藤種源皆為實地調(diào)查采集所得，研究結(jié)果為懸鉤子屬植物果實評價體系的建立提供理論依據(jù)?？梢愿鶕?jù)不同的開發(fā)利用目的選擇不同的紅泡刺藤種質(zhì)資源。不同懸鉤子屬植物種類合理搭配，可延長果園的采摘期；探討不同加工方式對懸鉤子品質(zhì)的影響，進一步完善評價體系，也可成為將來的研究方向。