陳 杰，肖葉玉，*，梁曉瑩，曹 震，李文艷

(1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科，廣東 汕頭 515041；2.廣州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科，廣東 廣州 510800)

圖1 于大鼠右下肢腓腸肌矢狀位(A)及軸位(B)MRI定位ROI

糖尿病(diabetes mellitus, DM)是以高血糖為特征的代謝紊亂疾病[1]，糖尿病足(diabetic foot, DF)為其常見慢性并發(fā)癥之一，全球發(fā)病率約達(dá)6%，且每30 s即有1例患者需截肢[2]；正確的預(yù)防措施及合理的治療方法能大幅度減少截肢率[3]。DF的重要病理生理機(jī)制之一是糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy, DPN)，相關(guān)檢查方法有神經(jīng)傳導(dǎo)、振動(dòng)閾值的檢測及皮膚表皮內(nèi)神經(jīng)纖維活檢[3]，但各有其缺陷。氫質(zhì)子磁共振頻譜(Hydrogen-1 magnetic resonance spectrum,1H-MRS)可無創(chuàng)定量檢測細(xì)胞水平代謝變化，反映骨骼肌代謝狀態(tài)[4]。本研究探討1H-MRS定量分析DM大鼠模型下肢骨骼肌代謝物變化對(duì)早期評(píng)估大鼠DM模型DPN的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及建立模型 將40只3月齡、體質(zhì)量約200 g的SPF級(jí)SD雄性大鼠(由汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(n=20)與正常組(n=20)。參照文獻(xiàn)[5] 方法，采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)+腹腔注射鏈脲菌素法制造大鼠DM模型。實(shí)驗(yàn)組大鼠予高糖高脂飼料喂養(yǎng)30天，之后停飼12 h，按45 mg/kg體質(zhì)量腹腔注射濃度1%鏈脲菌素。以注射后1、3、7天剪尾測得隨機(jī)血糖穩(wěn)定且均16.7 mmol/L表示DM大鼠模型造模成功，造模后仍予高脂飼料喂養(yǎng)。對(duì)正常組大鼠予普通飼料喂養(yǎng)30天，后剪尾監(jiān)測隨機(jī)血糖均<16.7 mmol/L。本研究經(jīng)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：SUMC2017-146)。

1.2 儀器與方法 采用安捷倫7.0 T MR小動(dòng)物成像儀采集圖像，配備9563兩通道容積線圈。于造模前和造模后7、14、21天以濃度1.5%異氟烷行氣道麻醉大鼠后固定其右下肢，采集右下肢腓腸肌MRS。經(jīng)線圈調(diào)諧、3D梯度回波勻場使水峰半高寬<30 Hz，常規(guī)3平面定位后，采用單體素波譜PRESS序列采集MRS，盡量避免骨質(zhì)、肌間隙及脂肪的干擾，于右下肢腓腸肌放置ROI，TR 2 500 ms，TE 15 ms，Average 300，體素3 mm×3 mm×3 mm。見圖1。

1.3 數(shù)據(jù)分析 掃描結(jié)束后將數(shù)據(jù)導(dǎo)入LCModel軟件(6.3 version, LCModel)，獲得膽堿復(fù)合物(choline-containing compounds, Cho)、肌酸復(fù)合物(creatine compounds, Cr)及細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)(intra-myocellular lipids, IMCL)的絕對(duì)濃度值和Cho/Cr、IMCL/Cr的相對(duì)濃度值，并自動(dòng)擬合生成MRS圖。

1.4 測定大鼠坐骨神經(jīng)電生理傳導(dǎo) 于造模后21天掃描結(jié)束后，以1 ml/100 g體質(zhì)量腹腔注射濃度4%水合氯醛深度麻醉大鼠，剝離右下肢皮膚肌肉，盡可能暴露并分離右下肢坐骨神經(jīng)。將離體坐骨神經(jīng)置于37℃任氏液中浸泡10 min，待其恢復(fù)靜息狀態(tài)后置入干燥的神經(jīng)屏蔽盒內(nèi)，采用BL-420肌肉神經(jīng)實(shí)驗(yàn)測定系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)檢測大鼠坐骨神經(jīng)電生理傳導(dǎo)，以刺激器刺激近心端電極，記錄刺激電極與記錄電極間的距離S，測量動(dòng)作電位的潛伏期T(自刺激偽跡起始點(diǎn)至動(dòng)作電位起始點(diǎn)的時(shí)間)、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度(motor nerve conduction velocity, MNCV)=S/T，重復(fù)電刺激3次，每次刺激間隔10 s，以其均值為最后結(jié)果；調(diào)換2個(gè)電極位置，以同樣方法獲得感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度(sensory nerve conduction velocity, SNCV)。

圖2 實(shí)驗(yàn)組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)右下肢腓腸肌MRS圖 A.造模前； B.造模后7天； C.造模后14天；D.造模后21天

1.5 大鼠坐骨神經(jīng)HE染色 測定電生理傳導(dǎo)后，取1 cm坐骨神經(jīng)浸泡于濃度10%甲醛溶液，之后常規(guī)進(jìn)行脫水、石蠟包埋、切片及HE染色。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。計(jì)量資料以±s表示。以Levene檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)的方差齊性。采用單因素方差分析比較實(shí)驗(yàn)組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)代謝物濃度及相對(duì)濃度，采用Bonferrioni檢驗(yàn)(方差齊)或Games-howell檢驗(yàn)(方差不齊)對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行兩兩比較；以獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較2組間MNCV及SNCV差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

造模過程中實(shí)驗(yàn)組2只大鼠死亡，2只大鼠造模未成功，實(shí)驗(yàn)組共16只大鼠、正常組20只大鼠納入研究。

2.1 實(shí)驗(yàn)組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)右下肢腓腸肌代謝物濃度及相對(duì)濃度值比較 不同時(shí)間點(diǎn)Cho、Cr、IMCL、Cho/Cr及IMCL/Cr值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。造模后7天Cho、IMCL及IMCL/Cr值高于造模前(P均<0.05)，造模后14天Cho、Cr值與造模前差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，造模后21天Cho、Cr及Cho/Cr值均高于造模前(P均<0.05)，余各時(shí)間點(diǎn)兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1、圖2。

表1 實(shí)驗(yàn)組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)右下肢腓腸肌代謝物絕對(duì)濃度值及相對(duì)濃度值比較(±s)

表1 實(shí)驗(yàn)組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)右下肢腓腸肌代謝物絕對(duì)濃度值及相對(duì)濃度值比較(±s)

時(shí)間點(diǎn)ChoCrIMCLCho/CrIMCL/Cr造模前51.45±4.03122.67±11.4037.10±17.450.42±0.100.32±0.14造模后7天 78.89±28.60*140.97±18.14110.07±52.90*0.57±0.230.81±0.44*造模后14天86.02±24.16*146.47±15.34*89.04±46.060.57±0.140.58±0.29造模后21天95.98±21.08*150.88±23.92*115.95±61.360.67±0.16*0.76±0.40F值6.695.413.653.513.10P值<0.01<0.010.020.020.04

注：*：與造模前比較，P<0.05

圖3 2組大鼠造模后21天右下肢坐骨神經(jīng)病理圖(HE，×20) A.實(shí)驗(yàn)組； B.正常組

2.2 2組大鼠右下肢坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度比較 造模后21天，實(shí)驗(yàn)組大鼠右下肢坐骨神經(jīng)MNCV及SNCV[(47.89±2.85) m/s、(46.67±3.87) m/s]均較正常組[(55.52±3.38) m/s、(53.48±4.24) m/s]減低(t=2.74、4.62，P均<0.01)。

2.3 病理所見 實(shí)驗(yàn)組坐骨神經(jīng)HE染色見神經(jīng)纖維尚連續(xù)，但纖維之間稀疏松散，排列紊亂，部分髓鞘著色淺且不均勻，軸索變細(xì)萎縮；正常組坐骨神經(jīng)HE染色見神經(jīng)纖維平行排列規(guī)整、密集，均勻分布，粗細(xì)均一，髓鞘著色均勻，軸索形態(tài)正常。見圖3。

3 討論

目前DM動(dòng)物模型采用多種動(dòng)物，以鏈脲菌素誘導(dǎo)大鼠DM模型最為常用且經(jīng)濟(jì)、有效[5]。本研究采用高脂飼料喂養(yǎng)+腹腔注射鏈脲菌素法制備大鼠DM模型。既往研究[6]認(rèn)為造模時(shí)鏈脲菌素用量<35 mg/kg體質(zhì)量為低劑量，40～55 mg/kg體質(zhì)量為中等劑量，>65 mg/kg體質(zhì)量為高劑量。本研究于停飼12 h后以中等劑量45 mg/kg體質(zhì)量腹腔一次性注射鏈脲菌素，成模率約80%，動(dòng)物死亡率較低，且成模后實(shí)驗(yàn)組大鼠隨機(jī)血糖穩(wěn)定。DM大鼠模型造模成功后，DONG等[7]繼續(xù)予普通飼料喂養(yǎng)8周，發(fā)現(xiàn)坐骨神經(jīng)存在脫髓鞘、軸突萎縮改變。本研究造模成功后繼續(xù)予高糖高脂飼料喂養(yǎng)21天，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組大鼠右下肢坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度降低，而病理結(jié)果僅發(fā)現(xiàn)坐骨神經(jīng)部分神經(jīng)纖維之間稀疏，未見明顯脫髓鞘及軸索萎縮等表現(xiàn)，證明實(shí)驗(yàn)組大鼠處于DPN較早期。

Cho與細(xì)胞膜磷脂代謝有關(guān)，參與細(xì)胞膜合成和轉(zhuǎn)運(yùn)；正常機(jī)體骨骼肌系統(tǒng)中Cho濃度穩(wěn)定[8]。腫瘤性病變膽堿峰升高提示細(xì)胞膜生物合成增加，反映細(xì)胞增殖；惡性腫瘤Cho絕對(duì)值、Cho/Cr較良性腫瘤明顯升高[9]。非腫瘤性病變Cho升高為細(xì)胞膜崩解標(biāo)志[10]，脫髓鞘病變?cè)缙诩闯霈F(xiàn)Cho濃度升高，且持續(xù)數(shù)月。缺血性腦卒中急性期缺血半暗帶中Cho濃度升高，后逐漸下降[10]。本研究實(shí)驗(yàn)組造模后Cho值及Cho/Cr值較造模前升高，且隨造模時(shí)間延長Cho絕對(duì)值逐漸升高，可能與神經(jīng)脫髓鞘所致功能障礙有關(guān)。施萬細(xì)胞為周圍神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，高糖狀態(tài)下易致脫髓鞘改變[11]，出現(xiàn)早期DPN癥狀。本研究中實(shí)驗(yàn)組大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度減低，病理檢查結(jié)果示部分髓鞘著色淺且不均勻，軸索變細(xì)萎縮，推測大鼠坐骨神經(jīng)功能受損可能引起神經(jīng)營養(yǎng)功能障礙，最終導(dǎo)致肌細(xì)胞腫脹、胞膜逐漸崩解。

Cr可由機(jī)體內(nèi)源性產(chǎn)生(約1 g/d)，亦可從飲食中主要通過肉類攝取 (約1～5 g/d)。約95%的Cr分布于骨骼肌中，是能量利用、儲(chǔ)存的重要物質(zhì)，也是細(xì)胞能量代謝的標(biāo)志[12]。研究[13]發(fā)現(xiàn)結(jié)扎大鼠下肢血管后，其Cr水平遠(yuǎn)低于未結(jié)扎的DM大鼠及正常大鼠，表明Cr水平與下肢毛細(xì)血管及小動(dòng)脈密度減少有關(guān)。VARMA等[14]認(rèn)為炎性疾病導(dǎo)致Cr水平升高，治療后可下降。DM導(dǎo)致血管病變的主要機(jī)制包括蛋白激酶C激活、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)等引起血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，使基底膜增厚，最終血管腔進(jìn)行性變窄及組織器官供血障礙[15]。本研究實(shí)驗(yàn)組造模后14、21天Cr濃度均高于正常組，可能原因在于DM高血糖導(dǎo)致早期下肢血管、肌肉炎癥反應(yīng)，但未出現(xiàn)血管狹窄、毛細(xì)血管及小動(dòng)脈密度減少，血流灌注受限致Cr水平下降。

骨骼肌中的脂質(zhì)作為能量來源儲(chǔ)存于細(xì)胞外肌間質(zhì)脂肪細(xì)胞，或以脂滴形式儲(chǔ)存于肌肉細(xì)胞內(nèi)，直接與線粒體接觸。IMCL含量與肥胖、胰島素抵抗、2型DM及動(dòng)脈硬化等疾病相關(guān)，加以定量分析具有重要意義[16-17]。對(duì)活檢組織進(jìn)行生化分析可定量分型IMCL，但有創(chuàng)，不宜重復(fù)，且易受肌細(xì)胞外脂質(zhì)(extra-myocellular lipids, EMCL)干擾引起IMCL水平假性升高。IMCL亞甲基群在脂滴內(nèi)呈球形，1H-MRS是目前唯一能在體區(qū)分IMCL與EMCL的方法[18]。研究[19]發(fā)現(xiàn)高胰島素抵抗2型DM患者骨骼肌IMCL水平升高，本研究結(jié)果與之一致，可能與DM導(dǎo)致高糖高脂、誘導(dǎo)線粒體活性氧增加，損傷線粒體、引起線粒體功能障礙，降低線粒體脂肪酸氧化能力，增加細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量有關(guān)[20]。

綜上所述，1H-MRS可無創(chuàng)定量分析骨骼肌代謝，早期評(píng)估大鼠DM模型DPN。