王雙童，張志毅，李迎秋*

(1.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東科學(xué)院)，食品科學(xué)與工程學(xué)院，濟(jì)南 250353；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018)

微生物污染一直是食品生產(chǎn)儲(chǔ)存過程中所面臨的重要問題，由致病菌污染引起的食品安全問題也與日俱增[1]。防腐劑作為具有抑制或殺滅腐敗菌的添加劑，被廣泛運(yùn)用在食品加工行業(yè)。隨著人們對(duì)安全、綠色食品的追求，化學(xué)防腐劑諸如山梨酸鉀、苯甲酸鈉等逐漸被天然防腐劑代替[2]。大豆球蛋白堿性抗菌肽(SBAP)是從大豆豆粕中提取的一種堿性陽(yáng)離子多肽，已被證實(shí)具有廣譜的抗菌活性，對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞幾乎不產(chǎn)生毒性[3,4]。乳酸鏈球菌素又稱乳鏈菌肽(Nisin)，是由乳酸鏈球菌(Lactococcuslactisssp.lactis)分泌的一種多肽抗菌素類物質(zhì)，其對(duì)人體無毒害作用，可以被水解成氨基酸，目前已經(jīng)作為天然食品防腐添加劑應(yīng)用在多種食品的加工中[5]。

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌被世界衛(wèi)生組織定義為四大食源性病原菌之一[6]，單增李斯特氏菌食源性疾病雖然僅占總體的0.1%，但所引起的疾病具有20%～30%的高致死率[7]。單增李斯特氏菌可以生長(zhǎng)于大部分的食物如：肉、蛋、奶、蔬果等中，并且具有較強(qiáng)的耐冷性，在4 ℃的環(huán)境中仍可生長(zhǎng)繁殖[8]，造成嚴(yán)重的食品污染及安全問題。本實(shí)驗(yàn)對(duì)大豆球蛋白堿性抗菌肽和乳酸鏈球菌素對(duì)單增李斯特氏菌的抑菌作用進(jìn)行了研究，了解兩種防腐劑的作用機(jī)制，以期后續(xù)將兩者進(jìn)行復(fù)配使用，提高抗菌效果，降低單一使用量，更好應(yīng)用在食品防腐中。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆球蛋白堿性抗菌肽：由實(shí)驗(yàn)室富集所得；乳酸鏈球菌素：購(gòu)于浙江銀象生物工程有限公司；腦心浸液肉湯培養(yǎng)基(BHI培養(yǎng)基，用于李斯特氏菌培養(yǎng))、李斯特氏菌ATCC 19115：齊魯工業(yè)大學(xué)菌種保藏中心；其余試劑均為分析純。

1.2 菌懸液的配制

將細(xì)菌接種于BHI瓊脂斜面培養(yǎng)基，置于37 ℃下培養(yǎng)24 h；然后挑取細(xì)菌菌落接種于BHI液體培養(yǎng)基，在37 ℃條件下恒溫振蕩培養(yǎng)過夜，平板計(jì)數(shù)測(cè)定菌體濃度，將培養(yǎng)液稀釋成菌體濃度為107CFU/mL的菌懸液。

1.3 抗菌劑的配制

大豆球蛋白堿性抗菌肽、乳酸鏈球菌素用pH 7的無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)配制成質(zhì)量濃度為20 mg/mL的溶液，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定

通過試管稀釋法檢測(cè)兩種抗菌劑對(duì)單增李斯特氏菌的抗菌活力。取16根試管，分成兩組并編號(hào)1～8，其中2～7號(hào)為實(shí)驗(yàn)組，在試管中加入BHI液體培養(yǎng)基和大豆球蛋白堿性多肽、乳酸鏈球菌素母液至兩種抗菌劑的終濃度為0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mg/mL，1號(hào)管加無菌水代替抗菌劑作為陽(yáng)性對(duì)照，8號(hào)管用液體培養(yǎng)基代替菌液作為陰性對(duì)照。移取單增李斯特氏菌菌液100 μL加入1～7號(hào)管中，于37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，肉眼難以檢測(cè)微生物生長(zhǎng)的最低濃度即為最小抑菌濃度。

1.5 核酸及蛋白泄露分析

單增李斯特氏菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，分別取30 mL菌液至5個(gè)離心管中，離心收集菌體，并用無菌生理鹽水洗滌2次，加入抗菌劑及無菌生理鹽水至30 mL，使得大豆球蛋白堿性抗菌肽的濃度為0，0.2，0.4 mg/mL；乳酸鏈球菌素的濃度為0，0.5，1 mg/mL，隨后在37 ℃培養(yǎng)，分別在0.5，1，1.5，2，3，4 h時(shí)取3 mL菌液，離心后檢測(cè)上清液在260，280 nm處的吸光度。

1.6 掃描電鏡分析

單增李斯特氏菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，取8 mL菌液，加入抗菌劑及無菌生理鹽水補(bǔ)足至10 mL，使大豆球蛋白堿性抗菌肽和乳酸鏈球菌素的濃度為2倍最小抑菌濃度，37 ℃培養(yǎng)4 h。用無菌生理鹽水在6500 r/min下離心洗滌3次，所得到的菌體沉淀用2.5%的戊二醛溶液固定過夜。隨后用酒精(30%、50%、70%、80%、90%、100%)進(jìn)行梯度脫水。吸取適量脫水后的菌體，進(jìn)行真空干燥，最后通過掃描電鏡觀察。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 大豆球蛋白堿性抗菌肽和乳酸鏈球菌素對(duì)單增李斯特氏菌的最小抑菌濃度

大豆球蛋白堿性抗菌肽和乳酸鏈球菌素對(duì)單增李斯特氏菌的最小抑菌濃度見表1，單增李斯特氏菌的生長(zhǎng)情況見圖1。

表1 大豆球蛋白堿性抗菌肽和乳酸鏈球菌素對(duì)單增李斯特氏菌的最小抑菌濃度Table 1 The minimal inhibitory concentration (MIC) of soy globulin basic antimicrobial peptide and nisin against Listeria monocytogenes

由表1和圖1可知，大豆球蛋白堿性抗菌肽對(duì)單增李斯特氏菌的最小抑菌濃度為0.2 mg/mL，乳酸鏈球菌素對(duì)單增李斯特氏菌的最小抑菌濃度為0.5 mg/mL。兩種抗菌劑均對(duì)單增李斯特氏菌生長(zhǎng)表現(xiàn)出抑制作用，而大豆球蛋白堿性抗菌肽的最小抑菌濃度小于乳酸鏈球菌素的最小抑菌濃度，表明大豆球蛋白堿性抗菌肽對(duì)單增李斯特氏菌的抑制作用強(qiáng)于乳酸鏈球菌素。

2.2 核酸蛋白泄露

單增李斯特氏菌核酸蛋白泄露結(jié)果見圖2。

圖2 大豆球蛋白堿性抗菌肽/乳酸鏈球菌素處理后單增李斯特氏菌核酸、蛋白泄露情況Fig.2 The leakage situations of nucleic acids and proteins of Listeria monocytogenes after soy globulin basic antimicrobial peptide/nisin treatment

核酸和蛋白在波長(zhǎng)為260 nm和280 nm處有最大吸收峰，通過檢測(cè)經(jīng)兩種抗菌劑處理后菌液上清液在兩個(gè)波長(zhǎng)處的吸光值可以判定單增李斯特氏菌的核酸和蛋白泄露情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩種抑菌劑的處理都引起了OD值的上升，但大豆球蛋白堿性抗菌肽處理組在2 h后的OD值趨于穩(wěn)定，而乳酸鏈球菌素處理組的OD值則隨著處理時(shí)間的積累不斷增強(qiáng)，且在相同處理時(shí)長(zhǎng)下，乳酸鏈球菌素處理組的OD值高于大豆球蛋白堿性抗菌肽處理組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩種抗菌劑均對(duì)單增李斯特氏菌的細(xì)胞膜造成破壞，致使胞內(nèi)核酸和蛋白的泄露，同時(shí)乳酸鏈球菌素對(duì)細(xì)胞膜的破壞能力強(qiáng)于大豆球蛋白堿性抗菌肽。

2.3 掃描電鏡結(jié)果

掃描電鏡實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。

圖3 單增李斯特氏菌掃描電鏡實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.3 The SEM results of Listeria monocytogenes

由未處理組的圖像可以看出，單增李斯特氏菌是一種桿菌，菌體表面光滑且大小均勻，具有完整的形態(tài)。大豆球蛋白堿性抗菌肽處理的單增李斯特氏菌表面變得粗糙，且菌體發(fā)生輕微的皺縮，但細(xì)胞依舊可以維持一定的形態(tài)。而經(jīng)過乳酸鏈球菌素處理的細(xì)胞，則可以看出嚴(yán)重的破壞現(xiàn)象，細(xì)胞黏連，無法維持正常的形態(tài)。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大豆球蛋白堿性抗菌肽對(duì)單增李斯特氏菌的最小抑菌濃度為0.2 mg/mL，乳酸鏈球菌素對(duì)單增李斯特氏菌的最小抑菌濃度為0.5 mg/mL。大豆球蛋白堿性抗菌肽和乳酸鏈球菌素均對(duì)單增李斯特氏菌具有良好的抑制作用，但大豆球蛋白堿性抗菌肽的抑制效果更強(qiáng)。此外，兩種抗菌劑處理后都造成了細(xì)菌胞內(nèi)核酸和蛋白的泄露，由乳酸鏈球菌素引起的核酸和蛋白泄露比大豆球蛋白堿性抗菌肽處理導(dǎo)致的更加嚴(yán)重。乳酸鏈球菌素可能對(duì)膜造成了更多的破壞。而掃描電鏡實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)果，可以看出大豆球蛋白堿性抗菌肽處理僅造成了單增李斯特氏菌的皺縮，細(xì)胞仍具有較為完整的形態(tài)，表明大豆球蛋白堿性抗菌肽并沒有對(duì)單增李斯特氏菌胞膜產(chǎn)生較強(qiáng)的破壞能力；而乳酸鏈球菌素處理導(dǎo)致細(xì)胞坍縮且出現(xiàn)黏連，細(xì)胞破壞嚴(yán)重，且無完整形態(tài)，表明乳酸鏈球菌素處理對(duì)細(xì)胞的胞膜造成了嚴(yán)重的破壞。

乳酸鏈球菌素對(duì)單增李斯特氏菌的抑制作用更多是通過對(duì)其胞膜的破壞。而大豆球蛋白堿性抗菌肽在低于乳酸鏈球菌素的濃度下就可以抑制單增李斯特氏菌，且并未對(duì)細(xì)胞形態(tài)產(chǎn)生較大破壞，表明大豆球蛋白堿性抗菌肽存在其他的作用方式，可能對(duì)單增李斯特氏菌胞內(nèi)物質(zhì)造成影響。先前的研究表明，Nisin與納他霉素復(fù)配能提高對(duì)食源菌的抑制能力[9]。而Nisin對(duì)單增李斯特氏菌胞膜的破壞可能有助于大豆球蛋白堿性抗菌肽對(duì)胞內(nèi)物質(zhì)的作用，兩種防腐劑具有在食品中復(fù)配使用的可能性，提高抗菌能力的同時(shí)降低了成本。