董玉瑋，苗敬芝*，李勇

(1.徐州工程學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，江蘇 徐州 221018；2.江蘇省食品資源開(kāi)發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221018)

大蒜為多年生草本、百合科蔥屬植物，在我國(guó)種植廣泛[1]。大蒜中含有多種生物活性物質(zhì)，主要有多糖、氨基酸、維生素、微量元素等，因而對(duì)人體具有抗氧化、防衰老、抗病毒、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力等多種生理功能[2,3]。大蒜多糖是其主要的活性成分之一，能增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和巨細(xì)胞的活力，具有保護(hù)肝臟、抗菌消炎、降血糖、降血脂、防止動(dòng)脈粥樣硬化、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力等功效，在保健食品和醫(yī)藥領(lǐng)域有著廣闊的開(kāi)發(fā)前景[4,5]。

大蒜多糖常用的提取方法有熱水提取法、微波提取法、超聲波提取法、酸堿提取法等[6-9]。本試驗(yàn)以大蒜為原料，采用雙酶法提取大蒜多糖，利用酶具有較高的選擇性，能高效溫和地促使細(xì)胞壁裂解，促進(jìn)多糖向溶液中浸出，所得產(chǎn)物性質(zhì)穩(wěn)定，活性高等特點(diǎn)[10,11]，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)曲面法優(yōu)化大蒜多糖的提取工藝條件，探討大蒜多糖的體外抗氧化活性，并與VC對(duì)照，為大蒜產(chǎn)品的深加工提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大蒜：徐州市大韓農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

濃硫酸、苯酚、硫酸亞鐵、水楊酸、DPPH、鄰苯三酚、95%乙醇等均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

SENCO旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申生科技有限公司；DHG-9075電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海慧泰儀器制造有限公司；723G可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海分析儀器有限公司；TDL-6低速大容量離心機(jī) 金壇晨陽(yáng)電子儀器廠；TU-1810紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 雙酶法提取大蒜多糖工藝流程

大蒜→去皮、清洗→切片→干燥→粉碎、過(guò)篩→稱(chēng)取一定量大蒜粉→加入纖維素酶和果膠酶→按一定料液比加入檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)pH→酶解→滅酶→離心→上清液→苯酚-硫酸法測(cè)多糖含量。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

1.3.2.1 纖維素酶添加量對(duì)大蒜多糖得率的影響

酶解溫度50 ℃，料液比1∶25，果膠酶2.0%，探討纖維素酶添加量(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)對(duì)大蒜多糖得率的影響。

1.3.2.2 果膠酶添加量對(duì)大蒜多糖得率的影響

酶解溫度50 ℃，料液比1∶25，纖維素酶2.0%，探討果膠酶添加量(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)對(duì)大蒜多糖得率的影響。

1.3.2.3 酶解時(shí)間對(duì)大蒜多糖得率的影響

酶解溫度50 ℃，料液比1∶25，纖維素酶2.0%，果膠酶2.0%，探討酶解時(shí)間(120，140，160，180，200 min)對(duì)多糖得率的影響。

1.3.2.4 酶解溫度對(duì)大蒜多糖得率的影響

料液比1∶25，纖維素酶添加量2.0%，果膠酶添加量2.0%，探討酶解溫度(35，40，45，50，55 ℃)對(duì)多糖得率的影響。

1.3.3 響應(yīng)曲面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[12,13]，采用四因素三水平的響應(yīng)曲面分析法，試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)曲面因素水平表Table 1 The factors and levels of response surface

1.3.4 大蒜粗多糖的制備

按優(yōu)化方案提取大蒜多糖，離心分離，上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮至原體積的1/3，按體積比4∶1加入95%乙醇純沉，經(jīng)4000 r/min離心20 min，真空冷凍干燥28 h，得大蒜粗多糖。

1.3.5 大蒜多糖體外抗氧化活性試驗(yàn)

1.3.5.1 大蒜多糖對(duì)O2-·自由基清除率的測(cè)定[14]

分別取濃度為0.10，0.20，0.30，0.40，0.50，0.60，0.70，0.80，0.90 mg/L多糖溶液各2.00 mL，依次加入3.0 mL 0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.2)于試管中，置于25 ℃水浴預(yù)熱20 min，加入2 mL 2.5 mmol/L鄰苯三酚溶液，充分混勻，25 ℃反應(yīng)5 min，加入2 mL 8%的鹽酸溶液終止反應(yīng)。以蒸餾水作空白試驗(yàn)，以相同質(zhì)量濃度的VC溶液作對(duì)比，在325 nm處測(cè)定吸光度。根據(jù)式(1)計(jì)算不同濃度的多糖溶液對(duì)O2-·的清除率。

清除率(P,%)=[1-(A1-A2)/A0]×100%。

式(1)

式中：A1為樣品的吸光度值，A2為對(duì)照的吸光度值，A0為空白品的吸光度值。

1.3.5.2 大蒜多糖對(duì) ·OH自由基清除率的測(cè)定

分別取濃度為0.10，0.20，0.30，0.40，0.50，0.60，0.70，0.80，0.90 mg/L多糖溶液各2.00 mL，依次向試管中加入1 mL Fe2+(9 mmol/L)、1 mL 水楊酸-乙醇(9 mmol/L)、1 mL H2O2(8.8 mmol/L)，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，以1 mL蒸餾水作空白，以相同質(zhì)量濃度的VC溶液作對(duì)比。根據(jù)式(2)計(jì)算不同濃度的多糖溶液對(duì)·OH的清除率。

清除率(P,%)=[1-(A1-A2)/A0]×100%。

式(2)

式中：A1為樣品的吸光度值，A2為對(duì)照的吸光度值，A0為空白品的吸光度值。

1.3.5.3 大蒜多糖對(duì)DPPH自由基清除率的測(cè)定[15]

分別取濃度為0.10，0.20，0.30，0.40，0.50，0.60，0.70，0.80，0.90 mg/L多糖溶液各2.00 mL，依次加入個(gè)加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液中，25 ℃反應(yīng)25 min后，在517 nm處測(cè)定吸光度。以蒸餾水作空白，以相同質(zhì)量濃度的VC溶液作對(duì)比，根據(jù)式(3)計(jì)算不同濃度的樣品溶液對(duì)DPPH的清除率。

清除率(P,%)=[1-(A1-A2)/A0]×100%。

式(3)

式中：A1為樣品的吸光度值，A2為對(duì)照的吸光度值，A0為空白品的吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)條件選擇

2.1.1 纖維素酶添加量對(duì)大蒜多糖得率的影響

圖1 纖維素酶添加量對(duì)大蒜多糖得率的影響Fig.1 Effect of cellulase additive amount on the yield of garlic polysaccharides

由圖1可知，纖維素酶添加量在0.5%～2.0%之間，大蒜多糖得率逐漸上升，在該范圍內(nèi)酶添加量越多，酶解效率越高，大蒜多糖越易從裂解細(xì)胞中溶出。添加量為2.0%時(shí)，多糖得率最高，為28.96%；酶量增至2.5%時(shí)，多糖得率下降，可能是酶濃度較高，底物濃度相對(duì)較小，酶分子過(guò)飽和，部分酶分子不能與底物結(jié)合，降低了酶解效率。因此，纖維素酶最佳添加量為2.0%。

2.1.2 果膠酶添加量對(duì)大蒜多糖得率的影響

圖2 果膠酶添加量對(duì)大蒜多糖得率的影響Fig.2 Effect of pectinase additive amount on the yield of garlic polysaccharides

由圖2可知，果膠酶添加量在0.5%～2.0%之間，大蒜多糖得率逐漸增加；果膠酶添加量為2.0%時(shí)，大蒜多糖得率最高，為28.84%，這時(shí)可能酶和底物濃度最適合，酶解效率最高，有利于多糖的溶出。因此，果膠酶最適添加量為2.0%。

2.1.3 酶解時(shí)間對(duì)大蒜多糖得率的影響

圖3 酶解時(shí)間對(duì)大蒜多糖得率的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis time on the yield of garlic polysaccharides

由圖3可知，隨著酶解時(shí)間的增加，大蒜多糖得率呈現(xiàn)先增后降的趨勢(shì)，160 min時(shí)多糖得率最高，為32.47%，隨后下降，可能是隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而降解。因此，最適宜的酶解時(shí)間為160 min。

2.1.4 酶解溫度對(duì)大蒜多糖得率的影響

圖4 酶解溫度對(duì)大蒜多糖得率的影響Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the yield of garlic polysaccharides

由圖4可知，溫度在35～50 ℃之間，大蒜多糖得率逐漸上升，在適宜的溫度范圍內(nèi)，升高溫度，酶解效率提高，促進(jìn)多糖從裂解的細(xì)胞中溶出，50 ℃時(shí)多糖得率最高，為30.47%，隨后下降，溫度過(guò)高，酶的活性受到抑制而失活。因此，最適宜的酶解溫度為50 ℃。

2.2 響應(yīng)曲面法優(yōu)化大蒜多糖的提取工藝

2.2.1 模型的建立與顯著性檢驗(yàn)

采用Box-Behnken試驗(yàn)，以纖維素酶添加量、果膠酶添加量、酶解時(shí)間、酶解溫度為變量，以大蒜多糖得率為響應(yīng)值，以-1，0，1分別代表變量的水平，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Results of response surface test design

續(xù) 表

用Design-Expert 8.0軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，得到大蒜多糖得率對(duì)纖維素酶添加量、果膠酶添加量、酶解時(shí)間、酶解溫度的回歸模型：

Y=34.81+0.012X1-0.068X2-0.34X3+0.042X4+1.44X1X3+0.093X1X4-0.098X2X3-0.42X2X4-0.29X3X4-2.24X12-2.30X22-2.61X32-1.41X42。

方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

續(xù) 表3

由表3方差分析結(jié)果可知，模型P<0.01，試驗(yàn)?zāi)Ｐ蜆O顯著，失擬項(xiàng)P=0.9731>0.05，失擬項(xiàng)不顯著；模型的決定系數(shù)R2=0.9925，校正決定系數(shù)RAdj2=0.9746，二者數(shù)值較為接近，表明該回歸方程擬合程度良好，用該模型分析和預(yù)測(cè)大蒜多糖的得率是可靠的。模型F值與對(duì)響應(yīng)值的影響成正比，F(xiàn)值越大，對(duì)響應(yīng)值的影響越大[16]，可見(jiàn)4個(gè)因素對(duì)大蒜多糖得率的影響大小依次為：酶解時(shí)間>纖維素酶添加量>酶解溫度>果膠酶添加量。

2.2.2 響應(yīng)曲面交互作用分析

a.果膠酶添加量與纖維素酶添加量交互作用對(duì)大蒜多糖得率影響的等高線圖和響應(yīng)曲面圖

b.果膠酶添加量與酶解溫度交互作用對(duì)大蒜多糖得率影響的等高線圖和響應(yīng)曲面圖

c.果膠酶添加量與酶解時(shí)間交互作用對(duì)大蒜多糖得率影響的等高線圖和響應(yīng)曲面圖

d.纖維素酶添加量與酶解溫度交互作用對(duì)大蒜多糖得率影響的等高線圖和響應(yīng)曲面圖

f.酶解時(shí)間與酶解溫度交互作用對(duì)大蒜多糖得率影響的等高線圖和響應(yīng)曲面圖圖5 因素交互作用對(duì)大蒜多糖得率影響的等高線圖和響應(yīng)曲面圖Fig.5 Contour plots and response surface plots of the effect of factor interaction on the yield of garlic polysaccharides

由響應(yīng)曲面圖可知，圖5中b，d，e接近橢圓形，故果膠酶添加量與溫度、纖維素酶添加量與溫度、纖維素酶添加量與時(shí)間的交互作用對(duì)大蒜多糖得率的影響較為顯著；圖5中a，c，f接近圓形，故果膠酶與纖維素酶添加量、果膠酶添加量與時(shí)間、酶解時(shí)間與溫度的交互作用對(duì)大蒜多糖得率的影響不顯著。

2.2.3 條件優(yōu)化與結(jié)果驗(yàn)證

根據(jù)建立回歸模型對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳提取工藝：纖維素酶添加量1.99%，果膠酶添加量1.96%，溫度49.65 ℃，時(shí)間160.48 min，在此提取條件下大蒜多糖的得率理論值為34.88%?？紤]到實(shí)際操作過(guò)程中的局限性，將提取工藝修改為：纖維素酶2.0%，果膠酶2.0%，溫度50 ℃，時(shí)間160 min。采用修正后的條件進(jìn)行試驗(yàn)，重復(fù)3次取平均值，大蒜多糖實(shí)際測(cè)定得率為34.76%，與預(yù)測(cè)值相差0.12%，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值存在較好的一致性。由此表明該回歸方程有很好的預(yù)測(cè)能力，可用于大蒜多糖的提取。

2.3 大蒜多糖體外抗氧化活性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 大蒜多糖對(duì)O2-·自由基的清除能力

圖6 大蒜多糖對(duì)O2-·自由基的清除能力Fig.6 The scavenging capacity of garlicpolysaccharides to O2-·

由圖6可知，隨著大蒜多糖濃度的增加，對(duì)O2-·自由基的清除能力增大。當(dāng)大蒜多糖濃度為0.6 mg/mL時(shí)，清除率為47.79%，VC清除率為79.65%，之后清除率變化緩慢。在相同質(zhì)量濃度下，VC對(duì)O2-·的清除率高于大蒜多糖。

2.3.2 大蒜多糖對(duì)·OH自由基的清除能力

圖7 大蒜多糖對(duì)·OH的清除能力Fig.7 The scavenging capacity of garlicpolysaccharides to·OH

由圖7可知，隨著大蒜多糖濃度的增加，對(duì)·OH自由基的清除能力增大。當(dāng)大蒜多糖濃度0.7 mg/mL時(shí)，清除率為49.84%，VC清除率為89.16%，之后清除率變化緩慢。在相同質(zhì)量濃度下，VC對(duì)·OH的清除率高于大蒜多糖。

2.3.3 大蒜多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力

圖8 大蒜多糖對(duì)于DPPH·的清除能力Fig.8 The scavenging capacity of garlicpolysaccharides to DPPH·

由圖8可知，隨著大蒜多糖濃度的增加，對(duì)DPPH自由基的清除能力隨之增大。當(dāng)大蒜濃度為0.7 mg/mL時(shí)，大蒜多糖的清除率為56.74%，VC清除率為82.76%，之后清除率變化緩慢。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)大蒜多糖提取工藝條件進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)曲面法設(shè)計(jì)，建立了大蒜多糖得率和各因素之間的數(shù)學(xué)模型，通過(guò)對(duì)回歸模型系數(shù)的顯著性分析，得到各因素之間的相互作用，影響大蒜多糖得率的因素大小順序?yàn)椋好附鈺r(shí)間>纖維素酶添加量>酶解溫度>果膠酶添加量。大蒜多糖最佳提取工藝參數(shù)為：纖維素酶2.0%，果膠酶2.0%，溫度50 ℃，時(shí)間160 min，大蒜多糖實(shí)際測(cè)定得率為34.76%，與預(yù)測(cè)值相差0.12%，存在較好的一致性。

大蒜多糖對(duì)O2-·、·OH和DPPH自由基均表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除能力，且隨其濃度的增加，清除能力增大，呈明顯的量效關(guān)系，相同質(zhì)量濃度大蒜多糖的清除效果低于Vc，但大蒜多糖作為活性成分來(lái)源于天然產(chǎn)物。因此，采用雙酶法提取的大蒜多糖具有良好的抗氧化活性，可作為天然綠色的抗氧化劑添加到食品中，具有廣闊的市場(chǎng)前景。