于麗欣 鄭樹東 孫 超 柏云會 楊加虎 陳晶亮 汪 騫 楊進成 林良斌

(云南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學與生物技術學院1，昆明 650201) (玉龍縣農(nóng)業(yè)技術推廣中心2，麗江 674100) (云南省農(nóng)業(yè)科學院園藝作物研究所3 ，昆明 650201) (玉溪市農(nóng)業(yè)科學研究院4，玉溪 653100)

菜籽油是一種營養(yǎng)保健的食用油，富含人體必需不飽和脂肪酸，特別是油酸達60%以上，越來越受到人們的青睞。但我國食用油仍有很大的缺口，而油菜(BrassicanapusL)是我國主要油料作物，發(fā)展油菜生產(chǎn)是保障我國食用油安全的有效途徑。提高菜籽含油量是當前油菜育種和栽培的主要目標之一。油菜種子中的油脂累積是一個十分復雜的生物學過程，涉及到光合作用、糖轉運、糖酵解、脂肪酸合成、油脂合成、油體形成等。例如光系統(tǒng)II BY蛋白(photosystem II BY，PSBY)和光系統(tǒng)II反應中心PSB28蛋白(photosystem II reaction center PSB28 protein，PSB28)參與了光合作用，對光系統(tǒng)II中間體的RC47分別起組裝保護和激活作用[1，2]；蔗糖轉運蛋白1(sucrose transporters 1，SUC1)和糖轉運蛋白12(sugertransportprotein 12，STP12)參與了糖轉運過程，將光合產(chǎn)物從“源”器官運輸至種子等“庫”器官中[3-4]；丙酮酸脫氫酶E1α(pyruvate dehydrogenase E1 α，PDH-E1α)和烯醇化酶1(enolase 1，ENO1)參與了糖酵解過程，PDH-E1α是丙酮酸脫氫酶復合物(pyruvate dehydrogenase complex, PDHC)的重要部分，PDHC進一步將丙酮酸脫氫脫羧，產(chǎn)生脂肪酸合成的原料乙酰輔酶A[5]，而ENO1為質(zhì)體內(nèi)的合成代謝過程提供烯醇式丙酮酸PEP，經(jīng)由丙酮酸激酶(pyruvate kinase)的催化，進而生成ATP以及丙酮酸[6]；以上這些與含油量的關系研究均鮮見報道。乙酰輔酶A羧化酶1(acetyl CoAcarboxylase 1，ACC1)參與了脂肪酸合成，它將乙酰輔酶A羧化丙二酸單酰輔酶A，是一個脂肪酸合成過程第一個限速酶，在油菜中過表達擬南芥ACC1基因，使T2代種子含油量增加約5%[7]。提高或抑制參與這些過程的酶或蛋白編碼基因的表達水平，將會影響油菜種子的含油量，這已被許多基因工程研究的結果所證實[8-16]。一些轉錄因子調(diào)控這些過程中相關基因的表達，從而調(diào)控植物種子的含油量[17-21]。一些基因表達和酶活性的研究結果也說明了這一點，如：甘油-3-磷酸脫氫酶基因BnGPDHc2-1、BnGPDHc2-2在高含油自交系30DAF的種子中的表達量顯著高于低油含量自交系的[22]；BnACC1基因在油菜種子成熟期的相對表達量與油脂積累呈現(xiàn)顯著正相關[23]；但BnDGAT1、BnPDAT1的qPCR分析說明其表達量與菜籽含油量并不呈現(xiàn)出一致的正相關，這可能與其取材的環(huán)境因素不一致有關；在30DAF后的油菜種子中G6PDH、ATP-檸檬酸裂解酶、ACCase、PPase、DGAT的酶活性與菜籽含油量呈顯著或極顯著正相關[24-27]。對油脂累積通路上的基因表達、酶活性與菜籽含油量相關性的研究僅涉及到幾個基因和酶。據(jù)不完全統(tǒng)計油脂累積通路上有幾百個基因參與，可能不同基因型材料的種子含油量分別是不同的基因在起關鍵作用。為此，我們選取轉錄組分析差異表達顯著(未發(fā)表)的PSB28、PSBY、SUC1、STP12、PDH-E1α、ENO1、ACC1等7個基因進行qPCR及其蛋白或酶活性分析，探究它們在不同含油量油菜品種的角果皮或種子中的表達水平與菜籽含油量的關系，為揭示油菜含油量的分子機制及油菜高含油量育種與栽培提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料為3個不同含油量的甘藍型油菜品種：ZY511，湘油15號，湘774，由云南農(nóng)業(yè)大學油菜研究室提供。其中ZY511為浙江農(nóng)科院選育的常規(guī)油菜品種，其原種含油量為50.21%；湘油15號和湘774為湖南農(nóng)業(yè)大學選育的常規(guī)油菜品種，其原種含油量分別為42%和37.32%。

1.2 方法

1.2.1 油菜種植與取樣

2018年10月，將3種油菜材料種植于云南農(nóng)業(yè)大學后山農(nóng)場同一塊實驗地，統(tǒng)一進行油菜常規(guī)栽培管理。油菜開花時，對健康、長勢一致的油菜植株的主花序上花蕾掛牌并標注日期。一定時間后同時從3個油菜品種上分別取開花后第23、33、43 d的角果，立即帶回實驗室。在冰浴條件下將種子和角果皮分離，隨即分裝，每管0.2 g，液氮速凍后-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 含油量與主要脂肪酸含量的測定

待成熟時收獲同一株的菜籽，曬干后除去雜質(zhì)，將干凈的油菜種子送至河南大學，用NIR 5000型近紅外光譜分析儀測定種子的含油量和主要脂肪酸的含量。

1.2.3 RNA樣品提取與檢測

RNA提取過程參照RNA提取試劑盒說明書，取1 μL RNA樣品于紫外分光光度計(Nano Drop ND-2000)檢測RNA的純度和濃度，記錄A260/280和A260/A230的吸光值；1%的瓊脂糖電泳檢測RNA。

1.2.4 實時熒光定量PCR的測定

將轉錄組分析獲得的基因序列在NCBI上進行Blast比對分析，用primer 5.0軟件根據(jù)基因特異序列設計引物，以便排除同源基因的干擾。以100 ng總RNA為模板，按照BestarqPCR RT Kit說明書配制20 μL逆轉錄反應體系，合成cDNA第一鏈，并保存?zhèn)溆?。Real time PCR 擴增的反應體系為20 μL(DBI Bestar?SybrGreenqPCRmasterMix)，程序為94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，40個循環(huán)，用Agilent Stratagene熒光定量PCR儀Mx3000P進行熒光定量PCR實驗，重復3次。相對表達量的計算公式為2-ΔΔct。

1.2.5 粗蛋白液的制備

從-80 ℃冰箱中取出材料放入預冷的研缽中，加液氮后迅速研磨成粉末，將粉末盡量全部轉移入10 mL離心管內(nèi)；加2 mL 4 ℃預冷的提取緩沖液(100 mmol/L Tris-HCl pH=7.3、5 mmol/L DTT、2 mmol/L EDTA、0.5 mmol/L PMSF、300 mmol/L甘油、0.01%體積Triton X-100)，振動2 min充分混勻，4 ℃靜置1 h；再加10 μL 0.5 mmol/L PMSF并混勻，4 ℃靜置1 h；4 ℃、4 000 r/min離心30 min，將上清液轉移至2 mL離心管中，用去離子水定容至2 mL，取200 μL粗蛋白液分裝至PCR管中，-80 ℃保存待用。

1.2.6 ELISA測定蛋白或酶活性

將粗蛋白液按公司試劑盒說明書并使用多功能酶標儀(VarioskanLUX)進行標準曲線制作及酶活性和蛋白含量測定，重復3次。每克鮮組織的酶活力及蛋白含量(U/g或ng/g)的計算公式為b/a×2 000÷0.2，其中a為樣品孔添加的粗蛋白液量，b為根據(jù)樣品孔所測得OD450值從標準曲線上獲得的粗蛋白液樣品的酶活力單位或蛋白量。

表1 不同油菜品種的種子含油量與脂肪酸含量/%

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

采用Excel 2010進行數(shù)據(jù)整理及作圖；采用SPSS統(tǒng)計分析軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同油菜品種的種子含油量及其脂肪酸含量分析

對不同油菜品種的種子含油量及其脂肪酸含量進行近紅外光譜分析儀檢測，結果(表1)表明供試油菜品種的種子含油量差異顯著，最高的是ZY511(43.38%)，其次為湘油15號(37.23%)，湘774含油量最低(34.75%)，但其含油量均低于原種4～7個百分點，這可能與油菜成熟期氣溫過高有關。供試油菜品種的油酸、亞油酸、飽和脂肪酸的含量在品種間差異顯著，但芥酸、亞麻酸的含量在品種間差異不顯著。并且油酸含量高的品種亞油酸含量低，油酸含量低的品種亞油酸含量高，這可能與油酸是亞油酸的底物有關。

2.2 種子中油脂累積相關基因的差異表達

為了探究STP12、PDH-E1α、ENO1、ACC1的表達與油菜含油量的關系，檢測了不同發(fā)育時期油菜種子中其RNA和蛋白水平。結果(圖1)表明隨著種子發(fā)育的進程4個基因表達水平均呈上升趨勢，而且43DAF時其RNA和蛋白質(zhì)水平與含油量呈現(xiàn)出一致的關系，即含油量高的材料中其表達水平也高，含油量低的其表達水平也低，表現(xiàn)為ZY511>湘油15號>湘774，而33DAF或之前的基因表達水平并不與含油量呈完全一致的關系，這表明30DAF～40DAF雖然是菜籽油脂累積的快速時期，但并不是菜籽含油量高低的決定時期，而種子發(fā)育的后期才可能是菜籽油脂積累的重要時期，基因表達水平?jīng)Q定著菜籽含油量的高低。但不同基因的表達模式存在一定的差異，STP12、PDH-E1α、ACC1的RNA水平隨著種子發(fā)育的進程顯著性增加，但增幅不到3倍，而ENO1的RNA水平在33DAF前的ZY511種子中增加不顯著，但到43DAF時急速增加，3個品種均增幅10倍以上。進一步分析發(fā)現(xiàn)23DAF、33DAF基因表達的RNA水平與蛋白水平在品種間呈現(xiàn)出不一致的現(xiàn)象，但43DAF則表現(xiàn)出一致性。如STP12的RNA水平在23DAF時湘油15號與ZY511差異不顯著，但其蛋白水平ZY511顯著低于湘油15號；33DAF時RNA水平差異顯著，即ZY511高于湘油15號，但其蛋白水平差異不顯著。PDH-E1α、ACC1的RNA水平在23DAF時3個品種間差異不顯著，但其蛋白水平差異顯著；33DAF時PDH-E1α的RNA水平在湘774與湘油15號間差異不顯著，但蛋白水平湘油15號顯著高于湘774；33DAF時ACC1的RNA水平ZY511顯著高于湘油15號，但其蛋白水平則反之，即湘油15號顯著高于ZY511。ENO1的RNA水平在33DAF時ZY511顯著低于湘油15號，但其蛋白水平ZY511顯著高于湘油15號。引起這種RNA水平與蛋白水平不一致現(xiàn)象的可能有兩個原因：一是不同品種的基因中簡并密碼子使用不同，同一氨基酸在一個品種的基因中使用偏愛密碼子，而在另一個品種的基因中使用限制密碼子，這樣即使RNA水平相同，但其翻譯速度不一樣，因此，蛋白水平不同；二是由于qPCR的引物是根據(jù)基因特異序列設計的，確保定量檢測的特異性。而蛋白檢測所用的抗體是植物類或擬南芥蛋白的抗體，酶聯(lián)免疫反應的特異性就會大大降低，ELISA檢測的是一類蛋白，而不是某個基因編碼的特異蛋白，如果在油菜種子發(fā)育早期有多個同源基因低水平表達，而在菜籽含油量決定期只是油脂累積的同源基因表達，就會導致早期(種子發(fā)育)檢測的RNA水平與蛋白水平不一致，而晚期(油脂累積)檢測的一致。

注：圖1中的abc均表示為各組多重比較的顯著水平為P<0.05。下同。圖1 油菜種子中油脂累積相關基因表達

2.3 角果皮中油脂累積相關基因差異表達

為探究油菜角果皮的光合作用與菜籽含油量的關系，本研究選取在不同含油量油菜品種角果皮中差異表達顯著的PSBY、PSB28和SUC1等基因進行RNA和蛋白水平定量檢測。結果(見圖2)表明隨著種子發(fā)育的進程3個基因表達水平均呈上升趨勢，而且43DAF時的RNA和蛋白水平與菜籽含油量均呈一致的關系，即含油量高的材料中其基因表達水平也高，含油量低的材料中其基因表達水平也低，表現(xiàn)為ZY511>湘油15號>湘774，但23DAF、33DAF時的RNA和蛋白水平與菜籽含油量呈現(xiàn)出不一致的關系，這些暗示了43DAF時光合產(chǎn)物和糖轉運是專為油脂合成的，而之前特別是23DAF的光合產(chǎn)物和糖轉運主要用于角果和種子的生長。3個基因的表達模式存在一定的差異，RNA水平都隨著種子發(fā)育的進程顯著性增加，但蛋白水平PSBY在湘774中呈下降再上升的趨勢，其他2個基因與RNA變化趨勢一致。此外，PSBY和PSB28的RNA水平增加緩慢，43DAF時最大的增幅也不超過6倍，而SUC1則快速增加，43DAF時3個品種均增幅10倍以上。進一步分析發(fā)現(xiàn)角果皮中基因表達的RNA水平與蛋白水平也與種子中基因表達一樣，均呈現(xiàn)出品種間不一致的現(xiàn)象。

圖2 油菜角果皮中油脂累積相關基因表達

3 討論

培育高含油量油菜品種是油菜育種的重要目標之一，也是油菜產(chǎn)業(yè)增收的重要方式。油脂累積通路上的基因表達水平影響著菜籽的含油量。本研究發(fā)現(xiàn)油脂累積通路上的基因表達隨著種子發(fā)育的進程均呈上升趨勢，這可能是因為DNA的甲基化水平隨著發(fā)育時期的進程其DNA去甲基化逐漸增強，從而導致基因表達水平呈上升趨勢。但33DAF或之前的基因表達水平與含油量并不呈完全一致的關系，而43DAF時基因表達水平與油菜種子含油量均呈現(xiàn)一致的關系，說明后期的基因表達水平與菜籽含油量密切相關，是決定油菜含油量的關鍵時期。這與劉祥含等[27]的研究結果一致，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、乙酰輔酶A羧化酶、磷脂酸磷酸酯酶、二酰甘油?；D移酶在油菜種子發(fā)育過程中隨著種子發(fā)育進程其酶活性均呈逐漸上升趨勢，38DAF時達到峰值，維持一定時間后再逐漸下降。陳玉萍等[24,28]研究表明油菜種子的含油量隨種子發(fā)育的進程呈上升趨勢，從25DAF到30DAF油分積累較慢，30DAF后油分積累較快，種子的含油量迅速上升，40DAF后油分積累減慢，含油量上升較慢。這說明了30DAF～40DAF是油脂快速累積時期，似乎與菜籽的含油量密切相關。本研究結果與其并不一致，可能是雖然30DAF～40DAF是菜籽油脂快速累積期，但并不是含油量的決定期。因此，這一時期的基因表達水平并不與含油量呈一致的關系。40DAF后才是油菜含油量的決定期，油脂累積通路上基因表達水平的高低決定了菜籽含油量的高低。本研究的qPCR檢測結果表明隨種子發(fā)育進程基因表達的RNA水平是逐漸上升的，這與虢慧等[29]研究結果不一致，她們發(fā)現(xiàn)在不同含油量油菜品種的種子發(fā)育過程中BnACC1、BnPDAT1、BnPDAT1的表達呈波浪式變化趨勢，這可能與取材時的環(huán)境條件不同有關。在本研究中還發(fā)現(xiàn)33DAF或之前的基因表達的RNA水平與蛋白水平不一致，這可能與蛋白檢測的ELISA法所選用的抗體特異性有關。由于本研究的ELISA試劑盒的抗體為植物或擬南芥某一蛋白的抗體，而不是油菜某一基因編碼蛋白的抗體，這樣抗原-抗體反應特異性就會降低，檢測到的可能是基因家族的同源基因的編碼蛋白，而不是某一基因編碼的特異蛋白，從而導致檢測結果的RNA水平與蛋白水平不一致。因此，在今后研究中，如要采用ELISA法檢測某一特異蛋白，應要通過基因工程的方法制備出這一基因的特異蛋白，然后去免疫動物獲得特異抗體。此外，甘藍型油菜是異源4倍體，幾乎在其基因組中每一功能基因都存在多個拷貝。因此，qPCR的引物設計需要格外注意其特異性，否則就會導致檢測結果的不準確。

4 結論

本研究利用qPCR和ELISA技術，以3個不同含油量的甘藍型油菜品種為材料，研究發(fā)現(xiàn)油脂累積通路上ACC1、ENO1、PDH-E1α、STP12、SUC1、PSB28、PSBY基因在種子和角果皮中的RNA和蛋白水平的表達量隨著種子發(fā)育的進程均呈上升趨勢，但在不同含油量品種中33DAF或之前的基因表達水平與菜籽含油量呈不完全一致的關系，而43DAF時基因表達水平與菜籽含油量均呈一致的關系，由此推斷種子發(fā)育后期的基因表達水平與菜籽含油量密切相關，是決定油菜含油量的關鍵時期。