陳振宇，黃啟林，孫紅玉，劉立業(yè)，文 藝

(西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 全軍普通外科中心， 四川 成都 610083)

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)是以胰腺及胰周組織廣泛壞死為主要特征，病情變化十分迅速的腹部急病，而早期出現(xiàn)的致命性全身炎性反應所造成的多器官功能障礙是患者死亡的主要病理基礎[1]。其中，胰腺炎相關的肝損傷(pancreatitis-associated liver injury, PALI)是SAP早期病程中最常見的胰外器官損傷，而繼發(fā)的肝功能損害甚至失代償是影響患者預后導致病死率增高的主要原因之一[2]。已證實，早期腹腔穿刺引流(abdominal paracentesis drainage, APD)是治療SAP及其并發(fā)癥的有效方法，前期的系列研究表明APD能明顯降低SAP的重癥化傾向，減輕全身炎性反應程度，對重要臟器起到保護作用，顯著改善患者預后，然而其具體的保護機制仍亟待進一步研究[3]。研究發(fā)現(xiàn)，Toll樣受體4(Toll-like receptor 4, TLR4)及其下游信號通路的激活會造成炎性反應的級聯(lián)放大效應，是PALI發(fā)生的重要機制。本研究擬采用逆行胰膽管注射?；悄懰徕c的方法建立SAP大鼠模型，觀察早期實施APD對肝臟TLR4表達的影響，并對其可能機制和意義進行初步探索。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和試劑

1.1.1 實驗動物：SPF級8～9周齡雄性SD大鼠30只，體質量190～210g[成都達碩動物科技有限公司提供，許可證號：SCXK(川)2004]。

1.1.2 試劑及試劑盒：90%純度牛磺膽酸鈉(Sigma-Aldrich公司)；TNF-α、IL-1β和HMGB1酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒(上海江萊生物科技有限公司)；一步法實時定量熒光PCR試劑盒(TaKaRa公司)；Trizol、全蛋白提取試劑盒和BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；兔抗大鼠TLR4多克隆抗體(GeneTex公司)；兔抗大鼠NF κB p65和p-p65單克隆抗體(Abcam公司)；小鼠抗大鼠GAPDH單克隆抗體、山羊抗兔和抗小鼠二抗(Proteintech公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物的分組和處理：將SD大鼠隨機分為假手術(sham)組、SAP組(用微量輸液泵向膽胰管輸入5%牛磺膽酸鈉溶液，劑量為0.1 mL/100 g，輸注速率為12 mL/h，壓力維持時間10 min，后腹腔注射少量抗生素關腹)和SAP+APD組(在成功制備SAP后，于右下腹接入引流管并固定于腹壁，外套金屬彈簧圈，引流管外接負壓吸引球，使用大鼠固定裝置限制其活動)，每組10只，24 h后取材檢測。

1.2.2 大鼠血清消化酶及肝功能相關指標的檢測：全自動生化分析儀檢測大鼠血清淀粉酶、脂肪酶、膽汁酸、總膽紅素、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)和天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)。

1.2.3 大鼠血清炎性因子的檢測：ELISA檢測大鼠TNF-α、IL-1β和HMGB1的水平，嚴格按照說明書操作，最后用酶標儀測定各孔450 nm處的吸光度值。

1.2.4 大鼠胰腺及肝臟組織病理改變的檢測:蘇木精/伊紅染色觀察肝臟和胰腺的病理學改變，胰腺病理評分參照參考文獻[4]，肝臟病理評分的方法參照參考文獻[5]。

1.2.5 實時熒光定量PCR檢測肝臟組織Toll樣受體4(TLR4)mRNA表達： Trizol法分離和純化RNA，嚴格按照說明書的步驟操作。用分光光度儀檢測總RNA 的含量和純度，A260/A280比值在1.8～2.1的RNA 樣本符合實驗要求。后按照一步法RT-qPCR 試劑要求配制25 μL的反應體系進行目標序列擴增，最后用Bio-Rad CFX軟件分析TLR4的mRNA的水平變化。各引物委托上海生物工程有限公司合成(表1)。

表1 PCR引物序列及反應條件Table 1 Sequences and conditions of primers in used in PCR

1.2.6 Western blot檢測肝臟組織TLR4、p65蛋白表達和p65磷酸化水平：組織勻漿離心后取上清，BCA法檢測其蛋白濃度，嚴格按照說明書操作，后與蛋白上樣緩沖液按1∶4比例混勻后煮沸變性。配置SDS-PAGE膠，每個樣本取50 μg總蛋白，電泳分離蛋白后轉移至PVDF纖維膜上，室溫封閉1 h，后分別加入兔抗TLR4多克隆抗體(1∶500)、兔抗p65單克隆抗體(1∶2 000)、兔抗p-p65單克隆抗體(1∶1 000)，4 ℃雜交過夜。次日，洗膜后室溫孵育二抗(1∶5 000)1 h，再次洗膜后滴加ECL化學發(fā)光液，應用UVP BioSpectrum 410 成像系統(tǒng)曝光并分析目標條帶吸光度值。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 各組大鼠胰腺組織HE染色和血清淀粉酶、脂肪酶檢測結果

與sham組相比，SAP組胰腺組織水腫，腺小葉結構紊亂，出現(xiàn)大片邊界不清的溶解壞死灶，炎性細胞浸潤明顯，病理評分明顯升高(P<0.05)；SAP+APD組胰腺病理改變較SAP組明顯減輕，胰腺小葉大體結構清晰，僅出現(xiàn)散在的點狀壞死灶，病理評分顯著降低(P<0.05)。同時，SAP組大鼠血清淀粉酶和脂肪酶活性較sham組明顯升高，而SAP+APD組上述指標較SAP組明顯降低(P<0.05)(圖1，表2)。

Arrows show necrotic pancreatic tissue圖1 各組大鼠胰腺組織HE染色Fig 1 Pancreatic tissue of rats in each group by HE staining

表2 APD對胰腺病理評分、血清淀粉酶和脂肪酶活性的影響Table 2 Effect of APD on pancreatic pathological score, serum amylase and lipase n=6)

2.2 各組大鼠血清炎性介質的檢測結果

SAP大鼠血清炎性介質TNF-α、IL-1β和HMGB1水平較sham組明顯升高(P<0.05)。APD治療后，SAP大鼠上述指標的血清水平明顯降低(P<0.05)(表3)。

表3 APD對血清TNF-α、IL-1β和HMGB1水平的影響Table 3 Effect of APD on serum levels of TNF-α, IL-1β

2.3 各組大鼠肝臟HE染色及肝功能指標的檢測結果

與sham組相比，SAP大鼠肝臟組織腫脹明顯，肝竇間隙變窄，部分區(qū)域可見肝細胞排列紊亂，細胞邊界不清，胞質內出現(xiàn)空泡，胞核固縮，病理評分明顯升高(P<0.05)。肝功能指標如血清AST、ALT、總膽紅素和膽汁酸水平也明顯升高(P<0.05)。APD治療后，SAP大鼠肝臟病理損傷明顯減輕，病理評分和血清肝功能指標的水平均顯著降低(P<0.05)(圖2，表4)。

Arrows show hepatocytes with lightly stained cytoplasm圖2 各組大鼠肝臟組織HE染色Fig 2 Liver tissue of rats in each group by HE staining

表4 APD血清肝功能相關指標的影響Table 4 Effect of APD on serum indexes related to liver n=6)

2.4 各組大鼠肝臟TLR4 mRNA和蛋白表達的檢測結果

與sham組相比，SAP組大鼠肝臟組織TLR4 的mRNA和蛋白表達均明顯升高(P<0.05)。而SAP+APD組大鼠肝臟組織TLR4的表達較SAP組明顯降低(P<0.05)(圖3)。

A.mRNA expression of TLR4 was detected using RT-qPCR; B.protein expression of TLR4 indicated by Western blot; C.densitometry analysis of TLR4; *P<0.05 compared with sham group；#P<0.05 compared with SAP group圖3 RT-qPCR檢測肝臟組織TLR4 mRNA的表達，Western blot 檢測其蛋白表達Fig 3 Expression of TLR4 mRNA in liver tissues was measured by RT-qPCR, the protein expression was detected

2.5 各組大鼠肝臟p65、TNF-α和IL-1β的檢測結果

SAP大鼠肝臟組織p65的蛋白表達和磷酸化水平較sham組明顯升高，同時TNF-α和IL-1β的表達也顯著升高(P<0.05)。而APD治療后能顯著降低SAP大鼠肝臟p65的蛋白表達和磷酸化水平，以及TNF-α和IL-1β的表達(P<0.05)(圖4,表5)。

A.protein expression and phosphorylation levels of p65 indicated by Western blot assay; B.analysis of densitometry ratio between p65 and p-p65; *P<0.05 compared with sham group； #P<0.05 compared with SAP group圖4 Western blot 檢測肝臟組織p65蛋白表達和磷酸化水平Fig 4 Expression and phosphorylation levels of p65 protein in liver tissues were detected by Western blot

表5 APD對肝臟組織TNF-α、IL-1β表達的影響Table 5 Effect of APD on TNF-α and IL-1β expression

3 討論

據(jù)報道，超過80%的重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)患者可出現(xiàn)短時間或持續(xù)的肝功能異常，而胰腺炎相關肝損傷(pancreatitis-associated liver injury, PALI)的發(fā)生與SAP早期炎性反應失控密切相關[6]。因此，及時有效的降低全身炎性介質水平，有望減輕PALI的嚴重程度。

在SAP早期，腹腔內可出現(xiàn)程度不等的胰腺炎相關性腹水(pancreatitis-associated ascitic fluid, PAAF)，其在SAP重癥化中的作用已逐漸被人們所認識[7]。然而目前國內外關于急性胰腺炎的治療指南均未對PAAF提出具體的處理意見，針對此，前期的研究表明通過腹腔穿刺引流(abdominal paracentesis drainage, APD)及時去除PAAF是SAP治療中的重要環(huán)節(jié)[3]。已證實，APD能明顯減輕全身炎性反應程度，發(fā)揮重要臟器的保護作用(有效性)；其次，APD并不會增加患者腹腔感染的發(fā)生率(安全性)[8]。本研究中，APD能明顯減輕SAP大鼠胰腺組織的壞死程度，降低循環(huán)中多種炎性介質的水平。而伴隨炎性反應程度的減輕，治療組大鼠肝臟的病理損傷有明顯改善。與之對應，反映肝功能的血清指標如AST、ALT、總膽紅素和膽汁酸水平在治療組也明顯降低，表明APD具有顯著的肝功能保護作用。

Toll樣受體4(Toll-like receptor 4, TLR4)是模式識別受體家族成員之一，在誘導機體炎性反應中發(fā)揮著重要作用[9]。TLR4的激活不僅參與了SAP炎性反應的級聯(lián)放大，在PALI中同樣扮演著重要角色[10]。TLR4的表達在SAP大鼠肝臟中明顯升高[11]，而敲除TLR4后能明顯抑制下游NF-κB炎性信號通路的激活，減輕PALI的程度[12]。以上表明TLR4及其下游信號通路的激活是PALI發(fā)生的重要機制。本研究中，治療組大鼠肝臟TLR4/NF-κB信號通路重要蛋白以及TNF-α、IL-1β的表達均顯著低于SAP組，表明APD能通過抑制TLR4/NF-κB軸的激活減少促炎細胞因子的合成和釋放，發(fā)揮肝臟保護作用。而TLR4信號通路的激活需要與其特異性的配體結合，其中高遷移率族蛋白B1(high mobility group box-1 protein, HMGB1)是TLR4最重要的天然配體[13]。SAP時，HMGB1主要來源于腹腔，可通過腹膜重吸收等途徑進入循環(huán)，與胰外器官功能障礙的發(fā)生密切相關[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，通過實施APD能有效降低循環(huán)中的HMGB1水平，推測其可能與APD抑制肝臟TLR4的激活有關。然而兩者是否有直接的效應關系，尚需進一步研究。

綜上，早期實施APD引流出PAAF能顯著減少SAP大鼠肝臟TLR4的表達，進而有效抑制下游NF-κB炎性信號通路的激活及促炎細胞因子的合成和釋放，發(fā)揮肝功能保護作用。