王曉艷，杜 虹，王 偉，權(quán)會(huì)琴

(空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院 傳染科， 陜西 西安 710038)

原發(fā)性肝癌目前位于全球腫瘤相關(guān)死亡原因的第4位。肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)占原發(fā)性肝癌的90%，主要?dú)w因于慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)感染、酗酒和代謝綜合征[1-2]。其中，HBV引起的慢性乙型肝炎是肝癌發(fā)生的最常見病因。乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein, HBx)是一種多功能調(diào)節(jié)因子，可促進(jìn)肝細(xì)胞的致癌轉(zhuǎn)化[3]。雖然HBx在HCC致病中的作用已有廣泛研究，但HBx調(diào)控HCC進(jìn)展的分子機(jī)制仍未完全闡明。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路廣泛參與到胚胎發(fā)育、穩(wěn)態(tài)維持和腫瘤發(fā)生等多種過程，包括肝癌在內(nèi)的多種癌中均已觀察到Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異?；罨痆4]。研究提示DKK2基因及其表觀遺傳沉默在Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活化和HCC中發(fā)揮關(guān)鍵作用，但HBx是否通過表觀遺傳調(diào)控影響DKK2的表達(dá)尚不明確。本研究主要探討肝癌細(xì)胞系中HBV X蛋白對(duì)DKK2表達(dá)的影響及其機(jī)制，為闡明HBV相關(guān)HCC的發(fā)生機(jī)制及干預(yù)治療靶點(diǎn)的探索提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌細(xì)胞系SMMC7721和HepG2均為本實(shí)驗(yàn)室保存。Ad-HBx由重慶醫(yī)科大學(xué)感染性疾病分子生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，構(gòu)建方法見參考文獻(xiàn)[5]。GFP腺病毒(Ad-GFP)由漢恒生物公司合成；siDnmt1腺病毒(Ad-siDnmt1)由上海生工生物公司制備；小干擾RNA siDnmt3a(西安擎科澤西生物科技有限公司)；PCR引物由上海生工生物公司合成；反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用羅氏Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit；DKK2抗體(Abcam公司)；Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b抗體(CST公司)；羊抗兔HRP(西安壯志生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)及分組處理：將SMMC7721細(xì)胞和HepG2細(xì)胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃ 5% CO2，隨后以1×105個(gè)/mL的濃度鋪于6孔板的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，貼壁后加入 Ad-GFP(MOI=10)和Ad-HBx(MOI=30)進(jìn)行感染，24 h后在顯微鏡下觀察其熒光強(qiáng)度，48 h后棄去培養(yǎng)基并收集細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。同時(shí)用1 μmol/L DAC處理細(xì)胞，或用Ad-siDnmt1(MOI=10)感染細(xì)胞，利用X-TremeGENE siRNA試劑轉(zhuǎn)染小干擾RNA siDnmt3a，48 h后收樣。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)HBx基因RNA：利用1 mL Trizol試劑裂解細(xì)胞，每管中加入200 μL三氯甲烷，4 ℃ 12 000 r/min離心1 h，吸上清于新的Ep管中；每管中加入等量的異丙醇，-20 ℃沉淀過夜；4 ℃ 12 000 r/min離心1 h，棄上清；每管中加入1 mL的75%無水乙醇，4 ℃ 12 000 r/min離心1 h，棄上清；晾干后加入20 μL的DEPC水溶解RNA；用ScanDrop定量?jī)x測(cè)定RNA濃度。隨后利用羅氏反轉(zhuǎn)錄試劑盒將1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照說明書中各組份的使用量在冰上配制20 μL RT反應(yīng)混合液，反應(yīng)條件為：50 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min。靶基因的mRNA水平使用MIX試劑在羅氏Cobas 480上進(jìn)行檢測(cè)。GAPDH作為內(nèi)部參照，最后使用2-△△Ct法計(jì)算各基因相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 Western blot檢測(cè)DKK2及甲基化轉(zhuǎn)移酶蛋白：采用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。隨后用12% SDS-PAGE膠分離蛋白，每孔上樣量20 μg；250 mA恒流將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜；5%脫脂牛奶室溫封閉2 h；一抗(1∶800)孵育4 ℃過夜；TBST清洗PVDF膜3次；加入羊抗兔HRP二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h；TBST洗滌后，加入底物發(fā)光劑 ECL 1 mL，在暗室用單層透明薄膜包裹后曝光膠片；拍照，利用Image J軟件進(jìn)行蛋白定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Ad-HBx在肝癌細(xì)胞中感染效率

Ad-HBx感染肝癌細(xì)胞后，其中HepG2細(xì)胞感染效率達(dá)95%以上，SMMC7721細(xì)胞感染效率達(dá)90%以上。RT-qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Ad-HBx感染肝癌細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組相比，在HepG2和SMMC7721細(xì)胞中，HBx mRNA相對(duì)表達(dá)倍數(shù)分別上調(diào)61.12倍和50.24倍(P<0.05)(圖1)。

A.efficiency of infection as detected by GFP expression using fluorescence microscopy in HepG2 and SMMC7721; B.the mRNA expression levels of HBx was detected by quantitative real-time PCR; *P<0.05 compared with Ad-GFP圖1 Ad-HBx在肝癌細(xì)胞中的感染效率Fig 1 Infective efficiency of Ad-HBx in hepatocellular

2.2 HBx下調(diào)DKK2的表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，與Ad-GFP感染組相比，在HepG2和SMMC7721細(xì)胞中，Ad-HBx感染組中DKK2的表達(dá)均下降。通過軟件量化分析條帶發(fā)現(xiàn)，HepG2和SMMC7721細(xì)胞Ad-HBx感染組中DKK2蛋白表達(dá)分別下調(diào)1.61倍(P<0.05)和3.33倍(P<0.05)(圖2)。

A.DKK2 expression at protein level was tested by Western blot; B.protein bands and quantitative analysis of DKK2 expression; *P<0.05 compared with Ad-GFP圖2 HepG2和SMMC7721細(xì)胞中HBx對(duì)DKK2的表達(dá)影響Fig 2 Effect of HBx on DKK2 expression in HepG2

2.3 HBx上調(diào)甲基化轉(zhuǎn)移酶Dnmt1和Dnmt3a的表達(dá)

相較于Ad-GFP感染組，Ad-HBx感染細(xì)胞系后，DKK2的蛋白表達(dá)水平下調(diào)2.65倍(P<0.05)，Dnmt1上調(diào)3.15倍(P<0.05)；Dnmt3a上調(diào)1.96倍(P<0.05)，相較于Ad-HBx感染組，DAC處理后DKK2蛋白表達(dá)水平上調(diào)2.27倍(P<0.05)；Dnmt1下調(diào)1.34倍， Dnmt3a下調(diào)1.78倍(P<0.05)(圖3)。

A.after 1 μmol/L DAC treatment, the expression of DKK2,Dnmt1,Dnmt3a and Dnmt3b protein level was detected by Western blot; B.protein bands and quantitative analysis of DKK2,Dnmt1,Dnmt3a and Dnmt3b expression; *P<0.05 compared with Ad-GFP圖3 SMMC7721細(xì)胞中HBx對(duì)DKK2、Dnmts的表達(dá)影響及DAC處理細(xì)胞后各蛋白的變化情況Fig 3 Influence of HBx on the expression of DKK2 and Dnmts and the changes of each protein after DAC treatment

2.4 沉默Dnmts后DKK2的表達(dá)水平部分恢復(fù)

相較于Ad-HBx處理組，Ad-siDnmt1組中DKK2蛋白表達(dá)水平上調(diào)5.21倍(P<0.05)，si-Dnmt3a組中DKK2蛋白表達(dá)水平上調(diào)1.98倍(P<0.05)(圖4)。

A.the protein expression of DKK2 after treatment with siDnmt1; B.the protein expression of DKK2 after treatment with siDnmt3a; *P<0.05 compared with Ad-GFP圖4 SMMC7721細(xì)胞中Dnmt1和Dnmt3a對(duì)DKK2表達(dá)的影響Fig 4 Effect of Dnmt1 and Dnmt3a on DKK2 expression in SMMC7721

3 討論

HBV病毒感染引起的慢性乙型肝炎是肝癌發(fā)生的常見致病因素，其編碼的蛋白眾多，其中以X蛋白的研究最為廣泛深入。既往研究發(fā)現(xiàn)HBx的反式激活功能可以對(duì)體內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)發(fā)揮重要作用，影響基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)和細(xì)胞分裂或增殖，從而在肝癌的發(fā)生進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6]。DKK2是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的負(fù)性調(diào)節(jié)因子， 已發(fā)現(xiàn)其在包括肝癌、腎癌、皮膚癌、不同星形腸癌等多種腫瘤中可出現(xiàn)異常表達(dá)[7-8]。然而，HBx是否通過影響DKK2的表達(dá)而導(dǎo)致肝癌的發(fā)生，目前仍不清楚。

本研究首次發(fā)現(xiàn)HBx引起DKK2在肝癌細(xì)胞系中表達(dá)下降，應(yīng)用甲基化酶抑制劑處理肝癌細(xì)胞后DKK2表達(dá)有所上調(diào)，表明DKK2可能由于表觀遺傳修飾而被抑制。肝癌的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及多種表觀遺傳異常。其中，啟動(dòng)子DNA甲基化是一種主要的表觀遺傳事件，導(dǎo)致肝癌中眾多抑癌基因的沉默。抑癌基因甲基化水平升高是肝癌的一個(gè)重要標(biāo)志，并與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。有研究認(rèn)為，相較于人正常肝組織，在肝癌組織中DKK3 mRNA表達(dá)水平降低，甲基化發(fā)生率、甲基化水平更高，提示DKK3啟動(dòng)子高甲基化可能是肝硬化向肝癌轉(zhuǎn)變的一個(gè)重要事件[9]。HBx通過甲基化沉默腫瘤組織中的SFRP1和SFRP5的表達(dá)，激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，促進(jìn)肝癌進(jìn)展的發(fā)生[10]。

DNA甲基化是主要由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(Dnmts)家族產(chǎn)生和維持的可逆化過程，抑制Dnmts可以作為治療腫瘤的靶標(biāo)[11]。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶家族包括Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b，其中Dnmt1負(fù)責(zé)維持甲基化，可作用于幾乎所有體細(xì)胞中存在的半甲基化底物上。研究顯示，腫瘤組織中Dnmt1的表達(dá)相比于非腫瘤組織有所升高[12]。本研究觀察到HepG2細(xì)胞系中DKK2的下調(diào)和甲基化轉(zhuǎn)移酶Dnmt1的過表達(dá)呈正相關(guān)，這與既往研究結(jié)果一致。Dnmt1或Dnmt3a的沉默幾乎完全消除了HBx誘導(dǎo)腫瘤抑制基因的DNA甲基化的潛力[13]，表明HBx對(duì)腫瘤抑制基因的啟動(dòng)子過度甲基化需要這兩種酶的調(diào)控。其原因可能為HBx通過E2F位點(diǎn)上調(diào)啟動(dòng)子活性來激活Dnmt 1的表達(dá)[14]。此外，Dnmt抑制劑通常通過上調(diào)腫瘤抑制因子如p14、p16和p21來抑制細(xì)胞增殖[15]。由于抑制Dnmt可導(dǎo)致高甲基化基因的去甲基化，因此推測(cè)Wnt通路負(fù)調(diào)節(jié)因子的高甲基化所致的基因下調(diào)可能是Wnt/β-catenin活化的原因之一。Wnt/β-catenin下游通路分子(如β-catenin、c-Myc、cyclin-D1等)的變化有待于進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

本研究表明HBx可通過調(diào)控DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1,3a來下調(diào)DKK2的表達(dá)，進(jìn)而從表觀遺傳學(xué)的角度初步闡明了HBV相關(guān)肝癌的可能發(fā)生機(jī)制，為干預(yù)治療靶點(diǎn)的探索提供了新的理論依據(jù)。