景 麗，史 文，曹 雨，劉瑞賽，劉 璐，李建宇，劉 輝*

(1. 天津市第三中心醫(yī)院 肝膽疾病研究所 天津市重癥疾病體外生命支持重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 天津 300170；2.嘉思特華劍醫(yī)療器材(天津)有限公司 天津市骨植入物界面功能化與個(gè)性化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 天津 300190)

人工關(guān)節(jié)假體的設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)一直是國(guó)內(nèi)外醫(yī)療器材領(lǐng)域的研發(fā)熱點(diǎn)，其中研發(fā)的關(guān)鍵問(wèn)題是如何選擇具有骨組織相容性的生物醫(yī)用材料。鈦合金材料由于具有突出的耐腐蝕性、較低的彈性模量及良好的生物相容性，成為近年來(lái)眾多生物醫(yī)用金屬材料的首選[1-2]。3D打印技術(shù)是一種與傳統(tǒng)加工方法截然不同的增材制造工藝，此工藝主要基于三維數(shù)據(jù)逐層打印出所需的實(shí)體模型，利用3D打印技術(shù)可以快速并準(zhǔn)確地制作出滿(mǎn)足設(shè)計(jì)要求的開(kāi)發(fā)產(chǎn)品[3]。本課題組將鈦合金材料(Ti6Al4V)用于骨關(guān)節(jié)假體的設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)，利用3D打印技術(shù)將鈦合金粉料逐層疊加，并通過(guò)其內(nèi)部設(shè)計(jì)的多孔結(jié)構(gòu)，優(yōu)化其材料的彈性模量，提高材料的細(xì)胞黏附性，旨在提高鈦合金假體材料與骨組織的整合性與相容性，從而滿(mǎn)足患者對(duì)假體生存率的要求。

本課題組前期通過(guò)阿卡姆公司的工業(yè)級(jí)金屬3D打印機(jī)，利用電子束熔成型技術(shù) (electron beam melting, EBM)，設(shè)計(jì)了3種拓?fù)鋯卧亩嗫租伜辖鸫蛴〗Y(jié)構(gòu)，使其多孔結(jié)構(gòu)的孔徑、孔隙率及彈性模量均利于骨組織的細(xì)胞長(zhǎng)入與血管化要求。但作為金屬材料，鈦合金植入人體后也會(huì)析出一些金屬離子，這些金屬離子進(jìn)入體液后可能會(huì)對(duì)人體造成損傷。因此，本實(shí)驗(yàn)是在前期研究基礎(chǔ)上，制備上述3種拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)多孔鈦合金材料的浸提液，并用于成骨細(xì)胞(osteoblast，OB)的體外培養(yǎng)，通過(guò)檢測(cè)材料浸提液孵育下成骨細(xì)胞的增殖與分化活性，觀察3D打印鈦合金多孔材料的生物安全性。

1 材料與方法

1.1 材料

利用阿卡姆工業(yè)級(jí)金屬3D打印機(jī)(Q20PLUS， Arcam公司)；MC3T3-E1成骨細(xì)胞系(中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù))。

DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶(Gibco公司)；細(xì)胞增殖MTT試劑(上海麥克林生化科技有限公司)；HE染色試劑、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)檢測(cè)試劑盒(北京雷根生物技術(shù)有限公司)；I型膠原(collagen I，Col Ⅰ)免疫熒光染色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞系傳代培養(yǎng)：將成骨細(xì)胞系進(jìn)行體外培養(yǎng)，加入DMEM高糖培養(yǎng)基，添加1.5 g/L NaHCO3、43.2 mg/L肌醇、8.82 mg/L葉酸、7.8 mg/L β-巰基乙醇，加入10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清，置于6孔板內(nèi)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，傳至第2代用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 制備材料浸提液：通過(guò)電子束熔融成型(EBM)技術(shù)，在真空環(huán)境中采用電子束作為熱源來(lái)逐層融化鈦合金金屬粉末，以增材制造的工藝方法3D打印3種拓?fù)鋯卧Y(jié)構(gòu)的鈦合金多孔支架材料。三維鈦合金打印試樣及最小單元拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)如圖所示(圖1)，3種拓?fù)鋯卧Y(jié)構(gòu)分別為3D打印庫(kù)中2.0 mm、2.25 mm及2.5 mm的Dode-Medium單元結(jié)構(gòu)，各試件的尺寸保持一致，均為20 mm×20 mm×3.5 mm。3種鈦合金多孔材料的絲徑約300 μm，孔徑800～1 000 μm，孔隙率75%～80%，彈性模量440～760 MPa。

A.three-dimensional titanium alloy porous scaffold；B. minimum unit topology圖1 3D打印成型的鈦合金多孔材料及單元拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)Fig 1 3D-printed titanium alloy porous material and its topological structure

將3D打印的鈦合金多孔支架材料置于醫(yī)用高壓鍋中，高溫、高壓滅菌消毒后，按照材料表面積/浸提液體積=(1 cm×1 cm)/1.25 mL的標(biāo)準(zhǔn)[4]，將鈦合金多孔支架材料完全浸泡于DMEM培養(yǎng)液中，并置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中浸提，3種拓?fù)鋯卧嗫撞牧系慕釙r(shí)間都分設(shè)24、48、72及96 h，到達(dá)各浸提時(shí)間后，利用渦流振蕩器進(jìn)行振蕩，吸取各組材料浸提液并過(guò)濾除菌，無(wú)菌保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 細(xì)胞增殖活力測(cè)定：將傳代的成骨細(xì)胞系進(jìn)行胰蛋白酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×103個(gè)/L，接種于96孔板，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。待細(xì)胞完全貼壁后，在每孔中添加100 μL鈦合金多孔材料浸提液，作為各材料浸提液組，每組設(shè)6個(gè)細(xì)胞復(fù)孔；另設(shè)6個(gè)細(xì)胞復(fù)孔，添加100 μL DMEM培養(yǎng)液，作為陰性對(duì)照組；再設(shè)6個(gè)細(xì)胞復(fù)孔，添加100 μL 2.5%二甲基亞砜(dimethyl sulfoxid，DMSO)溶液，作為陽(yáng)性對(duì)照組。將各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h，取出培養(yǎng)板，每孔加入20 μL MTT(5 g/L)，于培養(yǎng)箱中孵育4 h，終止培養(yǎng)，倒板，加入150 μL DMSO溶液裂解，振搖15 min后，用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)490 nm處，測(cè)定各孔吸光度(A)值。并通過(guò)各組細(xì)胞的A值，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率(RGR=實(shí)驗(yàn)組吸光度值/陰性對(duì)照組吸光度值×100%)。依據(jù)細(xì)胞毒性評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)[5]，對(duì)各組材料的細(xì)胞毒性進(jìn)行評(píng)估：相對(duì)增殖率(relative growth rate， RGR)≥100%為0級(jí)，75%～99%為l級(jí)，50%～74%為2級(jí)，25%～49%為3級(jí)，1%～24%為4級(jí)，0為5級(jí)，細(xì)胞毒性分級(jí)程度≤1為無(wú)毒性。

1.2.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)HE染色：用6孔板接種傳代的成骨細(xì)胞系，經(jīng)各組材料浸提液、DMEM培養(yǎng)液(陰性對(duì)照)、2.5% DMSO溶液(陽(yáng)性對(duì)照)孵育后，棄去上清并用PBS沖洗，加入95%乙醇固定(15 min)，蒸餾水浸洗，蘇木精染色(5 min)，蒸餾水浸洗，稀鹽酸酒精溶液快速分色后，淡氨水返藍(lán)(5 min)，蒸餾水浸洗，伊紅染色(10 min)，經(jīng)乙醇梯度脫水、二甲苯透明后，用中性樹(shù)膠封片，置于光學(xué)顯微鏡下照相。

1.2.5 細(xì)胞堿性磷酸酶ALP活性測(cè)定：用24孔板接種傳代的成骨細(xì)胞系，經(jīng)各組材料浸提液、DMEM培養(yǎng)液(陰性對(duì)照)、2.5% DMSO溶液(陽(yáng)性對(duì)照)孵育后，取各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液200 μL，利用微板法于520 nm處測(cè)定ALP活性，具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.6 細(xì)胞免疫熒光染色：經(jīng)各組材料浸提液、DMEM培養(yǎng)液(陰性對(duì)照)、2.5% DMSO溶液(陽(yáng)性對(duì)照)孵育后，棄去上清用PBS沖洗，4%多聚甲醛固定(20 min)，PBS洗后，0.5% Triton X-100孵育(30 min)，PBS洗，加入1% BSA封閉(30 min)，滴加Col Ⅰ一抗工作液(1∶200)，4 ℃過(guò)夜，PBS沖洗，避光條件下加入熒光標(biāo)記的二抗工作液(1∶400)，室溫孵育(60 min)，棄去染液，PBS潤(rùn)洗3次，熒光顯微鏡觀察并攝片，使用Image pro-Plus(IPP)軟件進(jìn)行圖像分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖活力及材料毒性評(píng)價(jià)

各組材料浸提液孵育的成骨細(xì)胞增殖活躍，各浸提時(shí)間點(diǎn)下3組鈦合金多孔材料的細(xì)胞A值，與DMEM陰性對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異，而DMSO陽(yáng)性對(duì)照組孵育的成骨細(xì)胞A值顯著下降 (P<0.01) (圖2)。計(jì)算各組細(xì)胞的相對(duì)增殖率(RGR)，并依據(jù)細(xì)胞RGR評(píng)估各組材料浸提液的細(xì)胞毒性，結(jié)果顯示各組浸提液的細(xì)胞毒性程度均≤1 (表1)。

*P<0.01 compared with each extract experimental group；A.2.0 mm material extract group; B.2.25 mm material extract group; C.2.5 mm material extract group圖2 各組成骨細(xì)胞的增殖活力Fig 2 Cell proliferation activity of osteoblasts in each n=6)

表1 各材料浸提液組成骨細(xì)胞的相對(duì)增殖率Table 1 The relative growth rate (RGR) of osteoblasts in each extract n=6)

2.2 細(xì)胞HE染色結(jié)果

各組材料浸提液孵育后，可見(jiàn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛、增殖活躍，細(xì)胞貼壁伸展、分布均勻，形態(tài)呈梭形、三角形或多角形，細(xì)胞間突起明顯，成鋪路石樣排列連接。各材料浸提液組與DMEM陰性對(duì)照組比較，成骨細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)同步，細(xì)胞形態(tài)無(wú)顯著改變。DMSO細(xì)胞毒陽(yáng)性對(duì)照組中，可見(jiàn)成骨細(xì)胞的數(shù)量顯著減少，胞質(zhì)皺縮，胞體固縮變小，細(xì)胞間突起縮短或消失，細(xì)胞間連接斷裂 (圖3)。

圖3 各組成骨細(xì)胞的HE染色結(jié)果 Fig 3 HE staining of osteoblasts in each group (×400)

2.3 細(xì)胞ALP活性檢測(cè)結(jié)果

各組材料浸提液孵育后，成骨細(xì)胞分泌的ALP活性為7.97～9.13 U/L。各浸提時(shí)間點(diǎn)下3組鈦合金多孔材料的細(xì)胞ALP活性與DMEM陰性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而DMSO陽(yáng)性對(duì)照組孵育的成骨細(xì)胞ALP活性顯著降低 (P<0.01) (圖4)。

*P<0.01 compared with each extract experimental group；A.24 hous material extract group; B.48 hous material extract group; C.72 hous material extract group; D.96 hous material extract group圖4 各組成骨細(xì)胞的ALP活性Fig 4 ALP activity of osteoblasts in each n=6)

2.4 細(xì)胞Col Ⅰ熒光染色結(jié)果

各組成骨細(xì)胞的I型膠原蛋白(Col Ⅰ)陽(yáng)性表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，呈紅色熒光均勻分布。各浸提時(shí)間點(diǎn)下3組鈦合金多孔材料的Col Ⅰ陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)面積與DMEM陰性對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異，而DMSO陽(yáng)性對(duì)照組中Col Ⅰ陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)面積顯著減少 (P<0.01) (圖5，6)。

圖5 各組成骨細(xì)胞的Col Ⅰ免疫熒光染色 Fig 5 Col Ⅰ immunofluorescence staining of osteoblasts in each group (×400)

*P<0.01 compared with each extract experimental group; A.24 hours material extract group; B.48 hours material extract group; C.72 hours material extract group; D.96 hours material extract group圖6 各組成骨細(xì)胞的Col Ⅰ表達(dá)水平Fig 6 Expression level of Col Ⅰ in osteoblasts of each n=6)

3 討論

在目前的骨植入研究中，常用的金屬植入材料主要包括不銹鋼、鈷合金及鈦合金等。其中，鈦合金材料具有耐腐蝕性高、力學(xué)性能好、彈性模量低、生物相容性佳等優(yōu)點(diǎn)，成為植入領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用的生物醫(yī)用材料[6]。以往金屬材料的加工工藝常采用傳統(tǒng)的機(jī)械加工方式，不但工藝復(fù)雜、周期長(zhǎng)、難度高，而且很難達(dá)到“個(gè)性化定制”的設(shè)計(jì)要求[7]。3D打印技術(shù)作為一種新興的增材制造工藝，可以快速并準(zhǔn)確地制備出滿(mǎn)足個(gè)體設(shè)計(jì)要求的金屬植入材料的技術(shù)要求及安全性等方面尚缺乏權(quán)威的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

本課題組前期通過(guò)阿卡姆金屬3D打印機(jī)，以EBM技術(shù)打印了3種拓?fù)鋯卧拟伜辖鸲嗫撞牧?，使其結(jié)構(gòu)參數(shù)與力學(xué)性能滿(mǎn)足骨長(zhǎng)入及血管化要求。同時(shí)，經(jīng)過(guò)前期體外離子析出實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)鈦合金打印材料在浸提3～4 d內(nèi)，鈦、鋁、釩3種金屬離子析出量快速增加，而這些離子可能會(huì)對(duì)人體造成損傷。因此，為了評(píng)價(jià)上述3種拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)鈦合金打印材料的生物安全性，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)制備各組鈦合金多孔材料的浸提液，用于成骨細(xì)胞系MC3T3-E1的體外培養(yǎng)，觀察各材料浸提液對(duì)成骨細(xì)胞增殖與分化活性的影響。

本實(shí)驗(yàn)首先從形態(tài)學(xué)方面，通過(guò)HE染色觀察各材料浸提液孵育下成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各組材料浸提液并不影響成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)，成骨細(xì)胞依然貼壁牢固，并顯示良好的增殖活性，與DMEM孵育的陰性對(duì)照組比較，各組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)無(wú)差異。MTT實(shí)驗(yàn)是通過(guò)檢測(cè)線(xiàn)粒體呼吸鏈的琥珀酸脫氫酶活性，反映細(xì)胞增殖活力的檢測(cè)技術(shù)。本課題組通過(guò)MTT法檢測(cè)各材料浸提液組成骨細(xì)胞的增殖活力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各組材料浸提液并不減緩成骨細(xì)胞的增殖速度，與DMEM孵育的陰性對(duì)照組比較，各組細(xì)胞增殖率無(wú)顯著差異，同時(shí)通過(guò)計(jì)算其相對(duì)增殖率，評(píng)價(jià)各組材料的細(xì)胞毒性，結(jié)果提示3D打印的3種鈦合金多孔材料對(duì)成骨細(xì)胞無(wú)毒性。

ALP是成骨細(xì)胞早期分化的重要標(biāo)志物，在骨重建中發(fā)揮水解磷酸脂的作用，促使磷酸基團(tuán)與鈣離子結(jié)合，啟動(dòng)骨組織的鈣化過(guò)程，從而促進(jìn)新生骨的形成[9-10]。Col Ⅰ是骨基質(zhì)的主要組成部分，是由成骨細(xì)胞分泌的特異性膠原蛋白，成骨細(xì)胞礦化功能的實(shí)現(xiàn)依賴(lài)Col Ⅰ蛋白形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[11-12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各組鈦合金多孔材料浸提液并不影響成骨細(xì)胞的ALP分泌和Col Ⅰ表達(dá)，且與DMEM陰性對(duì)照組成骨細(xì)胞比較無(wú)顯著差異，提示3種鈦合金多孔材料不會(huì)影響成骨細(xì)胞的分化活性。

綜上所述，本課題組設(shè)計(jì)的3種鈦合金多孔打印材料，其浸提液對(duì)成骨細(xì)胞的增殖與分化活性無(wú)影響，顯示其良好的生物安全性。誠(chéng)然本實(shí)驗(yàn)還存在一定的局限性，由于體外浸提實(shí)驗(yàn)的周期較短，無(wú)法觀察金屬材料長(zhǎng)期植入的生物安全性。因此，本課題組將通過(guò)動(dòng)物原位植入實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證鈦合金多孔材料對(duì)骨組織細(xì)胞的生物安全性。