王 悅 郭愷辰 田雪蒙 趙文昌 凱迪日耶·色提瓦力迪 高瑞霞*

1(西安交通大學化學學院，西安 710049) 2(西安奕斯偉硅片技術有限公司，西安 710077) 3(西安交通大學醫(yī)學部，西安710061)

1 引 言

雌二醇(Estradiol，E2)是一種常見的環(huán)境內分泌干擾物[1]，環(huán)境水中的E2可以通過生物積累進入食物鏈。對人類、家畜及野生動物而言，適量的E2可促進生殖器官的發(fā)育，但若過度累積則會給健康和生殖帶來不良影響[2,3]。因此，環(huán)境水樣品中E2的準確檢測具有重要意義。常用的檢測方法有高效液相色譜-質譜法[4,5]、毛細管電泳法[6]等。但是，由于環(huán)境水樣品基質復雜、干擾物質種類繁多，且E2處于痕量水平(ng/L)，不易直接被分析儀器準確檢測[7]，在檢測前需對樣品進行預處理。固相萃取技術因具有簡單、快速、溶劑用量少等優(yōu)點而成為較為普遍采用的樣品前處理技術[8]。然而，傳統(tǒng)固相萃取劑對目標物的特異性吸附能力較低[9]，因此有必要開發(fā)一種新型吸附劑，用于選擇性分離和富集環(huán)境水樣品中的E2。

磁性分子印跡聚合物將表面分子印跡技術與磁性納米顆粒相結合，不僅可實現(xiàn)快速分離，還具有制備可預定性、高選擇性、無模板泄露、傳質速率快等優(yōu)點，是理想的固相萃取劑，已被廣泛應用于分離材料[10]、藥物傳輸[11]、模擬抗體[12]和生物化學傳感器[13]等領域。以磁性分子印跡聚合物為固相萃取劑，對環(huán)境水樣品中痕量E2進行吸附的研究已有文獻報道。Zhu等[14]以丙烯酰胺和2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸為功能單體，制備了磁性分子印跡聚合物，用于選擇性識別和提取環(huán)境水樣品中的E2。Ming等[15]以甲基丙烯酸為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，2,2’-偶氮二異丁腈為引發(fā)劑，合成核-殼結構的磁性印跡材料，實現(xiàn)了環(huán)境水樣品中E2的檢測。盡管這些磁性分子印跡聚合物在分離方面展現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢，但由于親水性功能單體種類有限、聚合物多在有機相中制備等，導致其與水的相溶性差，對環(huán)境水樣品中E2提取效率低。開發(fā)新的親水性功能單體是解決該問題的重要途徑之一。

苯胺(AN)廉價易得，富含氨基、羥基和苯環(huán)，是印跡聚合物最常用的功能單體。Wen等[16]以Fe3O4為載體，苯胺為功能單體，肌酸酐為模板分子，通過表面分子印跡技術合成親水的磁性分子印跡聚合物，實現(xiàn)了對人血漿和尿液中肌酸酐的高效吸附。Han等[17]以修飾了Fe3O4的石墨烯為載體，在其表面包覆聚苯胺印跡層，所得印跡聚合物對飲料中的目標物表現(xiàn)出良好的吸附性能。親水性功能單體苯胺可通過氫鍵和π-π等非共價相互作用與E2相結合，以其為功能單體制備的磁性分子印跡聚合物有望實現(xiàn)對環(huán)境水樣品中E2的選擇性吸附。

基于此，本研究以苯胺為功能單體，羧基磁球為載體，E2為模板分子，過硫酸銨為引發(fā)劑，采用固定模板印跡策略，制備了核-殼式雌二醇磁性分子印跡聚合物(MIPs-E2)，用于選擇性識別環(huán)境水樣品中的E2。采用透射電子顯微鏡、傅里葉紅外光譜儀、X射線衍射儀和振動樣品磁強計等進行表征，證明所合成的材料粒徑均一、分散性好、晶型結構穩(wěn)定且具有超順磁性。動力學吸附、等溫吸附、選擇性吸附和重復利用性實驗進一步證明，所得材料對E2吸附量大、傳質速率快、選擇性高、可重復利用性好。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

LC-2130高效液相色譜儀(日本日立公司); JEM-2100透射電子顯微鏡(日本JEOL公司); LDJ 9600-1振動樣品磁強計(美國LDJ Electronics公司); D/max/2500v/pc X射線衍射儀(日本Rigaku公司); AVATAR 330傅里葉變換紅外光譜儀(美國Nicolet公司); HY-2調速多用振蕩器(上海強運科技有限公司); AWL-0502-U艾科浦超純水系統(tǒng)(重慶頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司)。

FeCl3·6H2O(分析純，天津市福晨化學試劑廠); 聚丙烯酸鈉(SPA，分析純，成都市科龍化工試劑廠); 乙二醇(EG)、二甘醇(DEG)、乙酸(HAc)、HCl(37%)、無水乙酸鈉(NaOAc)和乙醇(Ethanol)(分析純，天津市富宇精細化工有限公司); 分析純雌二醇(E2)、苯胺(AN)、過硫酸銨(APS)、己烯雌酚(DES)、雌三醇(E3)和雌酮(E1)(Sigma-Aldrich化學試劑公司)。實驗用水為超純水(18.2 MΩ cm)。

2.2 羧基磁球(Fe3O4-COOH)的制備

采用文獻[18]的方法制備Fe3O4-COOH。將0.51 g FeCl3·6H2O、2.03 g NaOAc、0.05 g SPA混合，再加入7 mL EG和15 mL DEG，超聲混勻，在高壓反應釜中200℃下反應12 h，自然冷卻至室溫。產(chǎn)物用超純水洗滌至上清液澄清，40℃下真空干燥至恒重，即得到Fe3O4-COOH。

2.3 雌二醇磁性分子印跡聚合物(MIPs-E2)和非分子印跡聚合物(NIPs)的制備

將200 mg Fe3O4-COOH和30 mg E2溶于50 mL超純水中，攪拌30 min。依次加入200 mg AN、70 mg APS和4 mL HCl，室溫下攪拌反應24 h。所得產(chǎn)物用超純水洗滌至上清液澄清，40℃真空干燥至恒重。以乙醇-乙酸(95:5，V/V)為洗脫劑去除聚合物中的E2，直至用HPLC-UV在洗脫液中檢測不出E2，即得MIPs-E2。NIPs的制備除不加E2之外，其它步驟與制備MIPs-E2相同。

2.4 MIPs-E2的吸附性能考察

2.4.1 動力學吸附實驗將10 mg MIPs-E2和NIPs分別置于5 mL 0.35 mg/mL E2乙醇溶液中，室溫下分別振蕩1、5、15、20、30、40和50 min 后，磁性分離，采用HPLC-UV測定上清液中E2的濃度[19]。

2.4.2 等溫吸附實驗將10 mg MIPs-E2和NIPs分別置于5 mL 含E2的乙醇溶液(濃度分別為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45和0.50 mg/mL)，室溫下振蕩30 min后，磁性分離，采用HPLC-UV測定上清液中E2的濃度。

2.4.3 選擇性吸附實驗將10 mg MIPs-E2和NIPs分別置于5 mL含E2、E1、E3和DES的乙醇溶液(濃度均為0.35 mg/mL)，室溫下振蕩30 min后，磁性分離，用HPLC-UV測定上清液中E2的濃度。

2.4.4 重復利用性實驗將10 mg MIPs-E2和NIPs分別置于5 mL 0.35 mg/mL E2乙醇溶液中，室溫下振蕩30 min后，磁性分離，用洗脫液將吸附材料中的E2洗脫完全，將洗脫后的MIPs-E2再次置于相同濃度的E2溶液中。如此重復實驗6次。

2.4.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯著性分析采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，所有數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，呈正態(tài)性分布及方差齊性的計量數(shù)據(jù)以x±s表示，多組間數(shù)據(jù)比較首先采用單因素方差分析，經(jīng)檢驗后，若差異有顯著統(tǒng)計學意義，再采用LSD-t對組間進行兩兩比較， 兩組間的數(shù)據(jù)比較采用兩個獨立樣本進行T檢驗。p<0.05，認為有顯著性統(tǒng)計學差異。

3 結果與討論

3.1 MIPs-E2的制備

本研究結合表面分子印跡技術和磁性分離技術，在水相中制備了MIPs-E2(如圖1所示)。首先，采用溶劑熱法制備Fe3O4-COOH磁性納米粒子[18]，通過氫鍵作用將模板分子E2固定在其表面; 然后，以AN為功能單體，APS為引發(fā)劑，在形成印跡層的同時，通過氫鍵和π-π相互作用將模板分子E2再次固定; 最后，采用乙醇-乙酸(95∶5，V/V)作為洗脫液去除印跡層中的E2; 得到MIPs-E2。

圖1 MIPs-E2的制備過程Fig.1 Synthesis process of MIPs-E2MIPs-E2: Magnetic molecularly imprinted polymers of estradiol; SPA: Sodium polyacrylate; EG: Ethylene glycol; DEG: Diethylene glycol; E2: Estradiol; AN: Aniline; APS: Ammonium peroxysulfate

為獲得最佳印跡效果，對制備MIPs-E2時APS和AN的用量比、AN的用量及聚合時間進行了考察。固定AN的量為200 mg，改變APS的用量，使APS和AN的質量比分別為1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2和1∶3, 考察吸附量(Adsorption capacity,Q)和印跡因子(Imprinting factor, IF)。

IF=QMIPs/QNIPs

(1)

其中,QNIPs和QNIPs(mg/g)分別代表MIPs-E2和NIPs對目標物的吸咐量。如圖2A所示，Q和IF隨著AN比例的增加而先增加后減小，當APS和AN的比例為1:1.5(w/w)時達到最大值。這可能是因為過量的APS導致體系活動中心相對較多，不利于生成高分子量的聚苯胺，且聚苯胺的過氧化程度增加[20]，不利于形成有效印跡位點; 當APS與AN的比例為1∶1.5(w/w)時，交聯(lián)程度最佳，有效的印跡位點數(shù)目最多; 隨著AN比例繼續(xù)增加，由于APS的量相對過少，導致聚苯胺產(chǎn)率較低。被包覆在聚苯胺印跡層內的E2數(shù)量有限，有效印跡位點的數(shù)目減少。NIPs對E2的吸附量隨著AN比例的增加而增大，這可能是由于NIPs與E2的結合是非特異性結合，隨著交聯(lián)程度減小，聚苯胺的過氧化程度減小，材料表面所暴露的官能團更加豐富，非特異性吸附增加。實驗結果表明，APS和AN的最佳質量比為1∶1.5。在APS和AN的最佳質量比下，選擇AN的用量為100、150、200、250和300 mg，進行考察(圖2B)。

圖2 APS和AN的用量比(A)、AN用量(B)和時間(C)的影響(* p<0.05， ** p<0.01， *** p<0.001，以MIPs-E2對E2的最大吸附量為對照組)Fig.2 Effect of the mass ratio of APS to AN (A), amount of AN (B), and polymerization time (C) on imprinting performance of MIPs-E2 and NIPs (* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, vs. control group of the maximum adsorption capacity of MIPs-E2 for E2)NIPs: Non-imprinted polymers; Q: Adsorption capacity; IF: Imprinting factor

Q和IF隨著AN用量的增加而增加，且當AN用量為200 mg時，Q和IF達到最大值，表明隨著AN的增加，更多的E2與AN相結合，形成的印跡位點增多; 當AN的用量大于200 mg時，Q和IF逐漸減小，這可能是因為過多的AN會形成較厚的印跡層，E2不易被洗脫，且洗脫后，E2也不易接近識別位點，導致吸附效果不佳。實驗結果表明，AN的最佳用量為200 mg。

在APS和AN最佳質量及AN最佳用量下，選取聚合時間為12、18、24、30和36 h進行考察(圖2C)。聚合時間小于24 h時，Q和IF較小，這可能是因為較短的聚合時間導致印跡層內印跡位點數(shù)目較少; 聚合時間為24 h時，Q和IF最大，E2與AN充分作用，印跡層內形成足夠多的印跡位點; 聚合時間大于24 h時，Q和IF變小，這可能是由于過長的聚合時間導致AN過度自聚，印跡位點被包埋于其中，E2難以洗脫，且洗脫后重吸附時，E2難以到達包埋較深的印跡位點。因此，選擇最佳聚合時間為24 h。

圖3 Fe3O4-COOH (A)和MIPs-E2(B)的透射電鏡圖Fig.3 Transmission electron microscope (TEM) images of Fe3O4-COOH (A) and MIPs-E2 (B)

3.2 材料表征

圖3為Fe3O4-COOH和MIPs-E2的透射電鏡(TEM)圖。由圖3A可見，F(xiàn)e3O4-COOH呈類球狀，分散性較好，粒徑約為100 nm且較均一。圖3B顯示，F(xiàn)e3O4-COOH表面包覆有約6 nm的印跡層，證明成功合成了MIPs-E2。所形成的較薄印跡層有利于E2在吸附液和MIPs-E2表面的傳質，使E2更易接近印跡位點，達到快速吸附的效果。

圖4B為所得磁性納米材料的X射線衍射(XRD)圖。兩個樣品中均能觀察到Fe3O4的6個特征峰(2θ=30.38°、35.58°、43.14°、53.48°、57.08°和62.66°)，與2θ值相對應的峰位置指數(shù)分別是(220)、(311)、(400)、(422)、(511)和(440)[22]，與JCPDS卡(19-629)中Fe3O4的數(shù)據(jù)一致。相較于Fe3O4-COOH，MIPs-E2峰的位置并沒有明顯改變，說明印跡層的包覆并未破壞Fe3O4的晶型結構。

對Fe3O4-COOH和MIPs-E2的磁學性能進行了考察。由圖4C可知，F(xiàn)e3O4-COOH和MIPs-E2的飽和磁化強度值分別為81.60和74.93 emu/g。在外加磁場作用下，可實現(xiàn)MIPs-E2與吸附液的快速分離。

圖4 Fe3O4-COOH(a)和MIPs-E2(b)的紅外光譜(A)、X射線衍射(B)和磁滯回線(C)圖Fig.4 Fourier transform infrared (FT-IR) spectra(A), X-ray diffraction (XRD) patterns (B), and magnetization curves (C) images of Fe3O4-COOH (a) and MIPs-E2 (b)

3.3 材料的吸附性能

3.3.1 動力學和等溫吸附性能動力學吸附曲線如圖5A所示。0～5 min，MIPs-E2對E2的吸附過程為快速吸附，隨著吸附時間延長，印跡位點逐漸被占據(jù)，在30 min達到吸附平衡。采用準一級及準二級動力學方程對動力學吸附數(shù)據(jù)進行擬合:

ln(Qe-Qf)=lnQe-k1t

(2)

(3)

其中，Qt(mg/g)為MIPs-E2或NIPs在t時刻對E2的吸附量，t(min)為吸附時間，k1(g/mg min)和k2(g/mg min)分別為準一級和準二級動力學常數(shù)，Qe(mg/g)為平衡時聚合物對E2的理論吸附量。MIPs-E2和NIPs的動力學吸附數(shù)據(jù)擬合結果見表1。相較于準一級動力學方程，MIPs-E2和NIPs的準二級動力學方程的相關系數(shù)均大于0.99，說明所制備的聚合物對E2的吸附更符合準二級動力學模型，化學吸附是其對E2吸附的決速步驟[23]。

表1 MIPs-E2和NIPs對E2的動力學吸附擬合參數(shù)

如圖5B所示，當E2濃度低于0.35 mg/mL時，隨著吸附液中E2濃度的增大，MIPs-E2對E2的吸附量顯著增加; 當吸附液中E2的濃度為0.35 mg/mL時，印跡位點被完全占據(jù)，吸附達到動態(tài)平衡。此外，MIPs-E2對E2的最大吸附量(21.34 mg/g)遠大于NIPs(7.90 mg/g)，這是因為NIPs對E2的吸附僅有非特異性吸附，而MIPs-E2對E2具有特異性識別位點，可通過特異性和非特異性兩種吸附方式吸附更多E2。用Langmuir及Freundlich等溫吸附模型分析MIPs-E2和NIPs對E2的等溫吸附數(shù)據(jù)，模型方程式如下:

(4)

lgQ=mlgCe+lgKF

(5)

式中，Q(mg/g)和Qmax(mg/g)分別為MIPs-E2或NIPs對E2的平衡吸附量和表觀最大吸附量，Ce(mg/mL)為平衡時E2在吸附溶液中的濃度，KL(mL/mg)和KF(mg/g)分別為Langmuir和Freundlich模型吸附平衡常數(shù)，m是Freundlich方程中的指數(shù)，代表體系的不均勻度。由表2可知，相較于Freundlich等溫吸附方程，MIPs-E2和NIPs Langmuir等溫吸附方程的相關系數(shù)均大于0.99，說明MIPs-E2和NIPs對E2的吸附更符合Langmuir等溫吸附模型，屬于單層吸附系統(tǒng)[24]。

圖5 MIPs-E2和NIPs的動力學(A)和等溫(B)吸附曲線(* p<0.05， ** p<0.01， *** p<0.001，以相同時間或濃度下NIPs對E2的吸附量為對照組)Fig.5 Adsorption kinetic (A) and isothermal (B) absorption curves of MIPs-E2 and NIPs for E2(* p<0.05， ** p<0.01， *** p<0.001, vs. control group of the adsorption capacity of NIPs for E2 at the same time or concentration)

表2 MIPs-E2和NIPs對E2的等溫吸附擬合參數(shù)

3.3.2 材料的選擇性吸附性能選擇性吸附能力是評價材料印跡效果的一個重要指標[25,26]，通常采用IF和選擇性因子(SC)評價，計算公式如下:

(6)

其中， IFTEM和IFCOM分別代表聚合物對E2和其競爭物的印跡因子。

圖6 MIPs-E2和NIPs對E2、雌三醇(E3)、雌酮(E1)和己烯雌酚(DES)的選擇性吸附性能(**p<0.01， 以MIPs-E2對E2的吸附量為對照組)Fig.6 Adsorption selectivity of MIPs-E2 and NIPs towards E2, Estriol (E3), estrone (E1), and diethylstilbestrol (DES) (**p<0.01, vs. control group of the adsorption capacity of MIPs-E2 for E2)

本研究選擇與E2結構類似的常見共存物E1、E3和DES作為競爭物，對MIPs-E2和NIPs的選擇性吸附性能進行考察。由表3和圖6可知，MIPs-E2對E2的吸附量(Q=21.34 mg/g)和印跡因子(IF=2.65)均高于對其競爭物，說明MIPs-E2中印跡位點的空間結構、形狀大小和化學官能團與E2高度匹配。值得注意的是，在3種競爭物中，MIPs-E2對E3的吸附效果優(yōu)于E1和DES，這是因為E3結構與E2高度相似，均含有苯環(huán)與五元環(huán)，可與AN產(chǎn)生較強的π-π相互作用，且五元環(huán)上連有的羥基增加了與AN之間的氫鍵作用。NIPs對E2及其競爭物E1、E3和DES的吸附基本沒有差別，這是因為NIPs對目標物的吸附作用為非特異性吸附。實驗結果表明，MIPs-E2對E2的選擇性高，印跡效果明顯。

表3 MIPs-E2和NIPs對E2、E3、E1和DES的吸附量(Q)、印跡因子(IF)及選擇性因子(SC)

3.3.3 材料的重復利用性能重復利用性也是評價印跡材料優(yōu)劣的重要指標。本研究選用同一個聚合物進行6次吸附-解吸附實驗，對MIPs-E2和NIPs的重復利用性進行考察。隨著重復利用次數(shù)增多，MIPs-E2對E2的吸附量相對減少。重復使用6次后，MIPs-E2對E2的吸附量仍然可達到初始吸附量的93.4%，說明所制備的MIPs-E2具有良好的重復利用性。

4 結 論

采用Fe3O4-COOH為載體，E2為模板分子，AN為功能單體，APS為引發(fā)劑，結合表面分子印跡技術和磁性分離的優(yōu)勢，制備了對E2具有選擇性識別能力的新型磁性分子印跡聚合物MIPs-E2。通過TEM、FT-IR、XRD和VSM對制備的磁性納米材料進行表征，并通過等溫吸附、動力學吸附、選擇性吸附和重復利用性實驗對所得磁性納米材料的特異性識別能力和穩(wěn)定性進行考察。結果表明，所得MIPs-E2不僅表現(xiàn)出良好的形貌和高的飽和磁化強度，還具有較快的動力學吸附速率、較高的吸附量及良好的選擇性和重復利用性能，可望應用于環(huán)境水樣品中痕量E2的檢測。