郭 佳 劉金華 楊照微 李 毅 何成彥*

1(吉林大學中日聯誼醫(yī)院，長春 130033) 2(吉林大學口腔醫(yī)院，長春 130022)

1 引 言

腎癌起源于腎小管上皮細胞，是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一[1]。目前，借助超聲、CT、MRI等醫(yī)學影像技術，可以對一部分腎癌進行有效診斷，進而給予相應的治療[2]。然而，某些患者確診時，已經處于腎癌晚期。由于晚期腎癌對化學療法或放射療法都不敏感，因而對其治療的有效手段非常有限[3]。對于晚期腎癌特異性的有效診療分子靶標的認知還遠遠不夠。隨著基因組學、蛋白質組學等高通量技術的發(fā)展[4～6]，對腎癌、特別是晚期腎癌進行基因、蛋白水平的整體表征成為可能。目前，大多數利用高通量技術對腎癌的研究主要采用基因組學和轉錄組學技術手段，致力于評估已知的參與腎癌致癌作用的基因以及化學療法的毒性和療效方面[7～9]。蛋白質是細胞和生物體功能的重要執(zhí)行者，蛋白質組學已成為基因組學和轉錄組學的重要補充技術手段[10,11]。因此，通過蛋白質組學方法研究腎癌發(fā)生和發(fā)展的分子機制有可能獲得與疾病密切相關的診療分子靶標[12,13]。已有的腎癌蛋白質組學的研究報道多采用各種腎癌的細胞系[14,15]，雖然這些永生化的細胞系來源于腎癌患者的手術切除組織、血清、以及尿液，但是為了適應全新的體外環(huán)境，在馴化誘導過程中，細胞內的某些基因蛋白質表達會發(fā)生變化。因此，直接以腎癌組織樣本為研究對象，分析其蛋白質整體表達輪廓，所得結果更能反映在腫瘤微環(huán)境中細胞內真實的蛋白表達情況。

非標記蛋白質組分析技術是蛋白質組學技術中重要的分析策略之一[16～19]，具有樣本處理操作簡單、實驗成本低、不受研究樣本種類和規(guī)模等方面的限制等優(yōu)點，越來越多的被應用在臨床大隊列樣本的蛋白質組學研究中。非標記蛋白質組分析技術主要基于實驗產生的一級質譜(MS1)和二級質譜(MS2)數據，對其進行特征提取、鑒定信息整合、定量分析，完成蛋白質水平的相對定量分析。其中，基于MS1數據的定量方法主要依據MS1相關的肽段峰強度(MS1 peak intensity)、峰面積(Peak area)、液相色譜保留時間(Retention time)等特征信息進行定量分析[20]。而基于MS2數據的定量方法則分為兩種: 一種依據每個蛋白鑒定得到的肽段所對應譜圖的數量，對該蛋白質在體系中的相對豐度進行定量分析，也稱譜圖計數法(Spectral count)[21]; 另一種則依據每個蛋白鑒定得到的肽段所對應MS2的離子強度總和，對該蛋白質進行相對定量分析，也稱MS2 TIC (Total ion current)法[22]。

本研究利用基于MS2數據的非標記定量蛋白質組學方法，對晚期腎透明細胞癌和正常腎臟組織樣本進行了蛋白質組學分析。采用譜圖計數和MS2 TIC兩種數據處理方法分別對采集的質譜數據進行分析，并對兩種方法所得結果進行比較。采用MS1數據對所得的定量分析結果進行了驗證。篩選出的差異蛋白可作為晚期腎透明細胞癌診治、預后判斷的候選標志物，為尋找新的治療靶點提供了基礎數據。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Easy-nLC1000納升液相色譜系統(tǒng)、 Q Exactive質譜儀和Varioskan酶標儀(美國Thermo Scientific公司); Allegra TM X-22R離心機、 Optima L-100K超速離心機(美國Beckman Coulter公司); 離心干燥機(德國Christ公司)。

BCA蛋白定量試劑盒、Pierce C18吸頭(100μL)(美國Thermo Scientific公司); 測序級TPCK修飾的胰蛋白酶(美國Promega公司); 碳酸氫銨、尿素、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、二硫蘇糖醇(DTT)、三氟乙酸(TFA)、碘乙酰胺(IAA)、甲酸、乙腈、苯甲基磺酰氟(PMSF)購自美國Sigma公司; 其它試劑均為國產分析純。實驗用水為經MilliQ純水儀(美國Millipore公司)制備的超純水。

2.2 實驗方法

2.2.1 蛋白質提取3例腎透明細胞癌組織樣本、3例來源于同一患者的腎臟正常組織樣本取自吉林大學中日聯誼醫(yī)院就診并手術治療的晚期腎透明細胞癌患者。所有患者均知情同意，且在進行根治性腎切除術之前未接受任何放療或化療。標本離體后，置于無菌培養(yǎng)皿中用磷酸鹽緩沖液沖洗、切碎，再放入液氮中研磨。然后使用含有8 mol/L尿素、 50 mmol/L Tris 和 50 mmol/L DTT、 1 mmol/L PMSF 的緩沖液提取蛋白質。蛋白質提取液經100000 g離心1 h， 去除不溶解成分。使用BCA方法測定樣品蛋白質濃度，并用蛋白提取緩沖液將所有樣品的蛋白質濃度調整為一致。取等量的腎透明細胞癌樣品混合，作為腫瘤樣本(Tumor); 取等量的腎臟正常組織樣品混合，作為正常對照樣本(Normal)。所有樣品分裝后， 置于-80℃保存。

2.2.2 蛋白質酶切處理蛋白質樣品從冰箱中取出，室溫融化后，用100 mmol/L NH4HCO3稀釋， 使尿素濃度低于2 mol/L。酶切時，首先加入20 mmol/L DTT， 在56℃下還原1 h，在常溫避光條件下用50 mmol/L IAA烷基化30 min，然后按1∶50 (w/w)比例加入測序級胰酶，37℃酶切過夜。向酶切后的樣品中加入終濃度為1%的甲酸，終止酶解反應。肽段混合物經17000 g離心15 min, 去除不溶解成分，并用Pierce C18吸頭脫鹽。然后將純化的酶解肽段混合物離心干燥，于-80℃保存。

2.2.3 納升毛細管液相色譜與質譜聯用分析將腫瘤樣品和正常組織樣品分別溶解在緩沖液A(水-乙腈-甲酸, 99∶1∶0.1，V/V)中，采用 Easy-nLC 1000納升液相色譜系統(tǒng)進行分離。每個樣品重復分析5次。 C18毛細管色譜柱(150 mm×0.075 mm， 3 μm)為實驗室自制[23]。流動相 B為乙腈-水-甲酸(99∶1∶0.1，V/V)，梯度洗脫: 0～10 min， 2% B; 10～75 min， 2%～40% B; 75～85 min，40%～95% B; 85～90 min，95% B。流速為300 nL/min。肽段洗脫后，采用 Q Exactive質譜儀進行分析。設定離子傳輸管的溫度為280℃，MS1的采集范圍為m/z700～2000，噴霧電壓為2.8 kV。 質量分辨率設定為70 k(m/z200)，MS2的質量分辨率設定為 17.5 k。自動增益控制(AGC)值為 2×105，最大注入時間(Injection time)為 50 ms。每次全掃描后最多采集15個碎片圖譜，歸一化碰撞能量設為28% HCD。

2.2.4 蛋白質數據庫檢索將采集到的質譜數據傳輸到數據處理工作站，使用Comet(2019.01版本)質譜數據分析軟件[24]，在SwissProt蛋白質數據庫進行檢索。檢索參數: 物種為人(Homo sapiens); 蛋白酶為胰蛋白酶(Trypsin)，允許最多2個漏切位點; 母離子允許最大誤差為15 ppm(10-6)， 子離子允許最大誤差為0.8 Da; 半胱氨酸(Cys)烷基化為固定修飾，蛋白質N端(Protein N-term)乙?；约凹琢虬彼?Met)的氧化為可變修飾。蛋白質假陽性率(Protein FDR)控制在小于或等于1%。

2.2.5 數據統(tǒng)計分析從蛋白質鑒定結果中提取各個蛋白鑒定多肽對應的MS2 TIC和譜圖數，將對應同一蛋白質的多肽的豐度數據(MS2 TIC和譜圖數)分別相加，得到各個蛋白質的MS2 TIC和譜圖數。分別依據每個蛋白質的MS2 TIC和譜圖數評價其相對豐度， 并進行統(tǒng)計分析。首先對所得結果進行對數轉換，然后對數據進行過濾，以確保在兩組數據中的至少一組中至少有兩個有效數據。使用edgeR軟件包[25]篩選差異表達蛋白質(Differentially-expressed protein， DEP)。采用雙側T檢驗，篩選FDR(False discovery rate)值<0.05并同時滿足倍數變化(Fold Change，FC)>2的蛋白。使用Skyline(20.1版本)軟件[26]提取MS1豐度信息，對基于MS2豐度信息的部分蛋白質組學定量分析結果進行驗證。

3 結果與討論

差異蛋白質組學的研究目的是發(fā)現在特定生理或病理條件下的蛋白質的特定表達情況，也稱為定量蛋白質組學。例如，通過比較正常和疾病狀況下，或者機體在各種化學和物理因素作用下，組織或細胞中蛋白質表達狀態(tài)的差異，可以篩選出與特定疾病或外界因素相關的蛋白質，有助于闡明疾病的致病機制以及機體對外界環(huán)境因素的反應機制。質譜技術是目前主流的蛋白質組學定量分析技術。常用的基于質譜技術的定量蛋白質組學方法主要分為標記(Label)[27]和非標記(Label-free)[28]兩大類。其中，非標記法蛋白質定量技術是通過比較不同樣品中相應肽段的質譜信號強度，從而對肽段對應的蛋白質進行相對定量分析。非標記法的技術優(yōu)勢在于蛋白質不需要進行標記，所需樣品總量少，不受樣品種類限制，可以實現大隊列臨床樣本分析，因此已成為越來越重要的蛋白質組學定量分析方法。目前常用的非標記定量分析方法的原理是以MS1為基礎，計算每個肽段的信號強度在LC-MS色譜圖中的面積積分。基于MS2數據的蛋白質組定量分析方法是以蛋白質鑒定結果為定量分析依據, 其中，以譜圖計數法為主，發(fā)展比較早，已經形成多種定量算法，而基于MS2 TIC定量分析方法則應用較少。

3.1 樣本質譜信號響應一致性評價

圖1 腎透明細胞癌和正常腎組織蛋白鑒定質譜信號響應情況Fig.1 Comparison of intensity responses of mass spectrometric (MS) data of protein identification from replicates of both tumor and normal tissues

本研究以腎透明細胞癌組織為對象，分別用兩種基于MS2的定量分析方法對所得質譜數據進行分析，并對定量分析結果進行了比較。首先考察了各個分析樣本的質譜信號響應的總體情況。由于樣本的物種和組織類型是一致的，而且樣本的處理方法和質譜分析方法也完全一致，因此以各個樣本的蛋白質組鑒定結果為依據，將每個樣本中所有鑒定蛋白所對應肽段的離子流強度分別相加后取對數，作為各個樣本的整體質譜信號響應值。如圖1所示，重復樣本之間的質譜信號響應一致，兩組樣本之間質譜信號響應也相近，說明所得質譜數據可以進行后續(xù)方法學的評估比較。

3.2 譜圖計數和MS2 TIC兩種數據分析方法的比較

從蛋白質鑒定結果中提取了各個樣本蛋白質的特征參數，包括譜圖數和MS2 TIC。圖2顯示了所有樣本的蛋白質鑒定結果中譜圖數和MS2 TIC兩種數據的分布情況?？傮w而言，MS2 TIC的相對標準偏差(Relative standard deviation, RSD)比譜圖數的數據的相對標準偏差略大: MS2 TIC的RSD中位值為36%，上限值達到72%; 而譜圖數數據的RSD中位值為32%，上限值為64%。由于MS2 TIC本質上屬于質譜儀采集的原始數據，能夠反映實際數據的多樣性和復雜性; 而譜圖數則是經過搜庫、篩選等一系列的數據處理得到的結果數據，對原始質譜數據的多樣性和復雜性不十分“敏感”。這兩種數據本質上的差別導致了其分布的不同，MS2 TIC比譜圖數數據分布更分散。

圖2 譜圖計數和MS2 TIC兩種數據的分布情況Fig.2 Distribution of the data from both spectral count and MS2 TIC of protein identification of all samplesTIC, total ion current.

圖3 相關性分析: 譜圖計數方法(A)和MS2 TIC方法(B)Fig.3 Correlation analysis: spectral count (A) and MS2 TIC (B)

進一步考察了MS2 TIC和譜圖數兩種定量方法處理不同樣本的相關性。將所有分析樣本每兩個分成一組，每組分別計算MS2 TIC和譜圖數與兩種蛋白質豐度數據的相關性。其中，所有蛋白質豐度數據均進行對數轉換后，分別計算每組數據的皮爾森相關系數(Pearson correlation)及R2值。相關性分析顯示(圖3)，MS2 TIC方法(皮爾森相關系數0.9566，R2=0.9150)總體上略優(yōu)于譜圖計數法(皮爾森相關系數為0.9131，R2=0.8140)。在高豐度蛋白區(qū)域，兩種方法差別不大; 而對于低豐度蛋白，MS2 TIC方法顯著優(yōu)于譜圖計數法。

3.3 譜圖計數和MS2 TIC兩種數據分析方法篩選差異蛋白

圖4 譜圖計數和MS2 TIC在人腎透明細胞癌組織中鑒定得到的差異表達蛋白(A)，包括46個蛋白上調和101個蛋白下調(FDR<0.05 and Fold Change> 2)(B)Fig.4 Identification of differentially expressed proteins (DEP)of human renal clear cell carcinoma using spectral count and MS2 TIC (A), 46 up-regulated proteins and 101 down-regulated proteins (FDR<0.05 and Fold Change> 2) (B)

分別使用兩種方法對所得蛋白質組數據進行差異分析，篩選出差異蛋白(圖4A)。其中，譜圖計數法篩選出120個差異蛋白質，MS2 TIC法篩選出144個差異蛋白。兩種方法共篩選出147個差異蛋白，其中兩種方法重疊的部分有117個蛋白。由此可見，MS2 TIC方法篩選出大部分的差異蛋白(98.0%), 明顯多于譜圖計數法(81.6%)。在147個差異蛋白中(圖4B)，腫瘤組織上調蛋白有46個，包括膜聯蛋白 A4、層粘連蛋白α-4亞基、丙酮酸激酶、ATP-檸檬酸合成酶、組蛋白 H1.5和碳酸酐酶9等; 腫瘤組織下調蛋白有101個，包括電子轉移黃素蛋白β亞基、3-酮脂酰基CoA硫解酶、絨毛蛋白-1、V型質子ATP合成酶F亞基、線粒體磷酸鹽載體蛋白、細胞色素b-c1復合物8亞基、多重耐藥抗性蛋白1、視黃醛脫氫酶2和尿調蛋白等。表1列出了差異較顯著的部分蛋白的歸屬及定量信息。

表1 人腎透明細胞癌組織差異蛋白質

通過蛋白質組學分析發(fā)現，在腎透明細胞癌組織中, 許多腫瘤相關蛋白的表達發(fā)生了變化, 其中，值得注意的是, 在腫瘤組織中顯著上調的膜聯蛋白A4(ANXA4)。膜聯蛋白是一類廣泛分布于動植物各種組織和細胞中的磷脂結合蛋白家族，能與磷脂膜、鈣離子可逆結合，調節(jié)膜通透性和膜運輸，參與細胞生長和凋亡。ANXA4是膜聯蛋白超家族中的重要成員之一，參與調節(jié)許多腫瘤相關的基因，促進腫瘤細胞的增殖[29]。此外，ANXA4還通過調節(jié)上皮-間質轉化而促進腫瘤細胞的遷移和侵襲，與腫瘤的增殖、侵襲和轉移、血管發(fā)生和化療耐藥密切相關[30]。

3.4 MS1肽段峰強度數據對差異蛋白質結果的驗證

目前常用的非標記定量分析方法是以MS1為基礎，計算每個肽段的信號強度在LC-MS色譜上的面積積分。利用基于MS1質譜數據的定量方法對本研究所鑒定得到的差異蛋白質進行驗證，從鑒定結果中提取MS1相關的肽段峰強度、峰面積、液相色譜保留時間等特征信息。圖5顯示了膜聯蛋白A4中位于100～115的一條酶切肽段(GAGTDEGCLIEILASR)的定性分析和MS1定量分析的詳細結果。此肽段的分子離子峰為雙電荷，其m/z為831.4，洗脫時間為58.8 min(圖5A)。其MS2碎裂片段較完整，y系列碎片離子從y1到y(tǒng)12，b系列碎片離子從b3到b13(圖5B)。為了驗證上述基于譜圖計數和MS2 TIC信息的定量分析結果，提取了各個分析樣本中此肽段的MS1豐度信息。結果顯示(圖5C)，此肽段在各個分析樣本中MS1豐度數據的變化趨勢與上述基于MS2數據的定量分析結果一致。

圖5 ANXA4肽段GAGTDEGCLIEILASR的色譜圖 (A)，MS2譜圖 (B)，以及該肽段在所有分析樣本中的MS1強度(C)Fig.5 Chromatogram of peptide (GAGTDEGCLIEILASR) from ANXA4 and its retention time (A), MS2 of this peptide (B), and MS1 intensity of distribution of this peptide in all samples (C)

4 結 論

腎癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，而晚期腎癌對化學療法或放射療法都不敏感，對其缺乏有效的診療分子靶標。本研究應用兩種基于MS2數據的非標記定量蛋白質組學分析方法(譜圖計數和MS2 TIC法)，對晚期腎透明細胞癌和對應正常組織樣本進行了分析，并對兩種方法所得結果進行了比較。本研究篩選出一系列與晚期腎癌密切相關的差異表達蛋白，可作為腎透明細胞癌診治、預后判斷的候選標志物，為尋找晚期腎透明細胞癌有效的治療靶點提供基礎數據。