劉海生 袁文理 陳永鈺 陳 晨 田 野 顏曉梅

(廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院化學(xué)生物學(xué)系， 譜學(xué)分析與儀器教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 化學(xué)生物學(xué)福建省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廈門 361005)

1 引 言

細(xì)胞外囊泡(Extracellular vesicles, EVs)是由細(xì)胞分泌到細(xì)胞外基質(zhì)中的納米尺度 (30～1000 nm)、具有磷脂雙層膜結(jié)構(gòu)的小囊泡[1]。根據(jù)分泌機(jī)制的不同，EVs主要包括由多泡小體與細(xì)胞膜融合釋放的外泌體(Exosomes, 30～150 nm)和從細(xì)胞膜出芽脫落的微囊泡(Microvesicles, 100～1000 nm)[2]。EVs攜載有親本細(xì)胞來源的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸和其它生物分子，參與細(xì)胞間通訊、抗原呈遞、血管新生、腫瘤侵襲等生理病理過程，在疾病診斷、預(yù)后和治療中顯示出巨大的應(yīng)用前景[3]。EVs廣泛存在于人類各種體液和排泄物中，如血液、唾液、汗液、眼淚、糞便和尿液等[4]，其中，尿液樣本因具有簡單易得、非侵入性采樣和標(biāo)本量大等特點(diǎn)備受關(guān)注。2002年，Thongboonkerd等[5]通過對尿液超速離心后的沉淀物進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)沉淀物中含有大量膜蛋白，為尿液中存在具有膜結(jié)構(gòu)的EVs提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)。2004年，Pisitkun等[6]通過超速離心，首次提純了uEVs，并且通過蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)uEVs攜載的很多蛋白與人類疾病密切相關(guān)。近幾年，uEVs攜載的分子標(biāo)志物已被用于多種泌尿系統(tǒng)疾病(如急性腎損傷、前列腺癌和膀胱癌等)的診斷與治療監(jiān)控[7～13]。盡管uEVs的生物學(xué)功能及臨床應(yīng)用價(jià)值不斷地被發(fā)掘，但由于uEVs自身具有高度的個(gè)體差異性和多樣性，同時(shí)缺乏相應(yīng)的單顆粒表征技術(shù)，研究者對于uEVs自身組成、結(jié)構(gòu)和功能的了解較少，這嚴(yán)重阻礙了uEVs研究的進(jìn)一步深入[14]。

透射電子顯微鏡、掃描電子顯微鏡和原子力顯微鏡等顯微技術(shù)被廣泛應(yīng)用于EVs物理性狀(如粒徑、濃度和形態(tài)等)的表征，但這些技術(shù)存在樣品制備繁瑣、測量速度慢、粒徑分布缺乏統(tǒng)計(jì)代表性等缺點(diǎn)[15]。動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)(Dynamic light scattering, DLS)、納米顆粒跟蹤分析技術(shù)(Nanoparticle tracking analysis, NTA)、可調(diào)電阻脈沖傳感技術(shù)(Tunable resistance pulse sensing, TRPS)和流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry, FCM)等，常被用于EVs粒徑和濃度的快速測定。采用DLS測量EVs時(shí)，測量的散射強(qiáng)度由顆粒尺寸加權(quán)所得，與粒徑的六次方成正比，因此，少量的大粒徑雜質(zhì)顆?；蚰遗輹?huì)湮沒小粒徑EVs的信號，使得小顆粒信號失真，不適于EVs等高度異質(zhì)性顆粒樣本的表征[16]。與DLS不同，NTA是對單個(gè)納米顆粒的散射光強(qiáng)進(jìn)行測量，采用激光照射納米顆粒懸浮液，通過高速相機(jī)對視野中的顆粒進(jìn)行拍照，從而對每個(gè)顆粒的散射光點(diǎn)進(jìn)行跟蹤記錄，以獲得納米顆粒布朗運(yùn)動(dòng)的軌跡，進(jìn)而計(jì)算出單位時(shí)間間隔內(nèi)每個(gè)納米顆粒的均方位移和擴(kuò)散系數(shù)，最后將每個(gè)顆粒的擴(kuò)散系數(shù)代入Stokes-Einstein方程，計(jì)算出各自的水合動(dòng)力學(xué)直徑。然而，NTA得到的粒徑包含顆粒外的水化層，將顆粒在x-y-z三維空間的布朗擴(kuò)散變成x-y二維平面的顆粒追蹤，導(dǎo)致測得的速率比顆粒的實(shí)際運(yùn)動(dòng)速率偏小，使得顆粒粒徑的測定結(jié)果偏大，同時(shí)，也使測得的顆粒粒徑分布相比于真實(shí)分布存在展寬。此外，由于EVs粒徑分布較寬，為了防止大顆粒的散射光信號過飽和，必須降低相機(jī)亮度，導(dǎo)致小顆粒的散射光信號較弱，難以被儀器跟蹤分析。因此，NTA僅能檢測粒徑大于70 nm的EVs，并且顆粒粒徑分布結(jié)果通常大于電鏡的測定結(jié)果，且展寬較為嚴(yán)重[17]。TRPS是一種利用納米孔技術(shù)對溶液中納米顆粒的粒徑分布和濃度在單顆粒水平進(jìn)行快速測定的方法，其對于EVs樣本的表征存在以下挑戰(zhàn)：(1)校準(zhǔn)粒子應(yīng)與EVs樣本具有相同的緩沖液組分，然而在測量EVs，尤其是生物樣本中的EVs時(shí)，緩沖組分通常是未知的; (2)由于EVs的粒徑分布廣，樣品中的大尺寸EVs常會(huì)造成納米孔的堵塞，從而阻礙測量[18]。FCM是一種對懸液中的細(xì)胞或細(xì)胞大小的顆粒進(jìn)行快速定量分析的先進(jìn)技術(shù)，散射光可揭示細(xì)胞或顆粒的粒徑以及材質(zhì)的疏密程度，多色熒光標(biāo)記可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)、特異性蛋白表達(dá)、酶活、離子濃度等生化性狀的測定?；诿资仙⑸淠Ｐ偷纳⑸涔馀c粒徑的關(guān)系，2018年，van der Pol等[19]對各種商品化流式細(xì)胞儀可檢測到的EVs的粒徑范圍進(jìn)行了評估，發(fā)現(xiàn)只有少數(shù)幾款高靈敏設(shè)備(包括Apogee A50- Micro，BD influx以及BD LSR II)可檢測300～600 nm范圍的EVs，其它常規(guī)配置的流式細(xì)胞儀只適用于檢測粒徑范圍在600～1200 nm和/或1200～3000 nm的大尺寸EVs。

傳統(tǒng)的EVs生化檢測方法主要是基于集權(quán)平均的分析方法，如Western blotting、酶聯(lián)免疫法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction, PCR)、蛋白質(zhì)組學(xué)分析、核酸測序等。這些方法雖可對EVs樣本中的生物分子豐度進(jìn)行整體分析，卻無法揭示EVs在蛋白、核酸等方面的個(gè)體差異性，而EVs亞類的分析對于EVs分泌機(jī)制和功能的研究至關(guān)重要[20～22]。因此，如何在單顆粒水平對EVs的理化性質(zhì)進(jìn)行精準(zhǔn)測量，以揭示EV顆粒間異質(zhì)性，是一個(gè)亟待解決的科學(xué)難題[23]。為了實(shí)現(xiàn)納米顆粒的高靈敏度多參數(shù)檢測，本研究組結(jié)合瑞利散射和鞘流單分子熒光檢測技術(shù)，成功研制出納米流式檢測裝置(Nano-flow cytometer, nFCM)，將EVs、病毒、二氧化硅納米顆粒 (SiNPs)、納米金顆粒 (AuNPs) 的散射檢測下限分別降低至40、27、24和7 nm，較傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀的散射檢測靈敏度提升4～5個(gè)數(shù)量級，檢測速率高達(dá)每分鐘上萬個(gè)顆粒，粒徑表征分辨率與冷凍透射電鏡[17,24,25]相當(dāng)。在熒光檢測方面，nFCM可檢測到單個(gè)藻紅蛋白的熒光信號，較傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀靈敏1～2個(gè)數(shù)量級[26]。本研究采用nFCM對uEVs在單顆粒水平進(jìn)行多參數(shù)定量表征。

uEVs提取的方法主要有超速離心法、非對稱場流分離、密度梯度離心法、免疫親和分離法、超濾法和聚合物沉淀法等[27,28]。其中，超速離心法最為常用，其提取步驟一般為：(1) 3000 g離心10 min，取上清液，以17000 g離心20 min，去除尿液中的細(xì)胞和細(xì)胞碎片; (2)200000 g超速離心110 min， 2次，提取uEVs沉淀; (3)對提純的uEVs進(jìn)行密度梯度離心，提高EVs純度[27,29]。其中，差速離心需要5～6 h，密度梯度離心約需要24 h，非常耗時(shí)費(fèi)力。為了能在較短的時(shí)間內(nèi)獲得高純度的uEVs，本研究采用配備了TLA-120.2轉(zhuǎn)頭的Beckman Coulter Optima MAX-XP臺式超速離心機(jī)對uEVs進(jìn)行純化，將EVs的單次超速離心時(shí)間從110 min縮短至17 min。具體提取步驟如圖1所示：(1) 3000 g離心20 min， 去除尿液中的細(xì)胞碎片; (2)100000 g離心17 min，2次，提取uEVs。整個(gè)提純過程僅需1 h?；趎FCM散射和熒光檢測的高靈敏和快速性，本研究對尿液提純的uEVs的純度、濃度、粒徑分布、核酸和蛋白豐度等進(jìn)行了定量表征。此外，本研究還對10位健康受試者連續(xù)5天的中段晨尿進(jìn)行了uEVs的追蹤分析。

圖1 uEVs的超速離心純化步驟及納米流式分析圖Fig.1 Schematic depiction of urinary extracellular vesicles (uEVs) isolation by differential ultracentrifugation and nano-flow cytometer (nFCM) analysis

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

5810R冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司)； Optima Max-XP超速離心機(jī)，配備TLA 120.2轉(zhuǎn)頭(美國Beckman Coulter公司)。 nFCM為本研究組自行開發(fā)[30]，本研究在檢測uEVs的純度、濃度、粒徑和蛋白時(shí)所用的儀器參數(shù)與之前報(bào)道的相同。532 nm (16 mW) 激光器發(fā)出的激光經(jīng)反射鏡反射后，被消色差膠合透鏡聚焦為直徑約10 μm的激光光斑，激光光斑與鞘液聚焦后的uEVs樣品流正交于石英流動(dòng)室的中心處，uEVs顆粒穿越激光探測區(qū)所發(fā)出的光信號被顯微鏡物鏡收集后，由二向色分光鏡Dic-F(美國Semrock公司，F(xiàn)F555-Di03)分為兩束光路，波長λ<555 nm的光被反射至第一個(gè)APD進(jìn)行散射檢測，而波長λ>555 nm的光經(jīng)過FF01-579/34帶通濾波片BP(美國Semrock公司)被第二個(gè)APD接收，進(jìn)行熒光檢測。當(dāng)檢測綠色熒光染料CFSE、SYTO16和RNASelect標(biāo)記的uEVs時(shí)更換為488 nm激光器(20 mW), 此時(shí)二向色分光鏡FF555-Di03更換為FF500-Di01，λ<500 nm的光被反射至第一個(gè)APD進(jìn)行散射檢測，而λ>500 nm的光經(jīng)過FF01-525/45帶通濾波片BP(美國Semrock公司)被第二個(gè)APD接收，進(jìn)行熒光檢測。儀器其它參數(shù)不變。

磷酸鹽緩沖液 (PBS, pH 7.4)經(jīng)220 nm濾膜過濾，于4℃保存，備用; Triton X-100(美國Sigma-Aldrich公司); 熒光標(biāo)記的抗體(美國BD Biosciences公司)，包括藻紅蛋白(Phycoerythrin, PE)標(biāo)記小鼠IgG 1, κ(Clone MOPC-21)、PE標(biāo)記鼠抗人CD9抗體(Clone M-L13)、PE標(biāo)記鼠抗人CD63抗體(Clone H5C6)、PE標(biāo)記鼠抗人CD81抗體(Clone JS-81)和 PE標(biāo)記鼠抗人CD24抗體(Clone ML5)，5(6)-羧基二乙酸熒光素琥珀酰亞胺酯(CFDA-SE, CFSE，美國MedChemExpress公司，HY-D0938); RNase-free DNase I (日本Takara公司，2270A); RNase A(EN0531)、SYTO 16(S7578)和SYTO RNASelect(S32703)(美國Thermo Fisher公司)。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 uEVs的純化中段晨尿來源于10名年齡20～30歲的健康志愿者(5名男性，5名女性)，受試者無腎臟和糖尿病等慢性病史，尿液留取兩周內(nèi)，受試者無急性感染、無用藥史，女性受試者均避開生理期。5 mL尿液以3000 g離心20 min(5810 R冷凍離心機(jī))，去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片，取上清液。將1 mL上清液轉(zhuǎn)入超速離心管，100000 g離心17 min(Optima Max-XP超速離心機(jī))，棄上清液，沉淀重懸于1 mL PBS中; 100000 g離心17 min，棄上清液，uEVs重懸于100 μL PBS中，備用。

2.2.2 冷凍透射電鏡觀測uEVs 冷凍透射電鏡拍攝使用Tecnai F20透射電子顯微鏡在120 kV的電壓下拍攝。

2.2.3 uEVs純度鑒定將10 μL PBS稀釋的10% Triton X-100加到90 μL uEVs中，Triton X-100的終濃度為1%。樣品振蕩混勻后，冰上孵育30 min, 以裂解uEVs。反應(yīng)結(jié)束后，將樣品稀釋20倍，使用nFCM檢測Triton X-100處理前后uEVs的顆粒濃度變化。

2.2.4 CFSE標(biāo)記uEVs將100 μL 稀釋于PBS的200 μmol/L CFSE加到100 μL 6 ×108個(gè)/mL的uEVs中 (CFSE終濃度為100 μmol/L)，37℃避光孵育2 h。將樣品轉(zhuǎn)入超速離心管，用PBS補(bǔ)至1 mL, 100000 g離心17 min。棄上清液，向超速離心管加入1 mL PBS, 100000 g離心17 min。將標(biāo)記后的uEVs重懸于100 μL PBS，用于nFCM檢測。

2.2.5 uEVs核酸標(biāo)記將4 μL 5 U/μL RNase-free DNase I或1 μL 10 mg/mL RNase A加入到100 μL 3 × 108個(gè)/mL uEVs中，37℃孵育30 min。隨后，將SYTO 16或SYTO RNASelect加入uEVs中，使其終濃度為6 μmol/L或10 μmol/L，37℃孵育20 min，用于nFCM檢測。

2.2.6 uEVs蛋白標(biāo)記將尿液3000 g離心，取1 mL上清液轉(zhuǎn)入超速離心管，100000 g離心17 min，棄上清液，將uEVs重懸在50 μL PBS中，分別加入20 μL PE標(biāo)記小鼠IgG 1, κ同型對照、PE標(biāo)記鼠抗人CD9抗體、PE標(biāo)記鼠抗人CD63抗體、PE標(biāo)記鼠抗人CD81抗體或 PE標(biāo)記鼠抗人CD24抗體原液，37℃孵育30 min。用PBS補(bǔ)至1 mL, 100000 g離心17 min。棄上清液，向超速離心管加入1 mL PBS, 100000 g離心17 min，將標(biāo)記后的uEVs重懸于100 μL PBS，用于nFCM檢測。

3 結(jié)果與討論

3.1 uEVs形態(tài)與純度

普通透射電鏡在制備樣本時(shí)會(huì)造成EVs脫水，無法展示EVs的真實(shí)形態(tài)。在低溫下，冷凍透射電鏡將溶劑中的EVs快速冷凍固定后拍攝，能夠保持EVs的原始形態(tài)[15]。為了獲得uEVs的真實(shí)形態(tài)，本研究采用冷凍透射電鏡對uEVs進(jìn)行拍攝，其形態(tài)如圖2A所示，主要有球形和棒狀兩種形態(tài)，此外，還存在著一些具有多層膜結(jié)構(gòu)的囊泡。Triton X-100是一種非離子型表面活性劑，可裂解uEVs的磷脂雙分子層，不會(huì)破壞無脂膜結(jié)構(gòu)的雜質(zhì)顆粒[30]。通過使用nFCM測定Triton X-100處理前后uEVs的顆粒濃度，可對uEVs的純度進(jìn)行評估。圖2B和2C分別為nFCM檢測1% Triton X-100處理前后的uEVs的側(cè)向散射信號(Side scattering, SSC)波形圖和統(tǒng)計(jì)直方圖。計(jì)算結(jié)果表明，uEV的純度為92%，而超速離心純化獲得的血漿和細(xì)胞上清液來源的EVs的純度通常為90%和70%～80%[17]，這主要是因?yàn)榕c血漿和細(xì)胞上清液相比，尿液中含有少量脂蛋白、血清蛋白等雜質(zhì)顆粒。CFSE是一種可穿透細(xì)胞膜的熒光染料，自身不具有熒光性質(zhì)。當(dāng)CFSE進(jìn)入囊泡內(nèi)部，其乙酸基團(tuán)被囊泡內(nèi)部的酯酶水解，此時(shí)，CFSE可發(fā)出較強(qiáng)的綠色熒光，但不再具有膜通透性; 同時(shí)，CFSE含有的琥珀酰亞胺基團(tuán)可與囊泡內(nèi)蛋白的游離胺基反應(yīng)，形成具有熒光的蛋白加合物[31]。本研究使用CFSE對uEVs進(jìn)行標(biāo)記，CFSE熒光強(qiáng)度與側(cè)向散射強(qiáng)度的二維散點(diǎn)圖(圖2D)表明，82.6%的uEVs可被CFSE標(biāo)記，標(biāo)記比例與uEVs的純度相近，且粒徑越大的EVs，CFSE的熒光亮度越強(qiáng)。

圖2 uEVs的形態(tài)與純度鑒定：(A)uEVs冷凍透射電鏡圖; (B)nFCM檢測Triton X-100處理前后，uEVs的散射信號波形圖; (C)nFCM檢測Triton X-100處理前后，uEVs的散射信號統(tǒng)計(jì)直方圖; (D)CFSE標(biāo)記uEVs的散射-熒光信號二維散點(diǎn)圖Fig.2 Morphology and purity identification of uEVs: (A) Representative cryo-transmission electron microscopemicrographs of uEVs; (B) Representative side scatter (SSC) burst traces of uEVs before and after 1% Triton X-100 treatment for 30 min by nFCM; (C) SSC distribution histograms of uEVs before and after 1% Triton X-100 treatment; (D) Bivariate dot-plots of green fluorescence versus SSC for uEVs fluorescently labeled with CFSE

3.2 uEVs顆粒濃度測定

雖然尿液樣本具有簡單易得、無創(chuàng)取樣等優(yōu)點(diǎn)，但尿液中uEVs的濃度易受晝夜節(jié)律、水合狀態(tài)的變化、鍛煉和飲食等因素影響[32]。因此，對于不同個(gè)體或同一個(gè)體不同時(shí)間點(diǎn)uEVs進(jìn)行濃度測定對于后續(xù)的研究具有一定的指導(dǎo)意義。首先使用nFCM對初始濃度為2.03 × 109個(gè)/mL 的100 nm聚苯乙烯熒光標(biāo)準(zhǔn)球進(jìn)行梯度稀釋檢測(采樣時(shí)間為1 min)，建立聚苯乙烯熒光標(biāo)準(zhǔn)球的濃度與nFCM單位時(shí)間檢測顆粒數(shù)之間的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(圖3A和3B)，相關(guān)系數(shù)R2=0.998。隨后，在相同進(jìn)樣壓力條件下對uEVs樣本的散射信號進(jìn)行檢測，采樣時(shí)間為1 min，將檢測到的uEVs的顆粒數(shù)代入標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，即可得到待測樣本中uEVs的顆粒濃度?；诖朔椒?，本研究對10名受試者每天晨尿中uEVs的顆粒濃度進(jìn)行了為期5天的連續(xù)追蹤。圖3C表明，所有受試者的uEVs濃度均分布在3.0 × 109～8.9 ×1010個(gè)/mL之間，這個(gè)濃度遠(yuǎn)高于文獻(xiàn)報(bào)道的2.0 × 108～4.0 × 108個(gè)/mL[33]，這主要是因?yàn)閚FCM靈敏度高，能檢測到小粒徑的uEVs。對比每位受試者連續(xù)5天的uEVs濃度，可知受試者的濃度變化存在較大的個(gè)體差異，個(gè)人5天的濃度變異系數(shù)(Coefficient of variation, CV)在18.5%～142.0%之間。此外，雖然男性受試者和女性受試者的uEVs濃度不存在顯著差別，但女性受試者5天的濃度變異系數(shù)(47.1%～142.0%)略高于男性(18.5% ～82.1%)。

圖3 uEVs的濃度測定：(A)100 nm聚苯乙烯熒光標(biāo)準(zhǔn)球的散射-熒光二維散點(diǎn)圖; (B)nFCM單位時(shí)間(1 min)檢測到的100 nm聚苯乙烯熒光標(biāo)準(zhǔn)球顆粒數(shù)與其實(shí)際濃度的線性關(guān)系曲線; (C)10名受試者連續(xù)5天晨尿中uEVs的濃度檢測結(jié)果Fig.3 Concentration measurement of uEVs by nFCM: (A) A bivariate dot-plot of fluorescence versus side scattering for 100 nm fluorescent polystyrene beads; (B) Linear relationship between the events rate measured by the nFCM in 1 min and the true concentration of 100 nm fluorescent polystyrene beads; (C) Concentrations of uEVs isolated from 10 healthy donors for five consecutive days

3.3 uEVs粒徑分布測定

粒徑分布是細(xì)胞外囊泡研究中重要的物理參數(shù)，粒徑與囊泡的分泌來源和攜載分子的豐度密切相關(guān)[21]?；趎FCM對單個(gè)EVs散射光強(qiáng)度的快速檢測，同時(shí)，采用單分散性良好的SiNPs粒徑標(biāo)準(zhǔn)球建立散射光強(qiáng)度與粒徑的關(guān)系曲線，并結(jié)合米氏散射理論對SiNPs和EVs的折射率偏差進(jìn)行校正，實(shí)現(xiàn)了對粒徑低至40 nm的EVs的粒徑快速表征，其準(zhǔn)確性和分辨率與冷凍透射電鏡[17]相當(dāng)。圖4A是10位健康受試者同一天uEVs粒徑分布統(tǒng)計(jì)直方圖，雖然不同的個(gè)體在分布上略有差異，uEVs的粒徑主要分布在40～120 nm之間。5位男性受試者uEVs的中位粒徑(Median size)分別為69、66、67、63和67 nm， 5位女性受試者uEVs的中位粒徑分別為65、62、63、67和62 nm。通過對比可知，男性受試者uEVs的粒徑略大于女性受試者，但并無顯著區(qū)別(p= 0.08)，這種結(jié)果可能是樣本量較少造成的。隨后，對其中1位男性受試者uEVs的粒徑進(jìn)行了連續(xù)5天的追蹤分析，由圖4B可知，同一受試者uEVs的粒徑分布在不同的日期粒徑分布差異并不明顯，5天粒徑中位值為(68 ± 4) nm。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同受試者或同一受試者在不同日期uEVs的粒徑分布變化不大。

3.4 uEVs的核酸檢測

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，uEVs中存在DNA片段和多種類型的RNA(miRNA、mRNA和rRNA等)[34～36]。這些DNA和RNA在基于uEVs的疾病診斷研究中至關(guān)重要，如以uEVs攜載RNA為檢測靶標(biāo)的前列腺癌診斷試劑盒ExoDxTMProstate (IntelliScore) 已被用于臨床分析[37]。然而，現(xiàn)有的表征技術(shù)尚無法確定DNA和RNA是否存在于每個(gè)uEVs顆粒中，是攜載于uEVs的內(nèi)部，還是粘附于uEVs的外部，以及核酸豐度等問題。本研究使用SYTO 16對一位男性健康受試者uEVs的DNA進(jìn)行標(biāo)記，采用nFCM在單顆粒水平檢測uEVs的熒光和散射信號，探究DNA在uEVs中的分布及其與粒徑的關(guān)系。SYTO 16是一種可跨膜的綠色熒光核酸染料，熒光光譜表明，SYTO 16與DNA結(jié)合的熒光強(qiáng)度比與相同濃度的RNA結(jié)合高15倍，說明其對DNA具有高度的特異性(圖5A)。為了探究uEVs表面是否黏附有DNA片段，在核酸染色前使用DNase I對uEVs進(jìn)行處理。由于uEVs具有完整封閉的磷脂雙分子膜，DNase I只能作用于uEVs外表面，無法水解uEVs內(nèi)部包裹的DNA片段。由SYTO 16熒光強(qiáng)度與散射光強(qiáng)度的二維散點(diǎn)圖(圖5B)可知，DNase I處理前后uEVs的染色比例和熒光強(qiáng)度均無明顯變化。此實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象表明uEVs外表面沒有DNA片段黏附，uEVs的DNA主要分布在uEVs內(nèi)腔。結(jié)合散射信號強(qiáng)度可知，DNA主要分布在粒徑較大的uEVs的內(nèi)腔中。為了分析RNA在uEVs中的分布與豐度，使用SYTO RNASelect對uEVs中的RNA進(jìn)行定量標(biāo)記。SYTO RNASelect是目前唯一商業(yè)化的RNA特異性熒光染料，是一種跨膜的綠色熒光染料，通過熒光光譜(圖5C)可知，其與RNA結(jié)合的熒光強(qiáng)度比與同濃度DNA高30倍。為了探究uEVs外表面是否黏附RNA，采用RNase A處理uEVs。由SYTO RNASelect熒光強(qiáng)度與散射光熒光強(qiáng)度的二維散點(diǎn)圖(圖5D)可知，RNase A處理前后uEVs的染色比例分別為5.2%和4.7%，而且熒光強(qiáng)度也沒有明顯變化。結(jié)果說明，uEVs表面幾乎沒有RNA黏附，RNA同樣主要分布在uEVs的內(nèi)腔中。

圖5 uEVs的核酸檢測：(A)熒光分光光度計(jì)考察SYTO 16對于DNA和RNA熒光標(biāo)記的特異性(SYTO 16濃度為6 μmol/L，DNA和RNA的濃度均為5 μg/mL); (B)nFCM測定uEVs未經(jīng)DNase I處理和處理后使用6 μmol/L SYTO 16染色的散射-熒光二維散點(diǎn)圖; (C)熒光分光光度計(jì)考察SYTO RNASelect對于RNA和DNA熒光標(biāo)記的特異性(SYTO RNASelect濃度為10 μmol/L，DNA和RNA的濃度均為5 μg/mL); (D)nFCM測定uEVs 未經(jīng)RNase A處理和處理后使用10 μmol/L SYTO RNASelect染色的散射-熒光二維散點(diǎn)圖Fig.5 nFCM analysis of DNA and RNA on single uEVs: (A) Fluorescence emission spectra of SYTO 16 without or with RNA or DNA binding. The concentration of SYTO 16 is 6 μmol/L, and the concentrations of RNA and DNA were both 5 μg/mL. (B) Bivariate dot-plots of green fluorescence versus SSC for uEVs without or with DNase I treatment and then fluorescently labeled with SYTO 16. The concertation of SYTO 16 is 6 μmol/L. (C) Fluorescence emission spectra of SYTO RNASelect without or with RNA or DNA binding. The concentration of SYTO RNASelect is 10 μmol/L, and the concentrations of RNA and DNA are both 5 μg/mL. (D) Bivariate dot-plots of green fluorescence versus SSC for uEVs without or with RNase A treatment and then fluorescently labeled with SYTO RNASelect. The concertation of SYTO RNASelect is 10 μmol/L

3.5 uEVs的蛋白標(biāo)志物檢測

CD9、CD63和CD81是鑒定EVs最經(jīng)典的蛋白標(biāo)志物，這3種蛋白也常被用于EVs的親和捕獲，以提純EVs[20,38]。但是否每個(gè)uEVs都攜載這3種蛋白標(biāo)志物尚不清楚。nFCM的熒光通道可高靈敏度地檢測單個(gè)藻紅蛋白PE的熒光信號，本研究使用PE標(biāo)記的抗體對CD9、CD63和CD81在單個(gè)uEVs中的表達(dá)進(jìn)行定量檢測。圖6顯示對于受試健康男性uEVs樣本，CD9、CD63和CD81陽性的uEVs比例分別為26.8%，21.0%和6.0%，因此，如果用這些蛋白的抗體對uEVs進(jìn)行親和捕獲，將會(huì)遺漏大部分的uEVs。CD24是一種糖基磷脂酰肌醇錨蛋白，是黏蛋白樣黏附分子，通過糖基磷脂酰肌醇黏附在細(xì)胞膜上。文獻(xiàn)[39]報(bào)道，CD24在健康人uEVs中高表達(dá)，被認(rèn)為是uEVs的蛋白標(biāo)志物。通過nFCM對uEVs表面的CD24進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，CD24在uEVs中的陽性比例為19.9%，熒光強(qiáng)度比CD9、CD63和CD81高，說明CD24的單顆粒表達(dá)水平比這3種蛋白高。

圖6 uEVs蛋白標(biāo)志物的免疫熒光檢測，(A～F)uEVs的抗體PE熒光-散射二維散點(diǎn)圖：(A)同型對照IgG 1; (B)同型對照IgG 2b; (C)CD9; (D)CD63; (E)CD81; (F)CD24Fig.6 Protein marker analysis of uEVs by nFCM upon immunefluorescent staining. (A-F) Bivariate dot-plots of PE orange fluorescence versus SSC for a uEV isolate fluorescently labeled with PE-conjugated monoclonal antibody specific to IgG 1 (A), IgG 2b (B), CD9 (C), CD63 (D), CD81 (E) or CD24 (F)

4 結(jié) 論

基于nFCM可在單顆粒水平對納米顆粒進(jìn)行高靈敏、高通量和多參數(shù)定量檢測的獨(dú)特優(yōu)勢，本研究對uEVs的純度、濃度、粒徑、DNA、RNA以及蛋白標(biāo)志物進(jìn)行了表征。研究表明，采用超速離心純化的uEVs純度高達(dá)92%，整個(gè)提純過程僅需1 h; 對10位健康受試者uEVs的檢測結(jié)果表明，uEVs的顆粒濃度主要分布在3.0 × 109～8.9 ×1010個(gè)/mL之間，存在較大的個(gè)體差異，且同一受試者不同日期也存在較大的差別。此外，uEVs的粒徑主要分布在40～120 nm之間，個(gè)體差異和同一受試者不同日期的差異不大。核酸檢測結(jié)果表明，uEVs的外表面均無DNA或RNA黏附，核酸主要存在于uEVs的內(nèi)腔。蛋白標(biāo)志物的檢測結(jié)果表明，并不是每個(gè)uEVs都表達(dá)CD9、CD63、CD81等蛋白，對于所測樣本，這3種蛋白的陽性率分別為26.8%、21.0%和6.0%，而CD24的陽性率為19.9%。本研究對uEVs的多種物理和生化參數(shù)在單個(gè)顆粒水平進(jìn)行了精確的定量表征，nFCM可為uEVs的分泌方式研究、亞群鑒定以及臨床價(jià)值挖掘提供強(qiáng)大的技術(shù)支撐。