崔圓圓 張躍祥 王玉華（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院呼和浩特010110）

合日乎-18散是由川木香、益智仁、生草果仁、拳參、高良姜、大黃、赤瓟子、蘇木、肋柱花、訶子、金銀花、綠豆、檳榔、土木香、甘草、肉豆蔻、琥珀、黃連等十八味藥組成，臨床功效為解毒、調(diào)經(jīng)止血，用于腰腹酸痛、腹臟“黏”熱、“協(xié)日”熱、“赫依”熱等。目前，合日乎-18散沒(méi)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。川木香為方中主要藥味之一，具有行氣止痛的功效[1]。川木香隸屬菊科川木香屬，氣芳香，研究表明揮發(fā)油、木質(zhì)素類和倍半萜類成分為其主要的活性成分[2，3]。木香烴內(nèi)酯屬于倍半萜內(nèi)酯類化合物，為川木香藥材指標(biāo)性成分之一。本文采用HPLC法測(cè)定了合日乎-18散中木香烴內(nèi)酯的含量，為合日乎-18散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器：Waters e2695型高效液相色譜儀（沃特世科技有限公司，上海）；Mettler-Toledo MS105DU型百萬(wàn)分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司，江蘇）；Mettler-Toledo XPR10型萬(wàn)分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司，江蘇）；SBL-22DT型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司，寧波）；Heal Force NW15UV型超純水系統(tǒng)（河南省予華儀器有限公司，河南）；FW400A型多功能粉碎機(jī)（材茂科技有限公司，北京）。

1.2 試藥：木香烴內(nèi)酯對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)111524-201911）；合日乎-18散供試品四批（呼倫貝爾市蒙醫(yī)醫(yī)院，批號(hào) 20180701、2018071901、2018081702、2018091103）；自制樣品一批（批號(hào)20190925）；甲醇為色譜純；水為超純水，所用其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件：本實(shí)驗(yàn)采用Pheomenex C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以甲醇為流動(dòng)相 A，水為流動(dòng)相 B，梯度洗脫（0～27 min，65% A；27～31 min，65% A→80% A；31～37 min，80% A；37～39 min，80% A→65% A；39～45 min，65% A）；檢測(cè)波長(zhǎng)為 225 nm；柱溫35℃；流速為1.0 mL·min-1；進(jìn)樣體積為10 μL。理論板數(shù)按木香烴內(nèi)酯峰計(jì)算應(yīng)不低于4000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備：取木香烴內(nèi)酯對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含木香烴內(nèi)酯0.1 mg的對(duì)照品溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備：取供試品粉末約3.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷至室溫，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性對(duì)照溶液的制備：按處方比例并以相同工藝制備缺川木香的陰性對(duì)照供試品，依照“2.3”項(xiàng)下所述供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液，即得。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 專屬性試驗(yàn)：在“2.1”色譜條件下，分別精密吸取對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液、供試品溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，記錄各自的色譜圖。色譜圖顯示，在供試品溶液色譜圖中，木香烴內(nèi)酯與相鄰峰得到基線分離；陰性對(duì)照色譜圖中在與木香烴內(nèi)酯對(duì)照品色譜峰對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間處無(wú)色譜峰出現(xiàn)，表明其他組分對(duì)木香烴內(nèi)酯的測(cè)定無(wú)干擾。該方法專屬性好。

2.5.2 線性關(guān)系考察：取木香烴內(nèi)酯對(duì)照品約3.0 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL含0.119 mg的溶液，分別精密吸取上述對(duì)照品溶液 1 μL、2 μL、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL和25 μL注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積對(duì)進(jìn)樣量進(jìn)行回歸分析。結(jié)果顯示，木香烴內(nèi)酯在0.119 μg～2.7975 μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系（r=0.9999），回歸方程為y=3267854.1394x-229386.9495。

2.5.3 精密度試驗(yàn)：取一份供試品（批號(hào) 20180701），按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6幀，分別記錄色譜圖，木香烴內(nèi)酯峰面積積分值之間的RSD值為0.85%，表明儀器精密度良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取一份供試品（批號(hào)20180701），按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”色譜條件下，分別于 0 h、3 h、4 h、9 h、12 h進(jìn)樣并記錄色譜圖。結(jié)果顯示，在12 h內(nèi)木香烴內(nèi)酯峰面積積分值基本穩(wěn)定，RSD值為0.45%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.5 重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批號(hào)（批號(hào)20180701）供試品6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件下，記錄色譜圖。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算木香烴內(nèi)酯的含量。結(jié)果表明，供試品平均含量為0.38 mg·g-1，RSD為1.70%。該法的重復(fù)性好。

2.5.6 加樣回收試驗(yàn)：取已知含量（批號(hào)20180701，含量為0.38mg·g-1）的供試品9份，各約1.0 g，精密稱定，分別置9個(gè)具塞錐形瓶中，分成三組，每組三份，每組分別精密加入濃度為0.16 mg·mL-1的木香烴內(nèi)酯對(duì)照品溶液各1 mL、2 mL、3 mL（約相當(dāng)于供試品含有量的 50%、100%、150%）及甲醇 25 ml，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件下，進(jìn)樣并記錄色譜圖。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算回收率。見(jiàn)表1。

表1的結(jié)果顯示，50%、100%、150%的加樣回收率的均值為96.21%，RSD為1.72%，表明該方法的準(zhǔn)確度好。

3 供試品測(cè)定

取四批供試品（批號(hào) 20180701、2018071901、2018081702、2018091103）各兩份以及自制供試品（批號(hào)20190925）兩份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)行測(cè)定。含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 木香烴內(nèi)酯加樣回收試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Costunolide Sample Recovery Test Results

表2 供試品中木香烴內(nèi)酯測(cè)定結(jié)果Table 2 Determination Results of Costunolide in the Test Samples

表2的結(jié)果顯示，四批合日乎-18散供試品及自制品中木香烴內(nèi)酯含量接近，批號(hào)為2018071901的樣品含量稍高，含量在0.32 mg·g-1以上。

4 討論

4.1 流動(dòng)相的選擇：參照《中國(guó)藥典》2015年版一部“川木香”含量測(cè)定項(xiàng)下的測(cè)定方法[1]，以甲醇-水（65∶35）為流動(dòng)相進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，木香烴內(nèi)酯分離度和對(duì)稱性良好，但發(fā)現(xiàn)在合適的采集時(shí)間（30 min）里，不能出峰完全，第二幀里木香烴內(nèi)酯會(huì)被第一幀里未出完的色譜峰影響，在連續(xù)進(jìn)樣時(shí)，會(huì)出現(xiàn)色譜峰拖尾及保留時(shí)間漂移的現(xiàn)象。故嘗試流動(dòng)相比例為甲醇-水（70∶30），將所有色譜峰出峰時(shí)間前移，以保證擁有合理的采集時(shí)間，但此時(shí)木香烴內(nèi)酯色譜峰與其他色譜峰分離效果不佳。故將流動(dòng)相比例調(diào)整為甲醇-水梯度洗脫，在保證木香烴內(nèi)酯色譜峰與其他色譜峰分離度良好的前提下，使后面的色譜峰盡快沖出，縮短采集時(shí)間[5-7]。

4.2 柱溫選擇：比較了不同溫度25℃、30℃、35℃、40℃對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。結(jié)果顯示，隨著色譜柱溫度的升高，整體出峰時(shí)間前移，并不會(huì)影響木香烴內(nèi)酯的分離度，故在保護(hù)色譜柱的前提下，選擇柱溫為35℃[4-7]。

4.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇：參照《中國(guó)藥典》2015年版一部“川木香”含量測(cè)定項(xiàng)下木香烴內(nèi)酯的測(cè)定方法，選用225 nm處作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

4.4 超聲提取時(shí)間的選擇：為保證被測(cè)成分提取完全，在供試品細(xì)度、提取溶劑、超聲功率（250 W，頻率40 kHz）一致的情況下，考察了提取時(shí)間為20 min、30 min、40 min的提取效率。結(jié)果顯示，超聲提取20 min、30 min和40 min時(shí)，供試品中木香烴內(nèi)酯的含量基本一致。故將提取時(shí)間確定為30 min，與《中國(guó)藥典》2015年版一部“川木香”含量測(cè)定項(xiàng)下的提取時(shí)間一致。