范 馨 屠寶英 盧碧意（廣東華潤順峰藥業(yè)有限公司 佛山 528000）

葡萄糖酸氯己定軟膏是皮膚科用藥類非處方藥藥品。本品主要成分為葡萄糖酸氯己定，主要雜質(zhì)為對氯苯胺。氯己定為陽離子型表面活性防腐劑，具有廣譜抗菌作用。其作用機(jī)制是改變細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性。該產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)為WS-10001-（HD-0153）-2002，通過提取后用紫外檢測，該方法操作煩瑣，準(zhǔn)確性不強(qiáng)。也沒有對有關(guān)物質(zhì)（例如主要雜質(zhì)對氯苯胺）的檢驗(yàn)。

本次實(shí)驗(yàn)研究采用HPLC雙波長檢測法同時(shí)測定葡萄糖酸氯己定軟膏中的降解產(chǎn)物對氯苯胺和葡萄糖酸氯己定的含量。該方法專屬性強(qiáng)，精密度好，操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

1 儀器與試劑

1.1 儀器：Agilent 1260II型高效液相色譜儀；Dionex U3000型高效液相色譜儀；Starious十萬分之一天平（賽多利斯科學(xué)儀器公司，型號(hào)CPA225D）；超純水機(jī)（廣州東銳科技有限公司，型號(hào)SIMPLICITY185）；超聲波清洗機(jī)（新苗，型號(hào) BX3200H）。

1.2 試劑：醋酸氯己定對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100183-201604）；葡萄糖酸氯己定軟膏（廣東華潤順峰藥業(yè)有限公司，規(guī)格：0.2%，批號(hào)：20181101 20180326-2 20180326-3）；對氯苯胺對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：101398-201601）；色譜甲醇（上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?，批?hào)：0212180902）；磷酸二氫銨（天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20170109）；冰醋酸（阿拉丁，批號(hào)：J1822084）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑[Waters XBridge Shield RP18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）或效能相當(dāng)?shù)纳V柱]；以0.14%磷酸二氫銨溶液（用10%磷酸溶液將pH值調(diào)至3.5）為流動(dòng)相A，以色譜甲醇為流動(dòng)相B，按下表進(jìn)行線性梯度洗脫，流速為每分鐘1.0 mL，檢測波長分別為244 nm和259 nm，柱溫為35℃。理論板數(shù)按對氯苯胺峰計(jì)算不低于2000，對氯苯胺峰與相鄰峰的分離度應(yīng)符合要求。

2.2 溶液的制備

2.2.1 稀釋液的制備：將80 mL的冰醋酸轉(zhuǎn)移到1 000 mL量瓶中，倒入色譜甲醇至標(biāo)線處，搖勻即得

2.2.2 混合對照品溶液的制備：取醋酸氯己定對照品和對氯苯胺對照品適量，加稀釋液溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含葡萄糖酸氯己定0.1 mg（按每1 g的醋酸氯己定相當(dāng)于1.435 g的C22H30Cl2N10·2C6H11O7計(jì)算）、對氯苯胺 0.25 μg的溶液，作為對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備：取軟膏2.5 g（約相當(dāng)于葡萄糖酸氯己定5 mg），精密稱定，置50 mL量瓶中，加入稀釋液約30 mL，置80℃水浴中加熱，小心振搖使葡萄糖酸氯己定溶解，放冷，用稀釋液稀釋至刻度，搖勻，置冰浴中冷卻2 h以上，取出后迅速濾過，續(xù)濾液放冷，作為供試品溶液。

2.2.4 陰性對照溶液：按樣品的處方比例和工藝制備缺葡萄糖酸氯己定的陰性樣品，再按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備陰性對照溶液。

2.3 各溶液色譜行為：葡萄糖酸氯己定軟膏各溶液的色譜圖見圖1、圖 2。

由圖1、圖2可知：對照品溶液位上的目標(biāo)檢測峰與空白溶劑對比，沒有干擾峰。對樣品，空白基質(zhì)進(jìn)行酸堿破壞，光線破壞，氧化破壞，高溫破壞后，主峰附近雜質(zhì)峰與主峰分離度符合要求，空白基質(zhì)、空白溶劑主峰出峰時(shí)間處均無干擾峰。該方法專屬性強(qiáng)。2.4線性關(guān)系考察：試驗(yàn)工作曲線繪制：取醋酸氯己定對照品和對氯苯胺對照品適量，加稀釋液溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含葡萄糖酸氯己定1 mg、對氯苯胺2.5 μg的溶液，作為儲(chǔ)備液。分別取貯備液 0.5 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.5 mL 至10 mL的容量瓶中，分別用稀釋液溶解并稀釋至刻度，得線性溶液。精密量取對照品線性溶液20 μL注入液相色譜儀，按照“2.1”中的洗脫梯度進(jìn)行洗脫，記錄色譜圖。以待測成分濃度為X軸，峰面積為Y軸，作線性回歸，回歸方程與線性范圍見表2。

表2 回歸方程與線性范圍

2.5 準(zhǔn)確度（回收率）：分別精密量取含葡萄糖酸氯己定0.1 mg/mL、對氯苯胺0.25 μg/mL的混合對照品溶液4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL，加入含2.5 g空白基質(zhì)的50 mL容量瓶中，按“2.2.3”項(xiàng)下的方法制成相當(dāng)于原含量80%、100%、120%的供試品溶液。依法測定，結(jié)果見表3。

表3

2.6 精密度與重復(fù)性：取同一混合對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定葡萄糖酸氯己定和對氯苯胺的峰面積RSD分別為0.5%和1.8%（n=6），表明儀器精密度良好；取同一批號(hào)樣品（批號(hào)：20181101），稱取6份，按2的測定方法測定。結(jié)果葡萄糖酸氯己定的平均標(biāo)示含量為95.14%，RSD為1.4%；對氯苯胺的平均標(biāo)示含量為0.063%，RSD為2.3%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性：取同一混合對照液和樣品溶液，分別于室溫下在24 h內(nèi)，觀察溶液性狀，是否有變色沉淀等異?，F(xiàn)象，并在3、6、9、12、15、18、21 h進(jìn)樣，記錄峰面積，混合對照液中氯己定和對氯苯氨峰面積RSD分別為0.4%、0.8%。樣品溶液中氯己定和對氯苯氨峰面積RSD分別為0.5%、3.1%。兩種溶液的性狀均無異常，表明混合對照液和樣品溶液在21 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 結(jié)論：綜上所述，通過采用高效液相色譜法特定的流動(dòng)相組成以及線性梯度洗脫程序，實(shí)現(xiàn)對葡萄糖酸氯己定的含量和有害物質(zhì)對氯苯胺的含量同時(shí)測定?？梢詼?zhǔn)確檢測有害物質(zhì)對氯苯胺的含量，加樣回收率在95%以上?？梢詼?zhǔn)確檢測葡萄糖酸氯己定的含量加樣回收率，在98%～103%之間。

3 討論

目前，葡萄糖酸氯己定軟膏的國家標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)為WS-10001-（HD-0153）-2002，含量測定時(shí)用醋酸氯己定為對照品，計(jì)算時(shí)再折算。我們也以醋酸氯己定為對照品。將醋酸氯己定的乙醇溶液[濃度為10（g/mL）]在 200～300 nm 的波長處掃描可知，醋酸氯己定在259 nm的波長處有最大吸收。另取對氯苯胺的乙醇溶液[濃度為0.25（g/mL）]在200～300 nm的波長處掃描可知，對氯苯胺在244 nm的波長處有最大吸收。通過各相鄰波長的對比實(shí)驗(yàn)可知，對氯苯胺的測定波長以239 nm、242 nm、244 nm比較合適；氯己定以257 nm、259 nm、260 nm比較合適。流動(dòng)相的選擇：以磷酸二氫鉀和磷酸二氫銨溶液為水相，區(qū)別不大；但有機(jī)相若更換為色譜乙腈，氯己峰的出峰時(shí)間會(huì)大大提前，約13 min，而且峰分叉；洗脫梯度的選擇：磷酸鹽與色譜甲醇在25～35 min的時(shí)間段為氯己定峰的時(shí)間段，此時(shí)兩者的比例以（75∶25）至（45∶55）均可以，但當(dāng)磷酸鹽的比例達(dá)60%時(shí)，氯己定不能正常出峰。色譜柱的選擇：由于提取液呈酸性，所以選擇酸性柱。對該方法做耐用性考察，用了三個(gè)品牌的色譜柱，雖然出峰時(shí)間有所不同，但分離效果均相近，表明該檢測方法有較好的適用性。