皮明雪，郭少敏，張 濤，楊雯竹，張敏琴，吳江發(fā)，杜才富

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院油菜研究所，貴陽 550008； 2.安順學(xué)院，貴州 安順 561000)

小孢子培養(yǎng)是通過培養(yǎng)游離花粉小孢子，使得花粉小孢子進行胚胎發(fā)育生成新個體的過程?？梢钥焖偌兓z傳背景復(fù)雜的材料，獲得純合且穩(wěn)定的雙單倍體(Double haploid，DH)再生植株，可縮短育種周期，提高育種效率，在QTL定位、遺傳育種研究和誘變育種等方面具有廣闊的應(yīng)用前景[1-6]。由于條件限制，國內(nèi)小孢子培養(yǎng)的供體材料多生長于大田，小孢子發(fā)育在花期容易受外界環(huán)境擾動的影響；吳士紅等研究認(rèn)為，在高海拔地區(qū)的出胚率比在低海拔的出胚率高[7]。高海拔地區(qū)的天氣在油菜開花期相對穩(wěn)定，促進了小孢子同步發(fā)育。趙小萍等認(rèn)為，供體植株在人工氣候室生長條件下的小孢子培養(yǎng)出胚效果比大田和溫室的好[8]，人工氣候室的光照、溫度和濕度均可自動化控制，可免供體植株受外界環(huán)境沖擊，利于得到發(fā)育同步性高的小孢子。小孢子再生苗誘導(dǎo)培養(yǎng)時通常15 d左右需要換一次培養(yǎng)基進行繼代培養(yǎng)，長出再生植株需繼代2～3次，為減少時間和經(jīng)濟成本，應(yīng)提高胚狀體一次成苗率。目前，在實際應(yīng)用中存在再生苗加倍率較低的問題，并且由于常用的秋水仙素毒性較大，單純的加大秋水仙素的用量和延長處理時間不能很好的解決問題，這大大降低了小孢子培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用價值。因此，提高出胚率、小孢子胚一次成苗率和加倍率一直是小孢子培養(yǎng)技術(shù)的重要研究點。本試驗研究了不同基因型對小孢子培養(yǎng)胚產(chǎn)量和再生植株自然加倍率的影響，以及小孢子振蕩培養(yǎng)過程中光照條件與后期低溫處理對胚狀體一次成苗率和再生植株自然加倍率的影響，以期提高油菜小孢子培養(yǎng)效率，優(yōu)化油菜小孢子培養(yǎng)、再生和加倍技術(shù)體系；并獲得了一個胚產(chǎn)量和自然加倍率都很高的甘藍(lán)型油菜DH系。

1 材料和方法

1.1 供體材料

試驗材料為7個甘藍(lán)型油菜F1雜交種和1個DH系(表1)，F(xiàn)1親本均為DH系。18 G 309和D 256為經(jīng)過檢驗的出胚較高的DH單株系，Q 219B系列，5365系列來自2018年育種親本純化得到的DH株系，育種親本出胚較好。F1雜交都是在5365系列和Q 219 B系列的DH單株開花后進行的，F(xiàn)1雜種和D 256于2019年6月上旬種植在貴州省油菜研究所的人工氣候室(25～16 ℃)，每個材料選用8株供體植株，于2019年8月中旬至9月中旬取材，供體生長期間控制好水肥。

1.2 方 法

1.2.1小孢子的提取與培養(yǎng)

選擇在08：00—10：00時取材，選取健康植株的主花序和生長狀態(tài)較好的分支花序，用冰盒帶回實驗室備用。小孢子的提取與培養(yǎng)方法參照余鳳群等[9]的方法。

1.2.2振蕩培養(yǎng)光照條件和低溫處理

25 ℃恒溫培養(yǎng)至肉眼可見胚出現(xiàn)時，將培養(yǎng)皿移至50 r·min-1、25 ℃恒溫?fù)u床上振蕩培養(yǎng)，并進行光照培養(yǎng)(16 h光/8 h暗，光強2 000 lx)和暗培養(yǎng)2個處理，7 d后統(tǒng)計胚產(chǎn)量(胚·蕾-1)，并將出胚較好的2個基因型材料的子葉胚置于4 ℃條件下，分別進行0、5、10、15、20、25 d的低溫處理。

1.2.3一次成苗率和自然加倍率的統(tǒng)計

將低溫處理過的子葉型胚接種在瓊脂濃度為8 g·L-1的B 5固體培養(yǎng)基上，于25 ℃，16 h光/8 h暗，15 000 lx光照強度條件下培養(yǎng)，15 d后統(tǒng)計一次成苗率(長出3～5片葉子并形成根系計為成苗)。將成苗植株取出，洗去培養(yǎng)基后移栽到濕潤的土壤中，蓋上薄膜保濕，置于人工氣候室中練苗，7 d后揭開薄膜，14 d后移栽至地里(期間每天適當(dāng)澆水)，在盛花期和結(jié)果期，參照程利華[10]的方法統(tǒng)計自然加倍率，根據(jù)花的大小、花藥發(fā)育情況、成熟花粉粒量以及角果形態(tài)，將植株分為自然加倍型和未加倍型。

2 結(jié) 果

2.1 基因型和母本效應(yīng)對甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)胚產(chǎn)量的影響

在本試驗中，對8份甘藍(lán)型油菜進行小孢子培養(yǎng)，統(tǒng)計胚產(chǎn)量。5365-19新9和5365-21新6源于同一個育種材料背景5365的DH株系后代，胞質(zhì)來源相同，基因型高度相似；Q 219 B-1和Q 219 B-3與之情況相同。結(jié)果如表1所示，材料間存在顯著差異，2個F1代雜交種D 393和D 524的胚產(chǎn)量很高，分別為119.87胚·蕾-1和98.48胚·蕾-1；DH系D 256次之，胚產(chǎn)量為68.51胚·蕾-1；其它幾個材料的胚狀體產(chǎn)量則較少，尤其D 485沒有獲得胚狀體。D 284和D 485的親本基因型相似，胚產(chǎn)量結(jié)果相差不大，D 381和D 407也如此；而D 393和D 407的父本相同，母本不同，胚產(chǎn)量結(jié)果卻存在顯著差異，分別為119.87胚·蕾-1和23.10胚·蕾-1；D 393和D 372共用了DH親本18 G 410，其余親本5365-19新9和5365-21新6基因型高度相似，胚產(chǎn)量分別為119.87胚·蕾-1和13.72胚·蕾-1，差異顯著。結(jié)果表明，基因型是影響甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)胚產(chǎn)量的重要因素。

表1 不同基因型甘藍(lán)型油菜的小孢子胚產(chǎn)量結(jié)果

2.2 振蕩培養(yǎng)光照條件和低溫處理對甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)一次成苗率的影響

在天然狀態(tài)下，從完成受精作用形成種子胚到種子發(fā)育成熟的過程中，油菜種胚也可以進行光合作用為自身提供營養(yǎng)。小孢子胚打破了花粉的發(fā)育進程成為胚狀體，在培養(yǎng)過程中可以進行光合作用，為探究光照是否可以促進胚狀體成熟，故而設(shè)計了培養(yǎng)過程中的光照/黑暗培養(yǎng)對比。

因D 393和D 524在振蕩光照培養(yǎng)與黑暗培養(yǎng)條件下出胚效果較好，故選為試驗材料，分別于4 ℃低溫條件下處理0、5、10、15、20、25 d后，將子葉型胚培養(yǎng)于B 5固體培養(yǎng)基上，半個月后統(tǒng)計一次成苗率。結(jié)果如表2所示，D 393的一次成苗率在振蕩光照培養(yǎng)與黑暗培養(yǎng)條件下沒有顯著差異，但隨著低溫處理時間的延長呈先升高后降低的趨勢；D 524同樣如此。在光照培養(yǎng)條件下，D 393在低溫處理15 d后的一次成苗率最高，為54.95%，暗培養(yǎng)條件下同樣低溫處理15 d的一次成苗率最高，為61.48%，均顯著高于對照；在光照和暗培養(yǎng)條件下，D 524的一次成苗率均是在低溫處理15 d后最高，分別為44.07%和50.28%，顯著高于對照。因此，甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)的一次成苗率與振蕩培養(yǎng)的光照條件關(guān)系不大，但受到低溫處理時間的顯著影響，尤其4 ℃低溫處理15 d能提高小孢子一次成苗率0.8～3倍。

表2 振蕩培養(yǎng)光照條件和低溫處理對甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)一次成苗率的影響

2.3 基因型、光照條件和低溫處理對甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)自然加倍率的影響

在盛花期和結(jié)果期，分別觀察經(jīng)過振蕩光照培養(yǎng)與黑暗培養(yǎng)及各低溫處理的D 393和D 524小孢子再生苗的田間表型，將花序軸較粗壯、花蕾大能正常開花、花大小同正常二倍體、花藥發(fā)育完全、成熟花粉量大、能正常散粉、角果長而飽滿的植株計為加倍型；花序軸細(xì)、花蕾較小、大部分花未開便脫落、部分能開花、花也較小、多數(shù)花藥強烈退化、有些花藥小且空癟不能散粉、結(jié)成短小蘿卜狀角果的植株計為未加倍型。如表3所示，在光照培養(yǎng)下，D 393的自然加倍率與暗培養(yǎng)的沒有明顯差異，各個低溫處理時間下的加倍率差異也不顯著；D 524也是如此。D 393的自然加倍率在73.52%～85.05%之間，均值為79.87%；D 524的自然加倍率在21.49%～33.41%之間，平均為28.00%；D 393的平均加倍率是D 524的2.85倍。結(jié)果表明，自然加倍率沒有受到振蕩培養(yǎng)過程中的光照以及低溫的影響，而基因型對小孢子再生植株的自然加倍率影響較大。

表3 基因型、光照條件和低溫處理對甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)自然加倍率的影響

3 討 論

3.1 基因型影響胚產(chǎn)量

供體材料的基因型是影響甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)胚產(chǎn)量的重要因素[11-13]。統(tǒng)計了8個不同基因型甘藍(lán)型油菜材料的胚產(chǎn)量，其中只有D 393和D 524這2個F1代雜交種和DH系D 256的胚產(chǎn)量較高，每蕾分別高達(dá)119.87、98.48胚和68.51胚，其它幾個材料則胚狀體產(chǎn)量較少，甚至有的為0，差異極顯著，表明基因型對甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)胚產(chǎn)量的影響很大。王漢中等[12]對42個不同基因型材料進行小孢子培養(yǎng)，結(jié)果不同材料的平均胚產(chǎn)量變幅為每蕾0～11.67胚；在李書宇[13]的研究中，64份不同基因型材料的胚產(chǎn)量也存在較大差異，每蕾變幅為0～31.23胚。本研究中最高胚產(chǎn)量比以上研究高出很多，除了基因型的原因，可能還與供體植株種植在人工氣候室，小孢子發(fā)育同步性高有關(guān)[8]。

本研究發(fā)現(xiàn)，基因型的影響中，母本對于小孢子培養(yǎng)的出胚效果影響更大。在本研究中，具有相同母本的材料出胚率不同，D 393、D 284和D 485；D 381和D 407之間差異顯著；說明相同的母本組合中，母本對父本的響應(yīng)有所不同。相同的父本組合材料之間，D 393和D 407的差異為5.2倍；D 524和D 381之間的差異達(dá)20.86倍；因此相同父本情況下，母本材料選擇的不同，對出胚率可能有巨大的影響，但還需進一步的實驗進行證實。劉澤等[14]研究表明，出胚率高的親本雜交，其F1代一般具有較高的出胚率；2個出胚率低的親本雜交，所得F1雜種的出胚率并非最低，但是高產(chǎn)胚率親本與低產(chǎn)胚率親本雜交后，改良F1雜種胚產(chǎn)量的效果并不明顯。本研究的結(jié)果與之類似，但是母本的選擇有望使得油菜小孢子培養(yǎng)選擇時，獲得更高的出胚率。

3.2 一次成苗率提高的可能性

低溫處理對甘藍(lán)型油菜小孢子胚狀體的一次成苗率有顯著影響。本研究探究了甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)中振蕩培養(yǎng)的光照條件和低溫處理時間對胚狀體一次成苗率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，一次成苗率沒有受到振蕩培養(yǎng)光照條件的影響，但隨著4 ℃低溫處理時間的延長呈先升高后降低的趨勢，在低溫處理15 d時最高。研究表明，2 ℃低溫處理的效果比4 ℃好，10 ℃對成苗率影響不大[15,16]。低溫處理時期(胚狀體轉(zhuǎn)接到B 5固體培養(yǎng)基之前或之后)對胚狀體成苗率的影響也不明顯，但是后者所占空間較大，不便操作[17]。低溫處理對小孢子胚狀體再生率的影響主要在于低溫處理時間，研究認(rèn)為，低溫處理4 d最佳，也有人認(rèn)為最佳低溫處理時間為10 d和14 d[16-18]。不同研究者得到的最佳低溫處理時間有所不同，可能與供體材料的基因型及選取時間段不同有關(guān)。但總的來說，4 ℃低溫處理10～15 d能顯著提高甘藍(lán)型油菜小孢子胚狀體的一次成苗率。Dias研究發(fā)現(xiàn)，川貝母胚狀體內(nèi)的過氧化物酶活性和表達(dá)量受到了低溫處理的誘導(dǎo)上調(diào)，因此他認(rèn)為過氧化物酶是川貝母小孢子胚狀體成苗的重要因素[19]；萬麗麗等認(rèn)為，低溫處理顯著提高小孢子胚狀體再生能力的原因可能是低溫處理引起了小孢子再生過程中超氧化物酶活性的下降，極大加快了呼吸速率與熱量的產(chǎn)生，使次生代謝物質(zhì)產(chǎn)生減少，從而避免了細(xì)胞脫分化[18]。在甘藍(lán)型油菜中，低溫處理能提高小孢子胚狀體一次成苗率的原因是否與過氧化物酶有關(guān)有待進一步探究。

3.3 自然加倍率的提高

理論上，小孢子只攜帶了供體植株的一半染色體，由小孢子得到的再生植株應(yīng)為單倍體，但是實際上不同植物小孢子再生植株都出現(xiàn)了不同比例的二倍體化。甘藍(lán)型油菜的小孢子植株自然加倍率普遍較低。本研究中，D 393的自然加倍率在73.52%～85.05%之間，D 524的為21.49%～33.41%，D 393的加倍率是D 524的2～3倍。在程利華[10]的研究中，7份甘藍(lán)型油菜中有3個材料的植株中發(fā)生了自然加倍，最高的加倍率達(dá)到94.33%，其余2個僅有7.69%和4.55%，而其它4個材料的則為0。結(jié)果表明，基因型對小孢子再生植株的自然加倍率影響較大。研究發(fā)現(xiàn)，小麥的小孢子再生植株自然加倍率受到低溫預(yù)處理的影響[20,21]。在本研究中甘藍(lán)型油菜D 393和D 524植株的自然加倍率沒有受到振蕩培養(yǎng)過程中光照條件以及后期低溫處理的影響，至于會不會受到低溫預(yù)處理的影響有待進一步研究。大白菜小孢子再生植株的自然加倍率普遍較高，比甘藍(lán)型油菜和甘藍(lán)都要高，但是受基因型影響[22]。多數(shù)白菜材料自然加倍率可達(dá)50%以上，還有不少材料高達(dá)70%以上[23,24]。李菲等[25]探討了大白菜小孢子培養(yǎng)自然加倍的機理，認(rèn)為小孢子培養(yǎng)的自然加倍發(fā)生在胚誘導(dǎo)初期，大白菜小孢子再生植株較高的自然加倍率可能與小孢子培養(yǎng)中熱激誘導(dǎo)激發(fā)了單倍體小孢子核的加倍有關(guān)。激素處理或其他誘導(dǎo)方法也一樣能導(dǎo)致單核小孢子加倍[26]。目前還沒有關(guān)于甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)自然加倍機理的相關(guān)報道，D 393的胚產(chǎn)量和自然加倍率很高，具有研究意義。