時凱旋，趙凱旋，訾明茹，李 賀，馬春英

(河北農業(yè)大學農學院，河北 保定 071000)

知母是我國傳統(tǒng)的常用藥材，為百合科植物知母(AnemarrhenaasphodeloidesBge.)的干燥根莖，具有清熱瀉火、滋陰潤燥的功效。用于外感風熱，肺熱燥咳，腸燥便秘等癥。知母主產于山西、河北、內蒙古等地，其中河北易縣一帶是知母的道地產區(qū)，稱“西陵知母”。隨著知母藥材出口量和國內市場需求量的不斷增加，野生知母的資源瀕危，人工栽培知母逐漸進入市場。目前，河北省是人工栽培知母的主要產區(qū)，據2017年統(tǒng)計數(shù)據，河北省知母的種植面積超過4 000 hm2。

中藥材質量受多方面因素的影響，其中種子是中藥材生產的源頭，種子質量的真?zhèn)蝺?yōu)劣直接影響藥材的產量與質量。因此，開展中藥材種子質量檢驗研究，是我國中藥材規(guī)范化生產急需解決的重要問題[1]。目前，關于藥用植物種子質量標準研究常見報道[2,3]，其中，中藥材種子檢驗和質量標準多是參照我國農作物種子的檢驗和質量標準，但是種子特性不同，適合的種子指標檢驗方法不同。以含水量測定為例，王書云等對金銀花種子含水量測定中發(fā)現(xiàn)，采用低溫[(105±2)℃]烘干3 h后無顯著變化[4]；楊敏等對肉蓯蓉種子含水量測定中發(fā)現(xiàn)，采用高溫[(130±2)℃]烘干12 h后無顯著變化[5]。由此可見，建立不同種子的質量檢驗方法非常必要。

本實驗以藥用植物知母種子為材料，選擇千粒重、含水量、發(fā)芽率、生活力4個代表種子質量的重要指標，展開對4個指標測定方法的探索和研究，旨在確定知母種子千粒重、含水量、發(fā)芽率和生活力的檢驗方法，以期為知母種子質量檢驗規(guī)程的制定提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

知母種子于2018年在安國藥博園隨機選2份果穗，帶回河北農業(yè)大學實驗室脫粒，開展實驗。

1.2 儀器和試劑

BIC.250人工氣候箱，DHG-9240 A電熱恒溫鼓風干燥箱，電子天平，水浴鍋，培養(yǎng)皿，溫度計，燒杯，鑷子，刀片，發(fā)芽盤；蛭石，營養(yǎng)土，TTC粉末(批號：No.101100032)

1.3 方 法

1.3.1千粒重測定

按照農作物種子檢驗規(guī)程(GB/T 3543-1995)[6]中重量測定法執(zhí)行。本實驗分別采用百粒法、五百粒法及千粒法測定知母種子千粒重。具體方法如下：從供試樣品中隨機數(shù)取100，500，1 000粒凈種子，用電子天平稱重，并分別重復8次、3次和2次，記錄其重量。

1.3.2含水量測定

按照農作物種子檢驗規(guī)程(GB/T 3543-1995)[6]中水分測定法執(zhí)行。本實驗采用高溫烘干法：分別在(133±2)℃高溫條件下，設置1、2、3、4、5、6 h對種子含水量進行測定。每份處理重復4次，每次稱重(2.500±0.005)g。將種子于(133±2)℃下烘干，每隔1 h測定種子質量并記錄。

種子含水量=[(烘干前供檢種子質量-烘干后供檢種子質量)/烘干前供檢種子質量]×100%。

1.3.3知母種子生活力測定方法探究

按照種子常規(guī)檢驗方法TTC染色法[7]進行。本實驗采用3因素4水平正交試驗設計探索知母種子生活力測定條件，TTC染色時間設2、3、4、5 h，濃度設0.10%、0.20%、0.40%、0.50%，溫度設25、30、35、40 ℃。隨機數(shù)取1號種子，每個處理100粒，為了更準確的探究知母種子生活力測定條件，本實驗選取飽滿的知母種子。在30～35 ℃溫水中浸泡24 h后，用刀片將吸脹的種子沿種子胚中心線縱切成兩半，將其中的一半置于培養(yǎng)皿中，用TTC溶液染色并置于恒溫培養(yǎng)箱中；將另一半在沸水中煮5 min殺死胚，同樣方法進行染色處理，作為對照觀察。染色結束后，瀝去溶液，用清水沖洗，將種仁擺在培養(yǎng)皿中，逐一觀察知母種子染色情況，記錄并計算活種子的百分率。

種子生活力(%)=(染色種子個數(shù)/待測種子總數(shù))×100%。

種子著色的標準為胚完全著色，并呈現(xiàn)紅色為有生活力。胚著色淺，呈粉色的為生活力弱的種子,在本實驗中，將著色淺的和不著色的都歸為無生活力種子[7]。

1.3.4發(fā)芽率測定

按照農作物種子檢驗規(guī)程(GB/T 3543-1995)[6]進行發(fā)芽試驗。采用營養(yǎng)土和蛭石2∶1的比例為發(fā)芽床，設15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃ 4個處理，每個處理重復4次，每個重復50粒種子，放入人工氣候箱中培養(yǎng)，隨時補給水分，保持營養(yǎng)土濕潤。以胚軸伸出營養(yǎng)土2 mm為發(fā)芽標準，每天09：00時觀察知母種子發(fā)芽情況并記錄，計算知母種子發(fā)芽勢，觀察至第15天，統(tǒng)計知母種子發(fā)芽總數(shù)并計算發(fā)芽率。

發(fā)芽勢(%)=(發(fā)芽高峰期發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%；

發(fā)芽率(%)=(發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%。

1.3.5統(tǒng)計方法

應用SPSS 21.0軟件對試驗結果進行統(tǒng)計分析，得出知母種子質量檢驗方法。

2 結果與分析

2.1 知母種子千粒重分析

由表1可知，2份種子百粒法、五百粒法和千粒法的變異系數(shù)均未超過3.0%，千粒法測定變異系數(shù)最小，平均值為0.661%。經統(tǒng)計分析，3種方法間差異性不顯著(p>0.05)，均可作為知母種子千粒重的測定方法?？紤]到時間成本等因素，知母種子千粒重測定可以用百粒法。

表1 知母種子重量測定結果

2.2 知母種子含水量分析

知母種子在高溫(133±2)℃下烘干4～5 h后，含水量基本保持穩(wěn)定，且在5～6 h內無顯著變化，綜合2份種子情況，高溫烘干法測定知母種子宜選擇在高溫(133±2)℃下烘干5 h(表2)。

表2 不同烘干時間知母種子含水量比較(n=4)

2.3 知母種子生活力分析

本實驗采用3因素4水平的正交試驗設計，利用TTC染色法對1號知母種子進行生活力測定。影響知母種子胚著色率因素的主次關系是：TTC濃度對知母種子胚著色率影響最大，時間影響次之，溫度影響最?。籘TC濃度方差分析顯示：隨著TTC濃度升高，知母種子胚著色率呈先升后降的趨勢，TTC濃度為0.2%時，知母種子胚著色率最高，之后開始下降。極差分析結果顯示：知母種子生活力測定的適宜條件為TTC濃度0.2%，染色時間5 h，染色溫度35 ℃(表3)。

表3 四唑不同處理對知母種子生活力檢測(n=100)

2.4 知母種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢分析

在對知母種子進行發(fā)芽率實驗過程中，以胚軸伸出營養(yǎng)土2 mm時為初次計數(shù)時間。結果表明：15 ℃、20 ℃條件下知母種子在第10天開始發(fā)芽，發(fā)芽速度慢，發(fā)芽過程中未出現(xiàn)發(fā)芽高峰，所以沒有計算知母種子發(fā)芽勢；25 ℃、30 ℃條件下知母種子在第4天開始發(fā)芽，第7天發(fā)芽數(shù)最多，所以25 ℃、30 ℃條件下發(fā)芽勢依據第7天的種子發(fā)芽數(shù)計算；15 ℃、20 ℃、25 ℃和30 ℃條件下均在第15天種子萌發(fā)達到最高且以后再無種子萌發(fā)，所以第15天為末次計數(shù)時間。結果表明，15 ℃下2份種子幾乎都不發(fā)芽；20 ℃下2份種子發(fā)芽率均較低；15 ℃、20 ℃下知母種子發(fā)芽率與25 ℃、30 ℃下知母種子發(fā)芽率差異性顯著；25 ℃下種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢與30 ℃下差異性不顯著，考慮到30 ℃下種子發(fā)芽需水量大等實際情況，選擇25 ℃為知母種子的最適發(fā)芽溫度(表4)。

表4 不同發(fā)芽溫度下知母種子發(fā)芽情況比較(n=3)

3 討 論

種子檢驗是農業(yè)生產上控制種子質量的必須手段，通過檢驗可以確定種子在生產中的利用價值，種子是農業(yè)增產增效的根本因素，種子質量好壞決定了現(xiàn)代農業(yè)高質量發(fā)展水平，種子質量監(jiān)控體系的建立和推行，是提高和保障種子質量的重要舉措[8]。近年來，藥用植物需求量增加，野生藥用植物數(shù)量不能滿足需求，栽培藥用植物已經納入藥材體系，在栽培藥用植物過程中，種子是源頭，種子質量優(yōu)劣直接影響中藥材的質量與產量，開展中藥材種子質量檢驗研究十分必要。

衡量種子質量的指標有很多，金銀花種子質量標準制定中選用了真實性鑒定、凈度、含水量、千粒重、胚率、生活力和發(fā)芽率等指標[4]，連翹種子質量標準制定中選用了凈度、千粒重、含水量、生活力和發(fā)芽率等指標[9]，黃芩種子質量標準制定中選用了千粒重、形態(tài)大小、含水量、飽滿度、生活力和發(fā)芽率等指標[11]，這些種子質量標準均參照《中國農作物種子檢驗規(guī)程》，但綜合這些文獻，千粒重、含水量、發(fā)芽率和生活力是共有的指標，說明在制定藥用植物種子質量標準中這4個指標比較重要，所以，本實驗以知母種子為實驗材料，對千粒重、含水量、生活力和發(fā)芽率4個指標的檢驗方法進行了探索，旨在確定知母種子質量指標的檢驗方法，為開展藥用植物種子質量研究提供依據。

《中國農作物種子檢驗規(guī)程》規(guī)定種子含水量測定有高溫烘干法(133±2)℃和低溫烘干法(105±2)℃ 2種方法。李書敏等[9]對連翹種子含水量測定后確定采用高溫法烘干，劉鈺萍等[10]對紅花種子含水量測定后確定采用低溫法烘干8 h。邢丹等對知母種子含水量的2種烘干方法進行探究，結果表明：高溫下需烘干5 h，低溫下需烘干15 h，且二者差異不明顯[7]。考慮到低溫烘干法耗時長，本實驗知母種子含水量測定采用高溫烘干法(133±2)℃，烘干5 h后含水量無顯著變化，與邢丹等[7]的實驗結果一致。

葛人杰等對黃芩種子質量的分級標準研究中發(fā)現(xiàn)，不同產地黃芩種子在千粒重、生活力和飽滿度等特性方面均有差異，且不同產地種植環(huán)境與氣候均不同，因此適宜不同產地黃芩種子的發(fā)芽溫度也不同[11]。藥用植物種子的發(fā)芽溫度是由種子的特性決定的，或者與藥用植物的起源地有關。因此，本實驗分別探究知母種子在15、20、25、30 ℃下的發(fā)芽率和發(fā)芽勢，以期獲得知母種子在北方的適宜發(fā)芽溫度。實驗表明，25 ℃為最適發(fā)芽溫度。

植物種子生活力快速檢測時普遍采用TTC染色法，牧草種子生活力標準中采用濃度為0.5%TTC溶液[12]。邢丹等[7]和尤麗霞等[13]在對知母種子活力測定時同樣選用的是高濃度(0.5%)的TTC溶液。本實驗發(fā)現(xiàn)，隨著TTC濃度的提高，知母種子活力表現(xiàn)出先升后降的趨勢，濃度為0.2%TTC種子生活力最大，這與李書敏等[9]的實驗結果一致。這可能與知母種子胚中脫氫酶有關，種子胚內底物在脫氫酶的催化作用下將氫傳遞給TTC，TTC進一步轉化為紅色物質，而且TTC溶液本身具有毒性，對酶活性與產物均有抑制，因此TTC溶液濃度過高或過低均會影響脫氫酶的轉化作用[14]。

通過本實驗，對藥用植物知母種子的質量檢測指標千粒重、含水量、生活力和發(fā)芽率的測定建立了相應的標準。千粒重測定用百粒法；含水量測定，采用高溫法(133±2)℃下烘干5 h；生活力測定TTC濃度0.2%，染色溫度35 ℃，染色時間5 h；發(fā)芽溫度為25 ℃。為知母種子或其他藥用植物種子質量標準的制定提供了依據，為藥用植物的規(guī)范化種植提供了源頭上的標準。