王躍華, 陳 芳, 陳 燕, 高 妍, 楊 鋒, 陳國豪

(1.成都大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，四川 成都 610106； 2.成都列五中學(xué)，四川 成都 610007)

杜鵑蘭(Cremastraappendiculata(D.Don)Makino)為蘭科(Orchidaceae)多年生珍稀藥用植物[1]，主要分布于中國的貴州和四川。杜鵑蘭植物以其假鱗莖入藥，藥材習(xí)稱“山慈菇”；具有清熱解毒、潤肺止咳、活血止痛、消腫散結(jié)，內(nèi)用可抗肝癌、乳腺癌、子宮癌等，外用治瘡毒、蛇蟲咬傷、皮膚燙傷等功效[2-4]。杜鵑蘭自然貯存量極少，加之無計(jì)劃的人為采挖，野生資源瀕臨枯竭。杜鵑蘭作為蘭科植物，其種子萌發(fā)首先是產(chǎn)生原球莖。但因杜鵑蘭種胚發(fā)育不成熟、缺少胚乳和種皮透水透氣性差等原因[5]，從而造成其在自然條件下很難萌發(fā)；目前杜鵑蘭在自然界主要依靠假鱗莖進(jìn)行分株繁殖，但存在栽培成本高、效率低和難以開展大規(guī)?；茝V種植等問題。為了解決杜鵑蘭種苗嚴(yán)重短缺的瓶頸問題。本研究以杜鵑蘭種子為材料，探討了不同因素處理對其種子誘導(dǎo)原球莖的影響，成功獲得了杜鵑蘭植物原球莖誘導(dǎo)的最適條件，為實(shí)現(xiàn)杜鵑蘭優(yōu)質(zhì)種苗的規(guī)?；a(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

杜鵑蘭蒴果采于四川省雅安市天全縣老場鄉(xiāng)；經(jīng)四川師范大學(xué)馬丹煒教授鑒定為蘭科(Orchidaceae)杜鵑蘭屬杜鵑蘭(Cremastraappendiculata(D.Don.)Makino)植物的蒴果。

1.2 儀器與試劑

1.2.1儀器設(shè)備

SW-QJ-2 F超凈工作臺(tái)(蘇州 安泰)、LDZX-75 KB高壓蒸汽滅菌鍋(上海 申安)、SMZ 161體式解剖鏡(寧波 坤寧)等。

1.2.2實(shí)驗(yàn)試劑

B 5培養(yǎng)基、MS培養(yǎng)基、1/2 MS培養(yǎng)基、KC培養(yǎng)基、乙醇、無菌水、次氯酸鈣(Ca(ClO)2)、0.1%氯化汞(升汞)、臺(tái)盼蘭染液。

1.3 方 法

1.3.1升汞消毒時(shí)間對杜鵑蘭種子生長的影響

選取成熟未開裂的杜鵑蘭蒴果，放在超凈工作臺(tái)上，先用70%乙醇擦拭蒴果表面3次后，用無菌手術(shù)刀縱向?qū)Π肭虚_蒴果后取出種子置于無菌試劑瓶備用。

取杜鵑蘭種子先用70%乙醇浸泡30 s后，再用0.1%升汞消毒不同時(shí)間，最后用無菌水清洗3次，按每瓶200粒左右的杜鵑蘭種子數(shù)將其接入MS培養(yǎng)基中，輕輕搖晃培養(yǎng)基表面使杜鵑蘭種子均勻散布在培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7 d后觀察杜鵑蘭種子的染菌情況，并用臺(tái)盼藍(lán)染液對其培養(yǎng)的種子進(jìn)行染色觀察，計(jì)算出杜鵑蘭種子的存活率。

1.3.2不同方式處理對杜鵑蘭種子萌發(fā)產(chǎn)生原球莖的影響

采用L9(33)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以基本培養(yǎng)基類型(1/2 MS、B 5、KC)、Ca(ClO)2浸泡濃度(0、3.0%、5.0%)和浸泡溫度(15、25、50 ℃)為3個(gè)因素，每個(gè)因素各設(shè)3個(gè)水平，研究基本培養(yǎng)基類型、Ca(ClO)2浸泡濃度和浸泡溫度對杜鵑蘭種子原球莖誘導(dǎo)的影響，具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 L9(33)原球莖誘導(dǎo)因素水平

1.3.3不同激素配比對杜鵑蘭原球莖誘導(dǎo)的影響

將消毒后的杜鵑蘭種子放在50 ℃的3.0% Ca(ClO)2溶液中處理30 min后，接種到添加有不同激素配比的B 5培養(yǎng)基中，培養(yǎng)60 d后統(tǒng)計(jì)杜鵑蘭種子產(chǎn)生原球莖誘導(dǎo)率。

1.3.4培養(yǎng)室條件

溫度設(shè)置為20 ℃、光照強(qiáng)度為1 800 lx、每天光照12 h。

1.3.5數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)處理采用Excel 2010軟件與正交助手Ⅱ軟件完成。

存活率(%)=(未染色種子數(shù)/接種種子數(shù))×100%;

染菌率(%)=(染菌種子瓶數(shù)/接種種子瓶數(shù))×100%;

原球莖誘導(dǎo)率(%)=(誘導(dǎo)出原球莖種子數(shù)/接種種子數(shù))×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同升汞消毒時(shí)間對杜鵑蘭種子生長的影響

杜鵑蘭種子采用0.1% 升汞消毒不同時(shí)間后，接入MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d，實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。

表2 不同消毒時(shí)間對杜鵑蘭種子生長的影響

由表2可以看出，隨著升汞消毒時(shí)間由A 1的3 min逐漸延長到A 4的12 min，杜鵑蘭種子的染菌率呈逐漸下降的趨勢；具體表現(xiàn)在當(dāng)升汞消毒時(shí)間A 1采用3 min時(shí)，其杜鵑蘭種子染菌率最高，為46.3%，而此時(shí)杜鵑蘭種子的存活率為72.8 %，觀察發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的部分種子因染菌而出現(xiàn)了死亡。當(dāng)升汞消毒時(shí)間繼續(xù)延長到12 min時(shí)，盡管此時(shí)杜鵑蘭種子的染菌率最低(6.5%)，但其種子的存活率也是最低(43.5%)；通過臺(tái)盼藍(lán)染色觀察發(fā)現(xiàn)，杜鵑蘭種子長時(shí)間的用升汞消毒處理后，會(huì)造成其種子細(xì)胞因中毒而死亡。綜合考慮升汞消毒時(shí)間與杜鵑蘭種子的染菌率與存活率之間的關(guān)系可以得出，A 2當(dāng)升汞消毒時(shí)間采用6 min時(shí)，其杜鵑蘭種子的染菌率較低(15.6 %)，而此時(shí)種子的存活率卻是最高(95.7%)；因此0.1%升汞消毒杜鵑蘭種子的最佳時(shí)間是6 min。

2.2 不同因素處理對杜鵑蘭種子萌發(fā)產(chǎn)生原球莖的影響

根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將杜鵑蘭種子用不同溫度和濃度的Ca(ClO)2溶液浸泡30 min后，接入不同類型的基本培養(yǎng)基中，培養(yǎng)60 d后觀察并記錄原球莖誘導(dǎo)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3和表4。

表3 L9(33)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果統(tǒng)計(jì)

由表3可知，以杜鵑蘭種子為材料，原球莖誘導(dǎo)率最高的是5號組合A 2 B 2 C 3，即種子在50 ℃的3.0% Ca(ClO)2溶液中浸泡30 min后轉(zhuǎn)接入B 5基本培養(yǎng)基中，培養(yǎng)60 d后原球莖誘導(dǎo)率可達(dá)55.78%。通過極差分析可知，3個(gè)因素對杜鵑蘭種子原球莖誘導(dǎo)的影響程度依次為B>A>C，即Ca(ClO)2溶液濃度影響最大，基本培養(yǎng)基次之，影響最小的是浸泡溫度。

通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將種子用50 ℃、3.0%Ca(ClO)2預(yù)處理30 min后，接入B 5培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)30 d，在解剖鏡下觀察，種皮已變得透明，種胚體積也明顯增大并開始突破種皮，形成半透明橢圓形原球莖；在培養(yǎng)50 d后，觀察發(fā)現(xiàn)形成的原球莖體積進(jìn)一步增大，顏色也變?yōu)榘咨螯S白色、質(zhì)地緊密。研究中還發(fā)現(xiàn)有大量未經(jīng)Ca(ClO)2預(yù)處理的種子種胚膨大后無法突破種皮，顏色逐漸變?yōu)楹稚笏劳觥?/p>

由表4可知，3個(gè)因素中僅因素B達(dá)到顯著水平，因素Ca(ClO)2濃度檢驗(yàn)值F=27.08，F(xiàn)0.05= 19.00，F(xiàn)0.01= 99.00，檢驗(yàn)值F0.05

表4 方差分析

2.3 不同激素配比對杜鵑蘭種子萌發(fā)產(chǎn)生原球莖的影響

將消毒后的杜鵑蘭種子，接入以B 5為基本培養(yǎng)基，并附加6-BA與NAA不同激素配比的表5培養(yǎng)基中，培養(yǎng)60 d后統(tǒng)計(jì)杜鵑蘭種子原球莖的誘導(dǎo)率。

從表5實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，B 0編號的杜鵑蘭種子在沒有添加任何激素的B 5基本培養(yǎng)基上生長，其杜鵑蘭種子的原球莖誘導(dǎo)率最低(54.64%)，由此說明一定種類的激素配比有利于杜鵑蘭種子萌發(fā)產(chǎn)生原球莖。第1組(編號B 1～B 4)在6-BA保持0.1 mg·L-1不變的情況下，隨著NAA濃度由0到0.3 mg·L-1逐漸升高，其原球莖的誘導(dǎo)率呈出先升高后降低的變化過程，其中以編號B 3的原球莖誘導(dǎo)率為最高(63.28%)；第2組(編號B 5～B 8)在6-BA保持0.2 mg·L-1不變的情況下，隨著NAA濃度由0到0.3mg·L-1逐漸升高，其原球莖的誘導(dǎo)率也呈先升高后降低的變化過程，其中以編號B 7的原球莖誘導(dǎo)率為最高(70.23%)；進(jìn)一步分析第1組編號B 3和第2組編號B 7又可以發(fā)現(xiàn)，在NAA 0.2 mg·L-1保持不變的情況下，隨著培養(yǎng)基中6-BA濃度由 0.1 mg·L-1上升到0.2 mg·L-1，其杜鵑蘭種子的原球莖誘導(dǎo)率也呈現(xiàn)出升高的趨勢，即由63.28%上升提高到70.23%。

表5 不同6-BA和NAA濃度配比對杜鵑蘭種子萌發(fā)產(chǎn)生原球莖的影響

3 結(jié)果與討論

本試驗(yàn)從多個(gè)方面研究了影響杜鵑蘭種子萌發(fā)產(chǎn)生原球莖的因素，成功獲得了誘導(dǎo)杜鵑蘭種子萌發(fā)產(chǎn)生原球莖的最佳培養(yǎng)條件。杜鵑蘭種子具有休眠特性，在種子萌發(fā)過程中，多數(shù)停滯于不吸脹或者吸脹后胚增大卻未能突破種皮階段；杜鵑蘭種子很難突破種皮的原因主要與外種皮的機(jī)械阻力和內(nèi)種皮透氣透水性差有關(guān)[6]；大量研究表明，杜鵑蘭種子種皮厚，不親水和不利于種子吸收養(yǎng)分，是造成其種子休眠的主要原因[7-8]。段金玉等研究發(fā)現(xiàn)，剪破種皮和氫氧化鈉處理可促進(jìn)蘭屬植物種子的萌發(fā)[9]；田梅生等在四季蘭種子萌發(fā)的研究中發(fā)現(xiàn)，將四季蘭種皮剪破后，種子萌發(fā)率高于未剪破種皮的實(shí)驗(yàn)組的3倍左右[10]；由此說明在蘭科植物種子萌發(fā)過程中，適當(dāng)處理其種皮對種子萌發(fā)有至關(guān)重要的作用。

本研究針對性地采用一定濃度的次氯酸鈣試劑處理杜鵑蘭種子，起到了軟化種皮，使得水分能順利滲透入種子細(xì)胞中，確保了細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)代謝進(jìn)行[11-12]，從而很好地實(shí)現(xiàn)種子的快速萌發(fā)。

不同植物激素配比對其細(xì)胞的分裂和分化都起到非常重要的作用。田莉等研究發(fā)現(xiàn)，添加適宜濃度的NAA可以促進(jìn)杜鵑蘭種子形成早期胚軸，發(fā)育速度也可加快[13]。本研究采用一定濃度的6-BA和NAA組合，顯著地促進(jìn)了杜鵑蘭種子萌發(fā)產(chǎn)生原球莖，為進(jìn)一步大規(guī)?？焖偕a(chǎn)杜鵑蘭種苗提供了一條新途徑。