陳 茜,李嘉慈,呂應(yīng)年,吳科鋒,葉 華,李 立,*

(1.廣東醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,廣東湛江 524523;2.韶關(guān)醫(yī)學(xué)院,廣東韶關(guān) 512026;3.廣東醫(yī)科大學(xué)廣東天然藥物研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東湛江 524523;4.廣東醫(yī)科大學(xué)海洋醫(yī)藥研究院,廣東湛江 524523)

多糖是一類(lèi)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的生物大分子,在微生物、植物、動(dòng)物等生物體內(nèi)廣泛分布,并參與眾多重要生命活動(dòng)過(guò)程[1]。海藻是生長(zhǎng)在海洋中的低等隱花植物[2],其多糖是從海藻中提取出的多組分混合物,由多個(gè)相同或不同的單糖基通過(guò)糖苷鍵相連而成的高分子碳水化合物。海藻多糖因其凝膠性、穩(wěn)定性、成膜性等多種特性,以及抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗凝血等多種生物活性,目前已成為化妝品、食品及保健醫(yī)藥等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[3]。龍須菜(Gracilarialemaneiformis),又名海發(fā)菜,系紅藻門(mén)、杉藻目、江蘺科、江蘺屬的一種紅藻,為傳統(tǒng)藥食兩用海藻類(lèi)植物,是繼紫菜、海帶、裙帶菜之后的中國(guó)第四大栽培海藻,其多糖含量高達(dá)30%左右[4]。研究顯示,龍須菜多糖(Gracilarialemaneiformispolysaccharides,GPs)具有抗氧化、抗病毒、修復(fù)受損腎上皮細(xì)胞、降低糖尿病小鼠血糖以及提高線(xiàn)蟲(chóng)壽命等多種生物活性[5-9]。

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是導(dǎo)致記憶損害及認(rèn)知缺陷的毀滅性神經(jīng)退行性疾病。在全世界,AD患者已達(dá)3560萬(wàn)人,預(yù)期到2050年將達(dá)到1億1500萬(wàn)人[10]。AD為最常見(jiàn)的老年人死亡原因,雖然已有眾多治療分子被設(shè)計(jì)用來(lái)克服該疾病所引起的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)及醫(yī)療負(fù)擔(dān),但遺憾的是,人們發(fā)現(xiàn)幾乎所有的化學(xué)物質(zhì)在臨床實(shí)踐中均僅限于姑息治療[11]。AD的病理特征為β-淀粉樣蛋白(Aamyloidβ,Aβ)斑塊及神經(jīng)纖維纏結(jié),而氧化應(yīng)激(Oxidative stress)則參與AD的發(fā)生、發(fā)展全過(guò)程。研究表明,Aβ誘導(dǎo)氧化應(yīng)激,促進(jìn)活性氧(Reactive oxygen species,ROS)生成,進(jìn)而導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白氧化、tau蛋白過(guò)磷酸化,最終對(duì)突觸和神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用;反過(guò)來(lái),氧化應(yīng)激也會(huì)提高Aβ生成。鑒于此,采用抗氧化劑治療AD可能不失為一個(gè)可行策略[12]。已知最著名的抗氧化劑為維生素C及維生素E。一些研究顯示補(bǔ)充抗氧化劑,包括維生素C及E,或富含這些營(yíng)養(yǎng)素的飲食可防止氧化應(yīng)激,從而降低AD風(fēng)險(xiǎn)。研究還表明,攝入維生素C具有神經(jīng)保護(hù)作用,可改善AD患者的認(rèn)知[13]。

研究發(fā)現(xiàn)包括海藻多糖在內(nèi)的一些多糖具有神經(jīng)保護(hù)作用,如羊棲菜多糖可顯著改善AD模型動(dòng)物的認(rèn)知功能[14],褐藻多糖則通過(guò)減少AD線(xiàn)蟲(chóng)的Aβ積聚并降低Aβ誘導(dǎo)的ROS生成,從而緩解AD表型的進(jìn)程[15]。鑒于此,作者檢測(cè)了GPs對(duì)AD模型大鼠的影響,并探討了可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

龍須菜多糖 由本實(shí)驗(yàn)室提供,純度≥95%,通過(guò)醇提法制備[16];半乳糖(D-galactose,D-gal)、氯化鋁(aluminumchloride,AlCl3) 分析純,上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)試盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)測(cè)試盒、微量丙二醛(MDA)測(cè)試盒 南京建成生物工程研究所;SPF級(jí)雌性SD大鼠28只,7周齡,體重(200±20) g,動(dòng)物及飼料 均購(gòu)自廣東醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(粵)2013-0008,廣東醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(粵)2015-0147。

OLYMPUS DP73顯微鏡 日本OLYMPUS公司;ELx800酶標(biāo)儀 美國(guó)BIO-TEK公司;Morris水迷宮系統(tǒng) 淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型建立及給藥 大鼠室溫飼養(yǎng),自由進(jìn)食及飲水,自然晝夜節(jié)律光照。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后,根據(jù)先前文獻(xiàn)報(bào)道方法,注射D-gal及AlCl3建立AD大鼠模型[17]。大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(n=7)及AD組(n=21)。對(duì)照組每日腹腔注射生理鹽水(0.2 mL/只),AD組每日腹腔注射D-gal(60 mg/kg)及AlCl3(10 mg/kg)。AD組進(jìn)一步分為3組(n=7),即AD模型組、GPs低劑量組、GPs高劑量組。對(duì)照組及模型組每日以生理鹽水灌胃,GPs低劑量組及高劑量組則每日以GPs灌胃(300及600 mg/kg)。給藥與造模同步,均持續(xù)42 d,具體流程及后續(xù)實(shí)驗(yàn)如圖1所示。

圖1 處理及行為測(cè)試時(shí)線(xiàn)

1.2.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) Morris水迷宮(Morris water maze,MWM)實(shí)驗(yàn)方法參考先前文獻(xiàn)[18]報(bào)道。MWM實(shí)驗(yàn)裝置為一圓形水箱(直徑120 cm、高80 cm)。水箱內(nèi)裝有溫水(23±1 ℃),深40 cm,并以白色無(wú)毒染料使其不透明。水箱被分為四個(gè)象限(NE、SE、SW和NW),一個(gè)不可見(jiàn)的平臺(tái)(直徑12 cm)固定在SW-III象限(目標(biāo)象限),并淹沒(méi)在水面下2 cm處。以懸于游池上方的攝像機(jī)記錄動(dòng)物行為,并采用視頻計(jì)算跟蹤系統(tǒng)(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)研究所)進(jìn)行分析。在給藥第44 d,訓(xùn)練大鼠在各種環(huán)境的提示下尋找并爬上水下平臺(tái)。在獲得性訓(xùn)練(acquisition trial)階段(給藥第45～48 d),大鼠每日接受4次測(cè)試,四個(gè)起始位置(NE-Ⅰ、NW-Ⅱ、SW-Ⅲ、SE-Ⅳ)各使用一次,而平臺(tái)始終位于同一象限(SW-Ⅲ)。大鼠頭朝池壁放入水中,并給予60 s尋找隱藏平臺(tái),到達(dá)平臺(tái)的時(shí)間被記錄為逃避潛伏期(escape latency)。如果超過(guò)60 s仍找不到平臺(tái),則引導(dǎo)大鼠到平臺(tái)之上,并停留10 s。在給藥第49 d進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)(spatial exploration test),移除平臺(tái),將大鼠置于非平臺(tái)所在象限,并記錄其60 s內(nèi)穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)。

1.2.3 標(biāo)本采集 MWM實(shí)驗(yàn)結(jié)束24 h后,采用戊巴比妥(30 mg/kg)麻醉大鼠。取出除小腦外的全腦,生理鹽水沖洗。取大鼠左半球腦組織以10%福爾馬林浸泡固定、石蠟包埋,用于病理學(xué)檢查;取大鼠大腦右半球的海馬組織,-80 ℃保存,用于氧化應(yīng)激標(biāo)志物檢測(cè)。

1.2.4 蘇木精伊紅染色 石蠟包埋標(biāo)本4 μm厚連續(xù)切片,脫蠟,再以蘇木精伊紅(H&E)染色。

1.2.5 大腦海馬組織氧化應(yīng)激分析 采用市售商品化試劑盒,并按照試劑盒所附說(shuō)明書(shū)測(cè)定大鼠海馬組織SOD、GSH-Px活性及MDA水平。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 GPs干預(yù)對(duì)大鼠MWM實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

在正常濃度下,D-gal被代謝為半乳糖-1-磷酸;在高濃度下,D-gal則被轉(zhuǎn)化為半乳糖醇,半乳糖醇在細(xì)胞中積累,然后破壞滲透應(yīng)激平衡并產(chǎn)生ROS[19]。在動(dòng)物模型中長(zhǎng)期注射D-gal可致氧化應(yīng)激、神經(jīng)元損傷以及認(rèn)知能力衰退[20]。另一方面,在正常生理?xiàng)l件下,鋁(Al)可在大腦不同區(qū)域的神經(jīng)元中積聚,引起神經(jīng)元凋亡性丟失,長(zhǎng)期暴露于Al可引起氧化應(yīng)激以及海馬損傷[21]。過(guò)量暴露于Al還會(huì)導(dǎo)致β-淀粉樣前體蛋白(APP)過(guò)表達(dá)以及β-淀粉樣斑塊在腦細(xì)胞上沉積,這就使Al成為了一種可行的阿爾茨海默誘導(dǎo)物[22]。因此,在嚙齒類(lèi)動(dòng)物中聯(lián)用D-gal及AlCl3是獲得AD模型的有效、廉價(jià)方法,用于研究AD機(jī)制及藥物篩選[23-24]。MWM是測(cè)試海馬功能的有力工具,目前仍被用于評(píng)估學(xué)習(xí)及記憶能力[25],該實(shí)驗(yàn)包括兩個(gè)程序,即獲得性訓(xùn)練及空間探索實(shí)驗(yàn),分別用于測(cè)量動(dòng)物的學(xué)習(xí)能力及記憶鞏固能力[17]。

在獲得性訓(xùn)練階段,與對(duì)照組相比,AD模型組在4 d的訓(xùn)練中逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)(P<0.05),表明AD模型大鼠學(xué)習(xí)能力嚴(yán)重受損,提示AD造模成功。與AD模型組相比,從獲得性訓(xùn)練第2 d起,無(wú)論是GPs低劑量組還是高劑量組,GPs干預(yù)均顯著地縮短了AD大鼠的逃避潛伏期(低劑量組:相應(yīng)地,P<0.05、0.05、0.01;高劑量組:相應(yīng)地,P<0.01、0.01、0.01),提示口服GPs可緩解由于D-gal及AlCl3處理所導(dǎo)致的大鼠學(xué)習(xí)障礙(圖2)。

圖2 訓(xùn)練日的平均逃避潛伏期(n=7)

空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述獲得性訓(xùn)練結(jié)果類(lèi)似,AD模型組大鼠穿越原平臺(tái)所在位置的次數(shù)極顯著地(P<0.001)低于對(duì)照組,而GPs干預(yù)則極顯著地提高了AD大鼠穿越原平臺(tái)所在位置的次數(shù)(低劑量組:P<0.01;高劑量組:P<0.01)(圖3、圖4),提示口服GPs提高了AD大鼠對(duì)平臺(tái)空間位置記憶的保持能力。

圖3 空間探索試驗(yàn)中具有代表性的個(gè)體大鼠游泳軌跡

圖4 穿越平臺(tái)位置次數(shù)(n=7)

2.2 GPs對(duì)D-gal及AlCl3誘導(dǎo)的大鼠海馬形態(tài)改變的影響

與對(duì)照組相比,AD模型組大鼠海馬CA1區(qū)錐形細(xì)胞排列松散、紊亂。GPs的干預(yù)則改善了上述AD大鼠CA1區(qū)錐形細(xì)胞的無(wú)規(guī)則排列狀態(tài)(圖5)。研究顯示,與正常人相比,AD患者大腦海馬CA1區(qū)常出現(xiàn)萎縮,提示CA1區(qū)形態(tài)學(xué)改變與AD發(fā)病關(guān)系密切[26-28]。在本研究中,雖然不能確定AD模型大鼠海馬CA1區(qū)是否發(fā)生萎縮,但可以確定D-gal及AlCl3聯(lián)用可使大鼠海馬CA1區(qū)錐形細(xì)胞排列方式發(fā)生改變,而GPs灌胃則可有效地逆轉(zhuǎn)上述該種改變。在本研究中,HE染色檢測(cè)只是定性,不能定量,即不能確定不同劑量的GPs維持海馬正常形態(tài)的能力是否不同。與本研究類(lèi)似,單獨(dú)HE檢測(cè)雖然可以發(fā)現(xiàn)不同劑量的草藥KXS均可提高AD大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的存活并維持這些細(xì)胞的有序排列,但同樣沒(méi)有給出明確的劑效關(guān)系[29]。

圖5 大鼠海馬CA1區(qū)組織病理學(xué)分析(H&E,×200)

2.3 GPs對(duì)D-gal及AlCl3誘導(dǎo)的大鼠海馬氧化應(yīng)激的影響

與對(duì)照相比,AD模型組大鼠海馬SOD及GSH-PX活性均極顯著地下降(相應(yīng)地,P<0.001、0.001)(圖6、圖7)。與AD模型組相比,GPs干預(yù)組SOD及GSH-PX活性則極顯著地提高(低劑量組:相應(yīng)地,P<0.01、0.001;高劑量組:相應(yīng)地,P<0.01、0.001)。另一方面,與對(duì)照相比,AD模型組大鼠海馬MDA水平極顯著地提高(P<0.001),而GPs灌胃則極顯著地阻止了D-gal及AlCl3誘導(dǎo)的MDA水平升高(P<0.001)(圖8)。

圖6 GPs對(duì)大鼠海馬SOD活性的影響

圖7 GPs對(duì)大鼠海馬GSH-Px活性的影響

圖8 GPs對(duì)大鼠海馬MDA水平的影響

前期研究顯示,GPs降解的單糖主要為半乳糖(38%)、葡萄糖(15%)、氨基葡萄糖(15%)、甘露糖(9.2%)以及少量巖藻糖等還原性糖,而GPs的抗氧化應(yīng)激活性應(yīng)與其含有這些大量還原性糖有關(guān)。還原性糖主要結(jié)構(gòu)為具有還原性的多羥基以及醛基,在生化反應(yīng)中羥基及醛基能被氧化成羧基。

目前AD病因尚未完全明了,但最近的假說(shuō)認(rèn)為,氧化損傷是AD早期事件,正是氧化損傷啟動(dòng)了AD的其他病理過(guò)程[30]。通過(guò)阻止氧化損傷,抗氧化劑(SOD及GSH-Px)在抗氧化防御系統(tǒng)中發(fā)揮了重要作用,而丙二醛(MDA)作為脂質(zhì)過(guò)氧化的終極產(chǎn)物之一,則成為自由基介導(dǎo)損傷的一個(gè)標(biāo)志物,間接地反映了氧化損傷程度[31]。研究顯示,香菇多糖對(duì)AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力具有一定改善作用,其機(jī)制可能與增強(qiáng)大鼠大腦抗氧化能力有關(guān)[32];而土黨參多糖改善腦損傷小鼠學(xué)習(xí)記憶,也同樣伴隨著腦中GSH、SOD活性的提高,以及腦中MDA水平的下降[33]。因此,本研究檢測(cè)了大鼠海馬SOD、GSH-Px活性及MDA水平。研究結(jié)果顯示,AD模型大鼠SOD、GSH-Px活性較正常大鼠明顯降低,而MDA水平則顯著提高,該結(jié)果與另一種常用的AD動(dòng)物模型建立方法即大腦注射Aβ1-40的方法相類(lèi)似[34-35]。本研究結(jié)果還表明,GPs灌胃可顯著地緩解AD大鼠海馬的氧化應(yīng)激狀態(tài)。鑒于氧化應(yīng)激與AD的關(guān)系,上述氧化應(yīng)激狀態(tài)的緩解可能與AD大鼠其他癥狀的改善存在著一定程度的因果關(guān)系。

3 結(jié)論

本研究采用腹腔注射D-gal及AlCl3誘導(dǎo)SD大鼠建立AD模型,檢測(cè)GPs對(duì)大鼠認(rèn)知功能的保護(hù)作用并探討其可能機(jī)制。結(jié)果顯示,GPs可明顯改善D-gal及AlCl3誘導(dǎo)的大鼠認(rèn)知功能障礙及海馬CA1區(qū)病理改變,而該作用可能與GPs提高抗氧化酶活性、緩解氧化應(yīng)激狀態(tài)有關(guān),其具體機(jī)制仍有待從相關(guān)信號(hào)通路的角度深入研究。