張 琨 ，殷麗麗 ，韓志平 ，張 巽 ，王一衡

（1.山西大同大學 生命科學學院/設施農業(yè)技術研發(fā)中心，山西 大同 037009；2.天津市農業(yè)科學院 生物技術研究所，天津300384）

黃花菜（Hemerocallis citrine Baroni）又名金針菜、黃花萱草等，為百合科萱草屬多年生宿根草本植物。黃花菜在我國有著非常悠久的栽培歷史，是我國的一種特色蔬菜[1]?；ɡ偈屈S花菜可供食用部位，味美鮮甜，富含蛋白質、維生素、礦物質、皂苷、黃酮和生物堿等多種營養(yǎng)及藥用成分，具有清熱解毒、抗腫抑癌、延緩衰老等保健功效，被譽為我國的“四大素山珍”之一[2-4]。黃花菜原產于亞洲及歐洲，具有耐旱、耐鹽、適應性強的特點，在我國各地廣泛栽培，主要的黃花菜產區(qū)分布于湖南、陜西、甘肅、山西、四川等地。中國是黃花菜的原產地之一，也是黃花菜種質資源最豐富的國家[5]。目前，我國黃花菜栽培品種約50 個，另外還有野生種黃花菜10 余種[6]。但各黃花菜品種之間形態(tài)差別不大[7]，加之長期進行無性繁殖，缺乏新的優(yōu)良基因的融合，使品種間的遺傳差異不斷縮小，品種退化問題突出。因此，加快選育黃花菜新品種就顯得尤為迫切和重要。

雜交育種仍是黃花菜最主要的育種手段，雖然操作簡單，但現(xiàn)代黃花菜品種大多通過遠緣雜交獲得，等位基因雜合，遺傳背景復雜。因而僅采用常規(guī)雜交育種手段選育黃花菜新品種，不僅無法準確掌握控制某些重要性狀的基因型，同時也缺乏對育種目標性狀遺傳的有效預測，使得優(yōu)良遺傳基因無法實現(xiàn)高效、定向的優(yōu)化聚合[8]。單倍體培養(yǎng)技術是現(xiàn)代育種中重要的方法和手段，利用游離小孢子培養(yǎng)誘導單倍體，經染色體加倍可形成基因型純合的雙單倍體（doubled haploid，DH）植株。由此僅需1～2a 便可將材料純化，大幅度簡化了雜交親本的純合過程，縮短了育種年限。另外，由于DH 系不存在顯性基因掩蓋隱性基因的現(xiàn)象，使得不易出現(xiàn)的隱性性狀的表達成為了可能，從而豐富了雜交親本的選擇范圍，提高了目標基因型的選擇效率[9]。選擇適宜發(fā)育時期的小孢子對成功構建游離小孢子培養(yǎng)體系至關重要。就多數(shù)植物而言，小孢子培養(yǎng)的最佳時期是單核靠邊期，此時的胚胎誘導率最高[10-13]。通過對多種不同植物的研究發(fā)現(xiàn)，小孢子發(fā)育時期與花器官形態(tài)特征密切相關，可依據(jù)花蕾大小、花藥長度等指標鑒別小孢子的發(fā)育時期[14-18]，但目前有關黃花菜花器官形態(tài)與小孢子發(fā)育時期關系的系統(tǒng)研究還未見報道。為此，本研究擬通過對黃花菜小孢子各發(fā)育時期的細胞學特征和花器形態(tài)觀察，探討小孢子發(fā)育時期與花器外部形態(tài)的相關性，以期從花器形態(tài)判斷小孢子發(fā)育時期，為開展黃花菜游離小孢子培養(yǎng)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試3 個黃花菜（Hemerocallis citrine Baroni）品種分別為山西大同花、陜西大荔花和湖南猛子花，于2015年引種栽培于山西大同大學生命科學學院實驗基地。每品種栽植50 株，栽植行距為100cm，株距為50cm，正常田間管理。

1.2 方法

1.2.1 花蕾及花藥形態(tài)觀測 2019 年8 月于植株盛花期開始采樣。于晴天08∶00～10∶00，從生長良好、長勢一致的黃花菜供試植株上采摘不同長度的新鮮花蕾，將不同品種、不同大小的花蕾分裝于自封袋，做好標記后放置在冰盒里并及時帶回實驗室。利用數(shù)顯游標卡尺測量黃花菜花蕾的橫徑和縱徑，觀察并記錄花蕾的外部形態(tài)特征；之后用鑷子剝去花瓣，取出花藥切除花絲后，分別對花藥的長度和寬度進行測量，并記錄花藥顏色。各供試品種每個發(fā)育時期分別選取10 個花蕾進行觀察、測量，每個處理3 次重復。

1.2.2 小孢子發(fā)育的細胞學觀察 將經過形態(tài)觀測后的花蕾用卡諾固定液（V 無水乙醇∶V 冰醋酸=3∶1）在室溫下處理24h，取出花蕾用蒸餾水沖洗2～3 次后，轉入70%乙醇中，于4℃冰箱保存以待鏡檢。制片時，用鑷子從花蕾中取出花藥，并置于載玻片上。輕輕擠壓花藥使花粉母細胞散出并均勻鋪開，去除雜質，用醋酸洋紅染液進行染色，蓋上蓋玻片，制成臨時壓片。在Motic BA310 數(shù)碼顯微鏡下觀察小孢子不同發(fā)育時期的細胞學形態(tài)特征，并對其進行拍照記錄。每個發(fā)育時期選取10 個花蕾進行觀察，重復3 次；每個壓片選10 個視野觀察，并以視野中出現(xiàn)次數(shù)最多的某一發(fā)育時期作為該花蕾小孢子所處的發(fā)育時期。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

試驗所得數(shù)據(jù)結果采用SPSS 24.0 統(tǒng)計分析軟件進行處理，采用Duncan 法進行數(shù)據(jù)的差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 黃花菜小孢子各發(fā)育階段的細胞學特征

2.1.1 四分體時期 黃花菜花粉母細胞經減數(shù)分裂后，形成由胼胝質包裹的四分小孢子。胼胝質壁因不易被染色而呈透明狀，易于分辨（圖1a）。此時每個小孢子的體積較小，在胼胝質內呈立體排列，因此也可見只有3 個小孢子排列的情況。

2.1.2 單核早中期 在酶的催化作用下，包圍四分小孢子的胼胝質壁逐漸水解，小孢子從中游離出來，形成獨立的單個小孢子。此時小孢子的體積逐漸增大，細胞外形輪廓逐漸變圓。小孢子內細胞核體積較大，且大多居于細胞中央位置（圖1b）。

2.1.3 單核靠邊期 細胞體積繼續(xù)增大，液泡逐漸形成并發(fā)育為中央大液泡。此發(fā)育時期最明顯的特征是細胞核被液泡從細胞中央位置擠壓到靠近細胞壁的一側，在細胞壁上還可以觀察到較為明顯的萌發(fā)溝（圖1c）。

2.1.4 雙核期 小孢子繼續(xù)發(fā)育經歷1 次有絲分裂，形成1 個營養(yǎng)核和1 個生殖核?？拷号莸氖菭I養(yǎng)核，貼近細胞壁的是生殖核。此時細胞形狀由圓形逐漸向成熟花粉粒的橢球形過渡（圖1d）。隨著花粉細胞的不斷發(fā)育，花粉粒膨大，花粉壁增厚，萌發(fā)溝外凸，最終發(fā)育形成成熟花粉粒。

圖1 黃花菜小孢子各發(fā)育時期的細胞學特征（×400）Figure 1 Cytological characteristics of microspore at different development periods in daylily (×400)

2.2 黃花菜小孢子發(fā)育時期與花蕾形態(tài)特征的相關性

通過對供試3 個品種黃花菜小孢子各發(fā)育時期的花蕾形態(tài)觀測發(fā)現(xiàn)，小孢子發(fā)育時期與花蕾形態(tài)特征存在較強的相關性。黃花菜花蕾縱徑和橫徑在小孢子由四分體時期發(fā)育至雙核期的過程中增長趨勢明顯（表1）。同一品種黃花菜，在其小孢子發(fā)育的4 個時期里，花蕾的縱徑、橫徑大都存在顯著甚至極顯著差異；處于同一小孢子發(fā)育時期的不同黃花菜品種的花蕾形態(tài)指標也存在差異。如表1 所示，黃花菜小孢子處于四分體時期，花蕾縱徑在8.84～9.21mm，橫徑在4.02～4.19mm；單核早中期的小孢子花蕾縱徑在9.48～9.86mm，橫徑在4.30～4.48mm；發(fā)育至單核靠邊期時，花蕾縱徑在10.03～10.45mm，橫徑在4.54～4.69mm；雙核期的小孢子花蕾縱徑達到了 10.72～10.88mm，橫徑在 4.72～4.77mm。除花蕾大小外，同一品種黃花菜小孢子各發(fā)育時期在花蕾外觀特征上也稍有差異，但品種間差異并不明顯（表2）。隨著小孢子的不斷發(fā)育，黃花菜花蕾體積逐漸增大，到單核靠邊期時花蕾膨大較為明顯；花蕾顏色由綠色逐漸變?yōu)辄S綠色，小孢子發(fā)育初期其花蕾頂端顏色呈現(xiàn)出較大區(qū)域的黑紫色或深紫色，單核靠邊期時頂端顏色變淺，至雙核期時花蕾頂端只有很小一圈呈紫色。

2.3 黃花菜小孢子發(fā)育時期與花藥形態(tài)特征的相關性

研究結果表明，黃花菜小孢子發(fā)育時期與花藥形態(tài)特征密切相關。黃花菜花藥長度、寬度在小孢子發(fā)育的4 個時期里呈逐漸增長趨勢（表3）。同一品種不同小孢子發(fā)育時期的黃花菜，其花藥的長度、寬度差異極顯著；處于同一小孢子發(fā)育時期的不同黃花菜品種的花藥形態(tài)指標也存在差異。黃花菜小孢子發(fā)育處于四分體時期，其花藥長度在 4.36～4.51mm，寬度在 1.52～1.69mm；單核早中期，花藥長度在 4.84～5.14mm，寬度在 1.78～1.97mm；單核靠邊期，花藥長度在 5.30～5.62mm，寬度在 1.96～2.19mm；雙核期，花藥長度在 5.79～6.06mm，寬度在2.27～2.56mm。在黃花菜小孢子由四分體時期發(fā)育至雙核期的過程中，其花藥顏色也在逐漸發(fā)生變化。隨著花藥體積的增大，花藥顏色由淺變深，經歷白色-白綠色-綠色-淺黃色的變化（表2）。不同品種黃花菜其花藥發(fā)育時的顏色變化差異不大。

圖2 黃花菜小孢子各發(fā)育時期花蕾形態(tài)和大小Figure 2 Morphology and size of buds at different microspore development periods in daylily

表1 黃花菜3 個品種小孢子各發(fā)育時期對應的花蕾大小Table 1 Size of buds at different microspore development periods in daylily

表2 黃花菜小孢子各發(fā)育時期花蕾和花藥外觀特征Table 2 External morphology characteristics of buds and anthers at different microspore development periods in daylily

表3 黃花菜3 個品種小孢子各發(fā)育時期對應的花藥大小Table 3 Size of anthers at different microspore development periods in daylily

3 討論與結論

準確鑒定小孢子發(fā)育時期是小孢子培養(yǎng)的必要基礎。通過對小孢子進行染色制片，就可以利用顯微鏡觀察其不同發(fā)育時期的細胞學特征。根據(jù)以往研究，常用于確定小孢子發(fā)育時期的染色方法有醋酸洋紅染色法[17,19-20]、4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）熒光染液染色法[16,18]和卡寶品紅染色法[21]等。本研究選取醋酸洋紅染色法對黃花菜小孢子發(fā)育時期的細胞學特征進行了觀察，發(fā)現(xiàn)黃花菜小孢子沿雄配子發(fā)育途徑經歷了4 個發(fā)育時期，分別是四分體時期、單核早中期、單核靠邊期和雙核期，各時期細胞核的數(shù)量、位置等細胞學特征明顯。因此，醋酸洋紅染色法可作為一種安全可靠、經濟便捷的方法用于黃花菜小孢子發(fā)育時期的確定。

通過對大量不同植物小孢子發(fā)育時期與花器官形態(tài)相關性的研究，發(fā)現(xiàn)小孢子發(fā)育進程與花器官性狀密切相關[14-22]。通常，不同小孢子發(fā)育時期在花蕾大小、花藥發(fā)育等方面差異顯著，由此可作為判斷小孢子發(fā)育階段的外在形態(tài)依據(jù)[23]。在黃花菜小孢子發(fā)育的各個時期里，隨著小孢子的不斷發(fā)育，黃花菜花蕾外形逐漸膨大，花蕾縱徑和花藥長度均存在極顯著差異，花藥顏色由淺變深，經歷白色-白綠色-綠色-淺黃色的變化，可見黃花菜小孢子發(fā)育時期與花器官形態(tài)存在一定的相關性。這些形態(tài)指標在小孢子不同發(fā)育時期里差異明顯，且沒有尺度上的重疊，因此可作為黃花菜取材時期的參考依據(jù)。在大荔花和猛子花2 個供試品種中，不同小孢子發(fā)育時期的花蕾橫徑均達到了極顯著差異，而大同花單核靠邊期和雙核期的花蕾橫徑差異并不顯著；各時期花蕾顏色總體上差別不大，僅依靠花蕾頂端顏色變化判斷小孢子發(fā)育時期還稍顯不足；大同花單核早中期的花藥寬度為1.97mm，與猛子花單核靠邊期1.96mm 的花藥寬度相近，在尺寸大小上存在一定的重疊。因而，在花蕾橫徑、顏色和花藥寬度上很難找到統(tǒng)一標準用于選取適宜發(fā)育時期的花蕾。

小孢子所處發(fā)育階段是影響小孢子培養(yǎng)能否誘導出胚的關鍵。只有在特定發(fā)育階段的小孢子才能感受外界刺激進而誘導其由配子體發(fā)育轉向孢子體發(fā)育[9]。前人研究發(fā)現(xiàn)，小孢子所處發(fā)育期過早，對啟動雄核發(fā)育所需要的環(huán)境條件更為嚴苛，因而很難誘導成胚[10]；取材過晚，小孢子又會因太過成熟而喪失脫分化能力，培養(yǎng)同樣不能取得成功[24]。對多數(shù)植物而言，小孢子的最佳誘導時期為單核晚（靠邊）期。孫丹等[25]報道處于單核晚期的大白菜小孢子出胚量最高。詹艷等[10]發(fā)現(xiàn)黃瓜小孢子培養(yǎng)的最佳時期是單核靠邊期。相同的研究結論，還在甘藍[15]、辣椒[26]、青花菜[27]等不同種類作物上獲得了證實。目前，國內外尚未見黃花菜游離小孢子培養(yǎng)成功的報道，對于單核靠邊期是否是黃花菜小孢子培養(yǎng)的最佳時期還有待驗證。本研究通過對3 個不同品種黃花菜處于小孢子不同發(fā)育時期的花器官特征進行觀察比較，得出單核靠邊期時，花蕾縱徑10.03～10.45mm，花藥長度5.30～5.62mm，花藥顏色為綠色。若黃花菜小孢子培養(yǎng)誘導胚狀體的最佳時期以單核靠邊期為宜，就可以參考上述標準進行取蕾，以此免去制片鏡檢等繁瑣工作，實現(xiàn)田間準確取材，提高小孢子培養(yǎng)效率，從而為構建黃花菜游離小孢子培養(yǎng)體系奠定基礎。