王春輝，孟繁凱，費(fèi)邵陽，陳 莫，鄭林杰

(吉林省人民醫(yī)院 神經(jīng)外科，吉林 長春130021)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤(glioma)是腦神經(jīng)系統(tǒng)最為常見的惡性腫瘤，預(yù)后極差，復(fù)發(fā)率高、死亡率高[1]。尋找有效的膠質(zhì)瘤診斷和治療分子靶點(diǎn)，提升治療效率一直是研究者關(guān)注的熱點(diǎn)，長鏈非編碼RNA( lncRNA)是人類轉(zhuǎn)錄組中一類重要的調(diào)控分子，近年來的研究表明lncRNA的異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，然而與神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)的lncRNA報(bào)道仍然較為有限。結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)移因子-1(CCAT1),具有2628對堿基，位于染色體8q24.21上，2012年，首次被發(fā)現(xiàn)在大腸癌中特異性高表達(dá)[2]，隨后的研究表明，其在肝癌、胃癌等消化道腫瘤中表達(dá)明顯升高，并與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲有著密切關(guān)聯(lián)[3,4]，近年來的研究證明CCAT1在腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤中也存在異常表達(dá)，而相關(guān)機(jī)制仍然有待闡明。因此本研究以神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251為研究對象，通過下調(diào)lncRNA-CCAT1的表達(dá)，以探討其在膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲能力的作用，并分析其對MAPK信號通路相關(guān)分子的影響，以其為CCAT1應(yīng)用于膠質(zhì)瘤診斷和治療提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞U251(源于多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞WHO IV級)購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。RPMI1640培養(yǎng)液購于美國Invitrogen公司，胎牛血清購自美國Gibco公司，胰蛋白酶、青霉素/鏈霉素購自美國Sigma公司；BCA蛋白濃度定量試劑盒、ECL顯色試劑盒、相關(guān)抗體(磷酸化的ERK1/2單抗、ERK1/2單抗、p38單抗、磷酸化的p38單抗、JNK單抗、磷酸化的JNK單抗、HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗)及MTT試劑盒均購自上海碧云天生物科技有限公司；Trizol購于美國Invitrogen公司；Lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購于美國Invitrogen公司；SYBRGreen qPCR檢測試劑盒購于日本Takara公司； CCAT1 shRNA(5’-CACCAGCCGGATTAAAT CGTTAGGCCGACCTAC-

TTAAGGCCTTCTTCG-3’)；陰性對照sh-NC(5’-AGGTCCCTACGTTTAACCCCCTATTGGACTA-

CGGAATTTTTCG-3’)均訂購自上海生工公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

細(xì)胞用1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、傳代。轉(zhuǎn)染前24 h，接種在六孔板中，每孔(0.5-2)×105個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞融合度為60%-80%。轉(zhuǎn)染過程參照lipofectamine 2000說明書進(jìn)行。將細(xì)胞分為sh-CCAT1組、sh-NC組、空白組。轉(zhuǎn)染后置于37℃培養(yǎng)6小時(shí)后，繼續(xù)更換為10%血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，進(jìn)行下一步的檢測。

1.3 qRT-PCR方法驗(yàn)證敲低U251細(xì)胞lncRNA-CCAT1效率

轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞總mRNA用Trizol法提取，mRNA的純度用Nanodrop測定，將提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，參照qRT-PCR試劑盒說明配置反應(yīng)體系及條件，以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算各組lncRNA-CCAT1的mRNA相對表達(dá)量。重復(fù)3次。lnc-CCAT1檢測引物5’-GCATCCTTAGTACTCACTG-3’,5’-GGCCATCTCCTGCTGTTAG-3’。

1.4 MMT法檢測細(xì)胞增殖變化

將不同組的U251細(xì)胞分別接種到96孔板，接種濃度為4×103個(gè)/孔，轉(zhuǎn)染24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)后，分別取6個(gè)復(fù)孔細(xì)胞加入MTT試劑20 μl，37℃培養(yǎng)4 h后，加入DMSO 100 μl，振蕩反應(yīng)10 min后，利用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處的吸光度值(A值)。

1.5 細(xì)胞劃痕試驗(yàn)

將三組細(xì)胞消化接種到新的6孔板，次日細(xì)胞長滿后，采用10 μl 移液器槍頭在6 孔板底部進(jìn)行劃痕，采用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，去除脫落細(xì)胞，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，采用倒置顯微鏡觀察劃痕愈合情況并拍照。劃痕愈合率=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.6 Western blot 試驗(yàn)

收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組U251細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，每個(gè)樣品取40 μg上樣，SDS-PAGE電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，室溫封閉1小時(shí)，分別加入相應(yīng)的蛋白抗體4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入二抗(1∶5 000)，室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，加入ECL發(fā)光液顯色，利用Image J分析各條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算各組條帶的蛋白相對表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05有顯著性差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Sh-CCAT1對U251細(xì)胞lncRNA-CCAT1干擾效率的驗(yàn)證

在腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251中，轉(zhuǎn)染sh-CCAT1后，qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，sh-CCAT1組lnc- CCAT1的表達(dá)(0.31±0.04)顯著低于sh-NC組(1.03±0.03)和空白組(1.00±0.11)(均P<0.05),sh-NC組與空白組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果表明轉(zhuǎn)染sh-CCAT1可以有效地抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251中l(wèi)ncRNA-CCAT1的表達(dá)。

2.2 sh-CCAT1對于U251細(xì)胞增殖能力的影響

MMT法檢測各組細(xì)胞活力顯示，空白組和sh-NC組在轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞24-96 h間的細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而sh-CCAT1轉(zhuǎn)染組，從48 h起細(xì)胞活力顯著低于空白組，見表1。說明下調(diào)lnc RNA-CCAT1可以顯著地抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，提示lnc RNA-CCAT1有潛力成為抑制膠質(zhì)瘤的新分子靶點(diǎn)。

表1 MMT法檢測sh-CCAT1對于U251細(xì)胞增殖能力的影響

2.3 抑制lncRNA-CCAT1對于U251細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響

利用細(xì)胞劃痕試驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染后各組膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力，結(jié)果如圖1，劃痕試驗(yàn)中，24 h后，sh-CCAT1組的劃痕愈合率(31.1±6.3)%明顯低于sh-NC(59.78±3.72)%組和空白組(61.1±2.72)%(P<0.05)，而sh-nc組與空白組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果表明抑制lncRNA-CCAT1的表達(dá)可以降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的侵襲和遷移能力。

2.4 抑制lnc RNA-CCAT1對于MAPK信號通路相關(guān)蛋白的影響

Western blost檢測MAPK信號通路相關(guān)的關(guān)鍵蛋白，結(jié)果如圖2所示，下調(diào)lncRNA-CCAT1之后，而ERK、P38、JNK的表達(dá)沒有明顯改變，而p-ERK、p-P38、p-JNK則受到顯著抑制，說明lncRNA-CCAT1 抑制了這些關(guān)鍵蛋白的磷酸化，這提示lncRNA-CCAT1可能通過抑制MAPK信號通路的活化，抑制膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的增殖和侵襲、遷移。

圖1 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測三組U251細(xì)胞的侵襲和遷移能力

3 討論

越來越多的研究表明，長鏈非編碼RNA是長度大于200nt的非編碼RNA，其在表觀遺傳調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控等諸多生命活動(dòng)中均扮演了重要的角色，幾乎參與了生物體所有生理和病理過程，越來越多的臨床和實(shí)驗(yàn)證據(jù)均表明，lncRNA異常表達(dá)與人類多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，有潛力成為腫瘤診斷和治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)。其中l(wèi)nc RNA-CCAT1，最早在結(jié)腸癌中被發(fā)現(xiàn)特異性高表達(dá)，位于人類染色體8q24上，與多種疾病的易感性有關(guān)，進(jìn)一步的研究表明CCAT1與多種腫瘤有關(guān)。在膽管癌中，CCAT1的高表達(dá)通常意味著較差的預(yù)后；在急性髓細(xì)胞白血病中，CCAT1正調(diào)控miR-490-3p,參與了MAPK信號通路的激活[5]；在胃癌細(xì)胞中，CCAT1可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，同時(shí)被miR-219-1所拮抗[6]；在膠質(zhì)瘤組織中也發(fā)現(xiàn)了CCAT1的高表達(dá)，并有研究表明CCAT1與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡相關(guān)[7]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251中，CCAT1可以有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲，為探討其中的分子機(jī)制，我們選擇檢測三組細(xì)胞中MAPK信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。

圖2 Westen blot分析檢測lnc RNA-CCAT1下調(diào)對于MAPK信號通路相關(guān)蛋白的影響

絲裂原活化蛋白激酶是細(xì)胞感受外界信號的重要中介酶體，是由一組可以被多種細(xì)胞外界刺激(細(xì)胞因子、激素等)所激活的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶。MAPK信號通路是一種高度保守的三級激酶模式，包括MAPK激酶激酶(MKKK)、MAPK激酶(MKK)和MAPK，三種激酶通過逐級磷酸化依次激活將信號向下傳遞，參與細(xì)胞多種生理和病理過程。MAPK級聯(lián)通路涉及了多種關(guān)鍵信號因子，ERK廣泛參與細(xì)胞的增殖分化的調(diào)控[8]；JNK家族涉及細(xì)胞各種應(yīng)激原誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與細(xì)胞對溫度、壓力、輻射等應(yīng)激反應(yīng)[9]；p38則是介導(dǎo)炎癥、凋亡的關(guān)鍵因子[10,11]。我們的結(jié)果表明，在lncRNA-CCAT1被抑制后，MAPK通路中的關(guān)鍵因子，自身表達(dá)量未發(fā)生明顯變化，而其磷酸化被顯著抑制，這提示lnc-CCAT1很可能參與了MAPK通路的激活。

綜上所述，lnc RNA-CCAT1可以顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的增殖和遷移，CCAT1可能是通過影響MAPK信號通路的激活，參與腫瘤細(xì)胞的增殖。本研究的成果將有助于理解CCAT1參與腫瘤生物行為的分子機(jī)制，為尋找腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤的診療新靶點(diǎn)提供幫助。