萬(wàn)瑾舒 顧 蓓 劉玉琴 南鳳尾 張孟仁

神經(jīng)炎性反應(yīng)是糖尿病認(rèn)知功能下降的重要機(jī)制，減輕或有效抑制炎性反應(yīng)可能是防治糖尿病認(rèn)知功能障礙的重要途徑[1～3]。有研究表明，高糖狀態(tài)下，體內(nèi)炎性因子水平的升高可能與小膠質(zhì)細(xì)胞中非酶糖基化產(chǎn)生過(guò)多的晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)，從而引發(fā)晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE) 相關(guān)的胞內(nèi)炎性信號(hào)通路有關(guān)[4，5]。AGEs可以與細(xì)胞表面 RAGE 結(jié)合，激活胞內(nèi)炎癥信號(hào)通路并產(chǎn)生活性氧，同時(shí)，核轉(zhuǎn)錄因子 κB (nuclear factor-kappaB，NF-κB)磷酸化后入核，啟動(dòng)下游基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而誘發(fā)炎癥，導(dǎo)致炎性因子腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-6 (interleukin-6，IL-6) 的釋放，從而對(duì)神經(jīng)細(xì)胞造成損傷[6,7]。

黃連(Rhizoma Coptis)，屬毛茛科、黃連屬多年生草本植物， 是筆者課題組自擬中藥復(fù)方腦復(fù)聰?shù)闹饕煞种?，現(xiàn)代藥理研究表明其具有抗炎、抗氧化、降糖、降脂等作用，小檗堿(berberine)是其主要的有效成分之一。本研究通過(guò)研究小檗堿對(duì) AGEs 誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化后引發(fā)的炎性反應(yīng)的作用，探討小檗堿在糖尿病認(rèn)知功能障礙中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的可能機(jī)制。

材料與方法

1.材料：小鼠小膠質(zhì)BV-2細(xì)胞細(xì)胞株購(gòu)自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院細(xì)胞中心，編號(hào):3111C0001CCC000063。RPMI-1640液體培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、MTT(美國(guó)Sigma公司)，鹽酸小檗堿(百靈威科技有限公司)，AGEs蛋白質(zhì)(北京博奧森有限公司)，DMSO(北京化工廠)，Anti-CD68抗體(ab53444，英國(guó)Abcam公司)，Anti-RAGE抗體(ab181293，英國(guó)Abcam公司)，pNF-κBp65 抗體(#3033T，美國(guó)CST公司)，TNF-α ELISA試劑盒(美國(guó)eBioscience 公司)，AGEs-BSA(美國(guó)Biovision公司)，Tris、APS、SDS、TEMED、Tween-20、丙氨酰胺、甘氨酸、甲叉雙丙烯酰胺、麗春紅(美國(guó)Sigma公司)，ECL Plus 超敏發(fā)光液(美國(guó)Millipore公司)，羊抗兔HRP 標(biāo)記的二抗、羊抗大鼠HRP 標(biāo)記的二抗(美國(guó)Jackson公司)。倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)，ELX 800 酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司)，全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)，CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Forma3111公司)，自動(dòng)洗板機(jī)(美國(guó)Thermo公司)，電熱恒溫培養(yǎng)箱(中國(guó)DH4000A)，GL-802B微型臺(tái)式真空泵、MINI shaker、搖床(中國(guó)其林貝爾公司)，臺(tái)式冷凍離心機(jī)(中國(guó)湘儀公司)，電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(中國(guó)J-MAX公司)。

2.方法：(1)細(xì)胞培養(yǎng)：小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞BV-2以含10%FBS的RPIM1640培養(yǎng)基培養(yǎng)在37℃含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，隔日換液1次，隔2～3日傳代一次(細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%時(shí)傳代)。(2)細(xì)胞給藥與分組：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BV-2細(xì)胞以3×104/ml的密度接種于6孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后，吸棄舊培養(yǎng)基，然后按分組更換培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)約24h后繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)，(3)分組情況：Con組培養(yǎng)基為無(wú)血清的 RPMI1640 培養(yǎng)基，AGEs組為無(wú)血清的 RPMI1640 培養(yǎng)基+AGEs(終濃度為 300μg/ml)，小檗堿組更換為 10μmol/L 小檗堿預(yù)處理1h后再更換為 300μg/ml AGEs 培養(yǎng)基培養(yǎng) 23h，BSA陰性對(duì)照組為無(wú)血清的 RPMI1640 培養(yǎng)基+BSA(終濃度為 300μg/ml)。(4)細(xì)胞形態(tài)觀察及ELISA檢測(cè)：更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h后倒置相差顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化并攝片。細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)束后提取細(xì)胞上清液，采用TNF-α ELISA試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中TNF-α 含量。(5)細(xì)胞活力檢測(cè)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BV-2細(xì)胞以3×103/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基約100μl，每組設(shè)8個(gè)平行孔，外周1圈空白孔內(nèi)加100μl 0.01mmol/L PBS做空白對(duì)照，細(xì)胞貼壁后按上述實(shí)驗(yàn)分組給藥繼續(xù)培養(yǎng)24h后采用MTT對(duì)細(xì)胞活力進(jìn)行檢測(cè)，選擇570nm波長(zhǎng)在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔吸光度(A)值，記錄并分析結(jié)果。(6)Western blot法檢測(cè)：采用Western blot法對(duì)各組細(xì)胞中CD68、RAGE、pNF-κB p65蛋白進(jìn)行檢測(cè)，蛋白相對(duì)表達(dá)量用各目的蛋白灰度值與相應(yīng)內(nèi)參(actin)灰度值的比值表示。

結(jié) 果

1.小檗堿對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞BV-2形態(tài)的改變:顯微鏡下可見(jiàn):常規(guī)對(duì)照組細(xì)胞 50%～60%貼壁良好，胞體呈梭狀或三角狀，約 40%懸浮生長(zhǎng)。AGEs 組細(xì)胞貼壁數(shù)量較Con組增多，約70%～80%貼壁，部分細(xì)胞活化為胞體較大、突起縮短的阿米巴樣類(lèi)巨噬細(xì)胞(圖1)。BSA 對(duì)照組與Con組比較懸浮細(xì)胞比例相似，并且沒(méi)有出現(xiàn)阿米巴樣細(xì)胞，提示 AGEs 對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的改變與其蛋白屬性無(wú)關(guān)。小檗堿組較AGEs 組阿米巴樣細(xì)胞數(shù)目減少，多為梭形或三角狀細(xì)胞，提示小檗堿對(duì) AGEs 導(dǎo)致的形態(tài)學(xué)改變有一定的恢復(fù)作用。

2.小檗堿對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞BV-2細(xì)胞活力的影響:與Con組比較，AGEs組、小檗堿組及BSA組與Con組之間A值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見(jiàn)圖2。

3.小檗堿對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞上清液中TNF-α分泌量的影響:與Con組比較，AGEs組上清液中TNF-α分泌量顯著升高(P=0.000)；與AGEs組比較，小檗堿組細(xì)胞上清液中TNF-α分泌量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與Con組比較，BSA陰性對(duì)照組上清液中TNF-α分泌量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見(jiàn)圖3。

圖1 不同培養(yǎng)條件下小膠質(zhì)細(xì)胞倒置相差顯微鏡下形態(tài)觀察(×40)A.Con組;B.300μg/ml AGEs 組;C.小檗堿組;D.BSA 對(duì)照組

圖2 各組小膠質(zhì)細(xì)胞BV-2細(xì)胞活力比較(n=24)A.Con組;B.300μg/ml AGEs 組;C.小檗堿組;D.BSA 對(duì)照組

圖3 不同組小膠質(zhì)細(xì)胞上清液中TNF-α分泌量(n=4)A.Con組;B.300μg/ml AGEs 組;C.小檗堿組;D.BSA 對(duì)照組

4.小檗堿對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞CD68、RAGE、pNF-κB p65蛋白表達(dá)的影響:與Con組比較，AGEs組小膠質(zhì)細(xì)胞中CD68、RAGE及pNF-κB p65蛋白的表達(dá)量均明顯升高(P<0.01，P<0.05，P<0.01)，小檗堿組CD68、pNF-κB p65蛋白的表達(dá)量均較AGEs組顯著下降(P<0.01，P<0.05)，RAGE蛋白的表達(dá)量與AGEs組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見(jiàn)圖4。

圖4 小檗堿對(duì)小膠質(zhì) 細(xì)胞CD68、RAGE、pNF-κB p65 蛋白表達(dá)的影響

討 論

多項(xiàng)研究表明，AGEs 與糖尿病認(rèn)知功能障礙關(guān)系密切，2 型糖尿病認(rèn)知功能障礙患者血清 AGEs 水平明顯高于糖尿病非認(rèn)知功能障礙患者[8，9]。AD 樣變病理改變是認(rèn)知功能障礙的重要病理基礎(chǔ)，AGEs 與 AD 樣病理改變的發(fā)生、發(fā)展亦關(guān)系密切。AGEs 不僅常與 Aβ 共同沉積在AD患者/動(dòng)物模型神經(jīng)細(xì)胞外，同時(shí)參與并增加 Aβ 的錯(cuò)誤折疊[10]。另外，Aβ-AGEs 復(fù)合物可通過(guò) RAGE 相關(guān)信號(hào)通路加重 Aβ 的神經(jīng)毒性作用[11]。Tau 蛋白過(guò)度磷酸化方面，在 AD 患者的神經(jīng)原纖維纏結(jié)處同樣可檢測(cè)到 AGEs 的表達(dá)，另外，AGEs亦可通過(guò)RAGE介導(dǎo)的糖原合成酶3(glycogen synthase kinase 3，GSK-3)激活誘導(dǎo) AD 樣 tau 蛋白改變[12]。上述研究均表明AGEs 與糖尿病認(rèn)知功能障礙關(guān)系密切，在認(rèn)知功能障礙發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用，故本研究選用AGEs 為小膠質(zhì)細(xì)胞激活劑，模擬高糖狀態(tài)下神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥激活后的細(xì)胞狀態(tài)。預(yù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中通過(guò)觀察不同濃度下小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化、MTT、細(xì)胞免疫熒光及ELISA 檢測(cè)結(jié)果，同時(shí)結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，筆者最終采用了 300μg/ml 作為 AGEs 實(shí)驗(yàn)干預(yù)濃度。

有研究表明，AGEs可以與細(xì)胞表面RAGE結(jié)合，激活胞內(nèi)炎癥信號(hào)通路并產(chǎn)生活性氧，同時(shí)，NF-κB磷酸化后入核，啟動(dòng)下游基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而誘發(fā)炎癥，導(dǎo)致炎性因子 TNF-α、IL-6 的釋放[4，5]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示AGEs 能顯著上調(diào)小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞表面白細(xì)胞分化抗原68(cluster of differentiation 68,CD68)、RAGE、pNF-κB p65蛋白的表達(dá)，增加炎性因 子TNF-α的分泌量。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果與其相一致。但AGEs 誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活及炎性因子釋放其具體機(jī)制到底是 AGEs 直接激活小膠質(zhì)細(xì)胞導(dǎo)致 CD68 的表達(dá)增高，從而激活 RAGE/NF-κB 通路，增加炎性因子的釋放還是 AGEs 與其受體 RAGE 結(jié)合激活其下游 NF-κB 通路激活使炎性因子升高從而導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞的激活尚不清楚。該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中各信號(hào)分子之間相互影響的具體過(guò)程及機(jī)制尚待進(jìn)一步分子生物學(xué)研究闡明。

根據(jù)認(rèn)知障礙的中醫(yī)病因病機(jī)特點(diǎn)及治療認(rèn)知障礙的臨床經(jīng)驗(yàn)并參考現(xiàn)代藥理學(xué)的研究，筆者設(shè)計(jì)的中藥復(fù)方腦復(fù)聰臨床應(yīng)用對(duì)脾腎虧虛、痰濁血瘀型輕度認(rèn)知功能障礙的患者有良好療效[6]。既往研究表明腦復(fù)聰能夠增加海馬CA1區(qū)胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)的含量，下調(diào)糖尿病認(rèn)知功能障礙大鼠海馬 CA1 區(qū)NF-κB的表達(dá)水平、有效抑制高糖條件下小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，NF-κB 的活力及 NF-κB p65 的表達(dá)，顯著下調(diào) BV-2 上清液中的 IL-6、TNF-α 蛋白和 BV-2 中 IL-6-mRNA、TNF-α-mRNA 的表達(dá)[6，7]。

黃連作為該復(fù)方的組成藥物之一，其主要有效成分小檗堿在腦缺血、阿爾茨海默病、帕金森病、多發(fā)性硬化、糖尿病認(rèn)知功能障礙等多種中樞神經(jīng)損傷性疾病中均能起到一定的神經(jīng)保護(hù)作用[13]。因此，本實(shí)驗(yàn)選用中藥黃連的有效成分小檗堿作為研究藥物。綜合小檗堿對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活化的抑制作用及其對(duì)炎性因子pNF-κB p65蛋白的下調(diào)作用，參考文獻(xiàn)[14～16]，本研究最終采用了 10μmol/L 的作用濃度。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示小檗堿對(duì) AGEs 導(dǎo)致的細(xì)胞上清液中 TNF-α 的升高無(wú)明顯降低作用，這與于希忠等[17]和Lu等[18]所報(bào)道的小檗堿能抑制炎性反應(yīng)、降低 TNF-α含量的研究結(jié)果不一致，推測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致的原因可能為小檗堿預(yù)處理時(shí)間不足或者更換培養(yǎng)基的過(guò)程使得細(xì)胞上清液中能降低 TNF-α 的有效成分流失有關(guān)。Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，小檗堿可以顯著下調(diào)AGEs 培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞CD68和pNF-κB p65 蛋白的表達(dá)，說(shuō)明小檗堿可以抑制300μg/ml AGEs 培養(yǎng)條件下小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，其原因可能與其調(diào)控 NF-κB 相關(guān)信號(hào)通路有關(guān)。

本研究結(jié)果提示小檗堿可以通過(guò)抑制AGEs誘導(dǎo)的小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的活化發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，但具體機(jī)制尚待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)明確，希望能為探討小檗堿作為糖尿病認(rèn)知功能障礙的防治藥物的可能機(jī)制及潛在靶點(diǎn)提供參考。