李晟輝 馮 帆 褚春芳 駱黎靜 李 琳

人類(lèi)生殖道畸形是女性常見(jiàn)的疾病，通常與苗勒管發(fā)育異常有關(guān)。子宮異常是生殖道畸形的一個(gè)亞類(lèi)，包括子宮縱隔、始基子宮、雙角子宮等類(lèi)型[1,2]。文獻(xiàn)報(bào)道女性生殖道畸形的發(fā)生率約為4%～7%[3,4]。女性子宮異常的發(fā)生率約為1%～6%[5,6]。子宮縱隔是最常見(jiàn)的子宮異常類(lèi)型[7]。但子宮縱隔患者生育結(jié)果較差，患者流產(chǎn)率較高[8]。胚胎發(fā)育過(guò)程中，如果子宮正常發(fā)育，苗勒管生長(zhǎng)到泌尿生殖竇后，導(dǎo)管融合進(jìn)入頭側(cè)，形成厚隔，然后中隔的會(huì)再被吸收。子宮縱隔的發(fā)生與中隔的異常吸收有關(guān)。遺傳因素、環(huán)境因素、及其二者的相互作用是生殖道畸形發(fā)生的原因。其中遺傳因素在生殖道畸形發(fā)病機(jī)制中的作用尚不清楚。以往研究發(fā)現(xiàn)多個(gè)基因的突變或拷貝數(shù)變異與生殖道畸形或子宮異常發(fā)生相關(guān)，包括TBX6、HOXA13、HOXA10、WNT9B、EMX2、TP63、LHX1、PBX1、CRKL、RBM8A、PAX2、DACT1、MYCBP2等[9～25]，其中HOXA10和HOXA11基因突變與子宮縱隔的發(fā)生有關(guān)[26,27]。

以往研究子宮縱隔的遺傳致病基因時(shí)多應(yīng)用候選基因重測(cè)序的方法，即對(duì)子宮縱隔患者的某個(gè)基因(例如HOXA10或HOXA11基因)行Sanger測(cè)序來(lái)發(fā)現(xiàn)潛在致病基因突變。近年來(lái)全外顯子組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展使得很多疾病的遺傳學(xué)致病基因和突變得以被發(fā)現(xiàn)。因此本研究使用全外顯子組測(cè)序技術(shù)嘗試對(duì)6例子宮縱隔患者進(jìn)行遺傳學(xué)分析，為了解應(yīng)用全外顯子組測(cè)序技術(shù)尋找子宮縱隔患者遺傳致病突變的可行性。

對(duì)象與方法

1.研究對(duì)象：本研究納入6例子宮縱隔患者，分別命名為P1～P6。P1～P5患者均為完全子宮縱隔患者，P6為不完全子宮縱隔。P3患者合并完全陰道縱隔，P4患者合并不完全陰道縱隔，P6患者合并陰道縱隔和宮頸縱隔。所有患者均在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院就診，在征得患者知情同意后，將患者入組，并抽取患者EDTA抗凝外周血5ml。所有入組患者染色體核型分析均為正常的46;XX核型。

2.DNA提?。夯蚪MDNA的提取使用康為世紀(jì)公司的血液基因組柱式小量提取試劑盒(貨號(hào)：CW2087S)，并按照說(shuō)明書(shū)步驟提取DNA。

3.全外顯子組測(cè)序分析：全外顯子組測(cè)序由安諾優(yōu)達(dá)基因科技(北京)有限公司完成，實(shí)驗(yàn)方法參考本課題組以往發(fā)表文獻(xiàn)[28]。實(shí)驗(yàn)流程：使用AgilentV6外顯子靶向序列富集系統(tǒng)對(duì)全外顯子組序列進(jìn)行捕獲，富集到的序列通過(guò)HiSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行雙端測(cè)序(PE150)。目標(biāo)區(qū)域覆蓋度為99%以上，目標(biāo)區(qū)平均深度高于20×的比例占所有測(cè)序深度的98%?；颊咴紲y(cè)序數(shù)據(jù)通過(guò)比對(duì)軟件BWA定位到人參考基因組UCSC hg19中，得到BAM格式比對(duì)結(jié)果文件。通過(guò)使用突變分析軟件GATK分析出所有變異位點(diǎn)，并通過(guò)ANNOVAR軟件對(duì)于所有變異位點(diǎn)進(jìn)行功能注釋。

4.Sanger測(cè)序驗(yàn)證突變位點(diǎn)：Sanger測(cè)序是為了再次確認(rèn)WNT9B突變?cè)诨颊咧写嬖凇ｒ?yàn)證c.71A>G上游引物序列為：5′-TGAGCGGCGCGAGGAGATGCTA-3′；下游引物序列為：5′-CATCAGAGAG-CGGGACTGACGCCT-3′。驗(yàn)證c.832T>A上游引物序列為：5′-TCCCCCACAGGCTGTGAAGAGTG-3′；下游引物序列為：5′-GGCTTGCTGGGCAGTAGGCCTAG-3′。PCR擴(kuò)增使用上海翊圣生物科技有限公司的高保真DNA聚合酶，PCR退火溫度為61℃。Sanger測(cè)序反應(yīng)交由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司完成。

5.蛋白質(zhì)序列比對(duì)分析：蛋白質(zhì)序列比對(duì)分析使用CLC基因組工作臺(tái)軟件(第10版本)。每個(gè)物種的NCBI蛋白質(zhì)序列號(hào)如下：人，NP_003387；大鼠，NP_001100525；小鼠，NP_035849；斑馬魚(yú)，NP_001131132；非洲爪蟾，NP_001096553。

6.在線(xiàn)突變蛋白致病性預(yù)測(cè)分析：Polyphen-2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)：預(yù)測(cè)值的范圍是從0～1，數(shù)值越高致病可能性越大。Sorting Intolerant From Tolerant(SFT)(https://sift.bii.a-star.edu.sg/)，預(yù)測(cè)值從0～1，數(shù)值越接近或等于0被認(rèn)為越致病。PROVEAN(http://provean.jcvi.org/index.php)：預(yù)測(cè)值<-2.5被認(rèn)為該變異是有害的。Mutation Taster(http://www.mutationtaster.org/)：數(shù)值代表預(yù)測(cè)的可能性，數(shù)值越接近1代表預(yù)測(cè)越準(zhǔn)確。SNPs&GO(http://snps.biofold.org/snps-and-go/snps-and-go.html)：數(shù)值>0.5被認(rèn)為可能致病。PhD-SNP(http://snps.biofold.org/phd-snp/phd-snp.html)：數(shù)值>0.5被認(rèn)為可能致病。

7.在不同數(shù)據(jù)庫(kù)中查看等位基因頻率：外顯子聚集數(shù)據(jù)庫(kù)(ExAC，http://exac.broadinstitute.org/)；千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(1000 Genomes，http://browser.1000genomes.org/)；基因組聚集數(shù)據(jù)庫(kù)(gnomAD，http://gnomad-old.broadinstitute.org/)。

8.蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)：本研究應(yīng)用PSIPRED進(jìn)行蛋白質(zhì)二次結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。PSIPRED使用多達(dá)4個(gè)前饋神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和PSI-BLAST輸出生成二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，PSI-BLAST用于查找相關(guān)序列并構(gòu)建位置特定評(píng)分矩陣。序列概況的產(chǎn)生由PSI-BLAST完成。此配置文件由PSIPRED規(guī)范化。初始二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)由神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)完成。第二神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)用于過(guò)濾第一網(wǎng)絡(luò)的預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)。PSIPRED預(yù)測(cè)結(jié)果為得分最高的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

9.蛋白質(zhì)同源模建：SWISS-MODEL是一種基于網(wǎng)絡(luò)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)同源建模過(guò)程，模型搭建過(guò)程基于ProMod3。構(gòu)建同源蛋白模型主要包含以下4個(gè)步驟：①目標(biāo)序列與模版序列的比對(duì)；②模版結(jié)構(gòu)序列的確定與鑒別；③模型搭建；④模型質(zhì)量評(píng)估。這些步驟需要經(jīng)過(guò)與最新的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，同時(shí)在每一步都需要交互式的反復(fù)地進(jìn)行篩選優(yōu)化，從而得到一個(gè)令人滿(mǎn)意的模型搭建結(jié)果。

結(jié) 果

1.全外顯子組測(cè)序分析：本研究對(duì)6例子宮縱隔患者行全外顯子組測(cè)序，測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)后，對(duì)結(jié)果進(jìn)行篩選。只保留等位基因頻率>3%的錯(cuò)義變異、無(wú)義變異、移碼變異及剪接位點(diǎn)變異。在這些基因中，本研究重點(diǎn)關(guān)注以往研究中發(fā)現(xiàn)的與生殖道畸形有關(guān)的基因，即TBX6、HOXA13、HOXA10、WNT9B、EMX2、TP63、LHX1、PBX1、HOXA11、HOXA7、PAX2、RBM8、CRKL、HNF1B等。因此查看這些生殖道畸形相關(guān)基因在6例患者中的突變情況，發(fā)現(xiàn)WNT9B基因在患者P2和P6中分別發(fā)生罕見(jiàn)變異c.832T>A;p.S278T和c.71A>G;p.Y24C。然后使用Sanger測(cè)序驗(yàn)證了這兩個(gè)變異，發(fā)現(xiàn)患者P6攜帶c.71A>G變異(圖1A)，患者P2攜帶c.832T>A變異(圖1B)。

圖1 WNT9B變異的Sanger測(cè)序分析和保守性分析A.Sanger測(cè)序確認(rèn)患者P6攜帶c.71A>G變異，對(duì)照不攜帶該變異;B.Sanger測(cè)序確認(rèn)患者P2攜帶c.832T>A變異，對(duì)照不攜帶該變異;C.變異的保守性分析。Y24位點(diǎn)在從人到非洲爪蟾的不同物種中非常保守，但S278位點(diǎn)在演化中不保守。紅色箭頭指示差異位置

查詢(xún)ClinVar數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/)，但在該數(shù)據(jù)庫(kù)中未發(fā)現(xiàn)本研究發(fā)現(xiàn)的WNT9B突變。由于無(wú)法獲取患者父母的樣本，因此無(wú)法分析突變是如何遺傳的。

2.變異的致病性分析：首先這兩個(gè)變異非常罕見(jiàn)，c.71A>G變異ExAC、gnomAD和千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的頻率均為0。多個(gè)在線(xiàn)的突變蛋白致病性預(yù)測(cè)軟件認(rèn)為p.Y24C是致病性突變，但p.S278T可能為非致病性變異(表1)。保守性分析亦支持上述觀點(diǎn)，顯示Y24位點(diǎn)在不同物種中非常保守，但S278位點(diǎn)并不保守(圖1C)。因此，以上分析表明p.Y24C很可能是致病性突變，但p.S278T的致病性較弱。

表1 WNT9B變異的致病性分析

Polyphen-2.第2版多態(tài)性表型工具；SIFT.從耐受突變中篩選不耐受的突變工具；PROVEAN.蛋白質(zhì)變異效應(yīng)分析工具；MutationTaster.突變鑒別工具；SNPs&GO.用GO術(shù)語(yǔ)預(yù)測(cè)疾病相關(guān)變異工具；PhD-SNP.人類(lèi)有害單核苷酸多態(tài)性的預(yù)測(cè)因子工具；ExAC.外顯子組聚集數(shù)據(jù)庫(kù)；1000G.千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)；GnomAD.基因組聚集數(shù)據(jù)庫(kù)。D代表致??；N代表中性變異；P代表基因多態(tài)性；B代表良性變異

3.變異的結(jié)構(gòu)生物學(xué)預(yù)測(cè)分析：經(jīng)過(guò)檢索未發(fā)現(xiàn)WNT9B蛋白有已知結(jié)構(gòu)，因此本研究只能通過(guò)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和三級(jí)結(jié)構(gòu)同源模建來(lái)對(duì)突變位置進(jìn)行預(yù)測(cè)和模擬。首先研究通過(guò)PSIPRED方法對(duì)WNT9B蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)Y24位點(diǎn)位于1個(gè)α-螺旋中，S278位于1個(gè)β折疊中(圖2)。接著對(duì)WNT9B進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)同源模建，但由于該蛋白N端沒(méi)有同源已經(jīng)解結(jié)構(gòu)的模型，無(wú)法進(jìn)行同源模建，因此Y24位點(diǎn)無(wú)法得到三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖像。進(jìn)而通過(guò)SWISS-MODEL軟件對(duì)WNT9B蛋白C端結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源模建。通過(guò)模擬結(jié)構(gòu)可以發(fā)現(xiàn)S278位于接觸面上(圖3A)，S突變?yōu)門(mén)之后碳鏈會(huì)延長(zhǎng)，因此可能會(huì)導(dǎo)致新生成的T氨基酸與其下面的α-螺旋上的氨基酸殘疾側(cè)鏈產(chǎn)生新的相互作用(圖3B)。

圖2 WNT9B蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)生物學(xué)分析WNT9B蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，藍(lán)色圓筒代表α-螺旋，長(zhǎng)方形代表β折疊,紅色星號(hào)*代表突變氨基酸位點(diǎn)。Y24C位于一個(gè)α-螺旋中，S278T位于一個(gè)β折疊中

圖3 WNT9B蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)生物學(xué)同源模建分析A.WNT9B蛋白的C端的同源模建分析(表面圖)。紅色箭頭指示S278位點(diǎn)。B. WNT9B蛋白的C端的同源模建分析(卡通圖)。紅色線(xiàn)條顯示放大區(qū)域，紅色箭頭指示S278位點(diǎn)

討 論

本研究通過(guò)對(duì)6例子宮縱隔患者行全外顯子組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)兩例患者分別攜帶WNT9B基因罕見(jiàn)變異。其中p.Y24C變異被預(yù)測(cè)為致病性突變，而p.S278T變異被認(rèn)為可能是非致病性變異。

人WNT9B基因位于染色體17q21.32區(qū)域，由6個(gè)外顯子組成。WNT基因家族由高度保守的發(fā)育控制基因組成，該基因編碼分泌的糖蛋白在胚胎發(fā)育過(guò)程中參與胚胎建成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。小鼠Wnt9b基因在沃爾夫管上皮中表達(dá)，并且對(duì)繆勒氏管的尾部延伸至關(guān)重要。研究還發(fā)現(xiàn)Wnt9b在發(fā)育中的泌尿生殖系統(tǒng)中作用于Wnt4的上游。Wnt9b對(duì)于早期誘導(dǎo)后腎間質(zhì)是必需的。此外表達(dá)Wnt9b的細(xì)胞可以在功能上替代輸尿管芽。輸尿管芽通過(guò)分泌可溶性生長(zhǎng)因子Wnt9b向后腎間質(zhì)發(fā)出信號(hào)，Wnt9b通過(guò)β-catenin誘導(dǎo)后腎間質(zhì)中Fgf8、LIM同源盒基因Lhx1和Wnt4的表達(dá)。Wnt4誘導(dǎo)后腎間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化(MET)并分化為腎單位上皮。在沃爾夫管中Wnt9b誘導(dǎo)的MET受到HNF1B基因的調(diào)控。除了在MET中的作用外，Wnt9b對(duì)于后期腎臟形態(tài)建成是必須的。因此綜上所述，Wnt9b來(lái)源于沃爾夫管，并且對(duì)于管的延伸是必須的。

Wnt9b基因敲除雌性小鼠缺乏子宮和上陰道，但卵巢正常，這與人類(lèi)MRKH綜合征表型相近。因此WNT9B基因突變亦可能與女性生殖道畸形發(fā)生有關(guān)。Wang等[29]在MRKH患者中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)WNT9B突變。Waschk等[14]在109例MRKH綜合征和117其他子宮畸形患者中發(fā)現(xiàn)5例MRKH患者和1例雙角子宮患者攜帶不同的WNT9B基因突變。而本研究則首次在子宮縱隔患者中發(fā)現(xiàn)WNT9B基因突變。子宮縱隔的發(fā)生多是因?yàn)樽訉m中隔的異常吸收而導(dǎo)致的畸形，較MRKH綜合征(先天性無(wú)陰道無(wú)子宮)的畸形程度輕微。由于本研究使用全外顯子組測(cè)序技術(shù)，通過(guò)測(cè)序結(jié)果可以得知攜帶此WNT9B基因突變的患者未發(fā)現(xiàn)同時(shí)攜帶可能導(dǎo)致子宮縱隔的其他基因突變。其中p.Y24C突變被6個(gè)在線(xiàn)功能預(yù)測(cè)程序中的5個(gè)認(rèn)為是致病性變異，結(jié)構(gòu)生物學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)Y24位于一個(gè)α-螺旋中，Y24突變?yōu)镃，可能會(huì)產(chǎn)生新的分子內(nèi)或分子間二硫鍵從而影響蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)。因此p.Y24C突變可能為致病性基因突變。p.S278T變異則被所有程序認(rèn)為是非致病性變異，但三維結(jié)構(gòu)同源模建發(fā)現(xiàn)S278突變?yōu)門(mén)之后碳鏈會(huì)延長(zhǎng)，可能會(huì)導(dǎo)致新生成的T氨基酸與其下面的α-螺旋上的氨基酸殘疾側(cè)鏈產(chǎn)生新的相互作用。因此雖然p.S278T被生物信息學(xué)預(yù)測(cè)為非致病性變異，但結(jié)構(gòu)生物學(xué)預(yù)測(cè)其有可能產(chǎn)生不良影響。

本研究認(rèn)為全外顯子組測(cè)序的強(qiáng)大之處在于其高通量性，這比候選基因重測(cè)序每一次只能關(guān)于一個(gè)基因或少數(shù)幾個(gè)基因要高效很多。本研究?jī)H通過(guò)對(duì)6例患者測(cè)序就發(fā)現(xiàn)2例攜帶WNT9B基因變異，這表明全外顯子組測(cè)序在發(fā)現(xiàn)疾病致病基因突變上是一個(gè)強(qiáng)大的工具。對(duì)于另外4例患者，目前尚未發(fā)現(xiàn)可疑基因突變，但是隨著生殖道發(fā)育生物學(xué)的發(fā)展，更多基因功能逐漸被闡明，亦可能在4例患者中鑒定到新的基因突變。當(dāng)然，本質(zhì)上不是所有患者都是因?yàn)檫z傳因素發(fā)病，全外顯子組測(cè)序甚至全基因組測(cè)序的應(yīng)用則是盡可能地找到那些遺傳致病因素。本研究的不足之處在于未對(duì)p.Y24C和p.S278T變異的致病性做更深入的分子細(xì)胞生物學(xué)等功能性研究。因此本課題未來(lái)的研究重點(diǎn)是揭示這兩個(gè)變異是否引起WNT9B蛋白功能的改變。

綜上所述，本研究通過(guò)使用全外顯子組測(cè)序技術(shù)在6例子宮縱隔患者中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)WNT9B基因的罕見(jiàn)變異。通過(guò)生物信息學(xué)及結(jié)構(gòu)生物學(xué)預(yù)測(cè)分析筆者認(rèn)為p.Y24C可能是致病性基因突變。