劉 坤 王玉杰 李亞瓊 張 浩 張勝男 魏 盛

雌性性成熟大鼠規(guī)律的動(dòng)情周期一般為4～5天，分為動(dòng)情前期、動(dòng)情期、動(dòng)情后期和動(dòng)情間期[1]。在動(dòng)情周期的不同階段大鼠的生殖及內(nèi)分泌系統(tǒng)會(huì)發(fā)生組織學(xué)與生理學(xué)上的變化[2]。動(dòng)情周期規(guī)律的雌性大鼠作為一種動(dòng)物模型在探索女性月經(jīng)周期相關(guān)疾病的發(fā)生機(jī)制、評價(jià)藥物的作用效果以及相應(yīng)藥物開發(fā)的實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用廣泛。但自然狀態(tài)下動(dòng)情周期規(guī)律的雌性大鼠只占10%左右，并且其動(dòng)情周期并不同步，極大干擾了相關(guān)研究工作的進(jìn)行[3]。探索人工誘導(dǎo)雌性大鼠動(dòng)情周期的方法可以在誘導(dǎo)大鼠規(guī)律動(dòng)情周期的同時(shí)保證其同步性，以便于在進(jìn)行動(dòng)物數(shù)量較多的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行平行對照。同時(shí)，通過掌握對大鼠進(jìn)行激素誘導(dǎo)的時(shí)間可推斷大鼠所處動(dòng)情周期的階段，避免了在確定大鼠動(dòng)情周期的階段時(shí)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)操作并可以減少其對大鼠的刺激與影響。此方法在實(shí)驗(yàn)研究中無疑具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

人工誘導(dǎo)雌性大鼠動(dòng)情周期的方法在國內(nèi)外鮮有報(bào)道。Ho等[4]通過注射苯甲酸雌二醇、雌二醇和孕酮的方式成功誘導(dǎo)出與正常雌性大鼠陰道的周期性改變一致的動(dòng)物模型，并運(yùn)用于PMS大鼠模型的制備中，驗(yàn)證了此種方法的可靠性。筆者課題組在前期的研究中已經(jīng)證實(shí)此種方法可以誘導(dǎo)出動(dòng)情周期規(guī)律且同步的大鼠，本實(shí)驗(yàn)在前期經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上將溶解的溶劑由麻油改為二甲基亞砜(DMSO)，以解決激素在麻油中不能充分溶解的問題，應(yīng)用于大鼠動(dòng)情周期的人工誘導(dǎo)中。

本研究用陰道電阻儀檢測大鼠陰道電阻值，將動(dòng)情周期規(guī)律與不規(guī)律的大鼠分為兩組(將動(dòng)情周期規(guī)律的大鼠組作為對照)，均進(jìn)行卵巢切除術(shù)后行雌、孕激素聯(lián)合給藥以人工誘導(dǎo)大鼠同步且規(guī)律的動(dòng)情周期，為相關(guān)的實(shí)驗(yàn)提供可靠的大鼠模型。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：100只SPF級雌性性成熟Wistar大鼠，6～8周齡，體質(zhì)量120～160g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供[生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2016-0006]。進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室后，所有大鼠均在屏障環(huán)境[使用許可證號：SYXK(魯)2017-0022]中單籠飼養(yǎng)，保持12h/12h明暗周期，晝夜顛倒(8:00時(shí)關(guān)燈，20:00時(shí)開燈)。飼養(yǎng)大鼠房間保持室溫21±1℃，相對濕度45%，自由采食和飲水。實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行7天的適應(yīng)性飼養(yǎng)以適應(yīng)環(huán)境，定時(shí)進(jìn)行抓握以平行操作[5]。所有實(shí)驗(yàn)操作遵從于美國NIH頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》，并由山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號：DWSY201703013)。

2.器材和試劑：大鼠受孕期分析儀(MK-11)購自室町機(jī)械株式會(huì)社；苯甲酸雌二醇、雌二醇購自麥克林(上海)貿(mào)易有限公司；孕酮購自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；青霉素鉀購自江蘇南農(nóng)高科動(dòng)物藥業(yè)有限公司；水合氯醛購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。苯甲酸雌二醇(0.5微克/只)、雌二醇(0.5微克/只)、孕酮(0.5毫克/只)在使用前用DMSO溶劑配成相應(yīng)濃度溶液，青霉素鉀使用前用0.9%氯化鈉注射液配成相應(yīng)濃度溶液(2單位/只)，水合氯醛使用前用0.9%氯化鈉注射液配成10%濃度溶液。

3.陰道電阻法檢測大鼠動(dòng)情周期并根據(jù)動(dòng)情周期是否規(guī)律對大鼠進(jìn)行分組:通過測量大鼠的陰道電阻值并觀察其變化趨勢可以判斷大鼠的動(dòng)情周期是否規(guī)律。動(dòng)情周期規(guī)律大鼠的陰道電阻值滿足以4天為1個(gè)周期，且非接受期(動(dòng)情后期、動(dòng)情間期)陰道電阻值<3kΩ,接受期(動(dòng)情前期、動(dòng)情期)陰道電阻值≥3kΩ的規(guī)律。對實(shí)驗(yàn)的100只雌性成熟Wistar大鼠進(jìn)行陰道電阻值測量。正常大鼠的動(dòng)情周期一般為4天，少數(shù)為5天。因此陰道電阻值至少需測量兩個(gè)周期，即9天左右。為避免測量時(shí)間不合適導(dǎo)致數(shù)據(jù)偏差及傍晚測量造成假孕，陰道電阻的測量時(shí)間選擇在下午13:00時(shí)～15:00時(shí)。陰道電阻測量方法：打開大鼠受孕分析儀電源開關(guān)，檢查設(shè)備相關(guān)狀況，確認(rèn)設(shè)備初始值為10.00kΩ后，用0.9%氯化鈉注射液清洗陰道探頭并消毒，放置在一側(cè)待用。左手抓取大鼠，將其頭部置于中指和示指之間，使其處于仰臥位，抓握大鼠時(shí)應(yīng)盡量保持動(dòng)作輕柔溫和，減少大鼠的痛苦[6]。待大鼠四肢放松在最舒適狀態(tài)時(shí)進(jìn)行測量。將陰道探針輕輕的插入大鼠陰道內(nèi)約30s測量陰道電阻，每次測量前用0.9%氯化鈉注射液清洗。待電阻儀顯示數(shù)值穩(wěn)定后讀取數(shù)據(jù)并做好記錄。測定完成，檢查儀器正常，關(guān)閉電源并消毒探針。

4.卵巢切除術(shù)后雌孕激素聯(lián)合給藥誘導(dǎo)：進(jìn)行陰道電阻值測量后，通過觀察大鼠陰道電阻值的特點(diǎn)將大鼠分為兩組，10只為動(dòng)情周期規(guī)律的大鼠，90只為動(dòng)情周期不規(guī)律的大鼠，為驗(yàn)證激素誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)的可靠性，筆者對兩組大鼠均進(jìn)行了卵巢切除術(shù)后的雌孕激素聯(lián)合誘導(dǎo)。

(1)卵巢切除術(shù)：術(shù)前大鼠禁食禁水(12h)。用水合氯醛(10%)按照3ml/kg劑量注射進(jìn)行麻醉。麻醉指征：呼吸平穩(wěn)、角膜反射小或遲鈍、皮膚夾捏反應(yīng)消失、全身肌肉松弛。仰臥位固定大鼠四肢。以腹正中線距離陰道口2.5cm處為中心，半徑1.5cm的范圍用剪刀剪掉大鼠皮毛，碘伏消毒。在低于觸診肋骨的1.5cm處做一切口，逐層鈍性分離,進(jìn)入腹腔，使用彎鑷從切口處向腹腔下方找到子宮角，順著子宮可以慢慢拉出脂肪包裹呈粉紅色桑葚狀的卵巢，然后在大鼠卵巢與輸卵管相交部位0.5～1.0cm處按照縫合打結(jié)的方法進(jìn)行結(jié)扎，結(jié)扎完成剪下大鼠卵巢[7]。青霉素消炎后將子宮送回腹腔，分層縫合后青霉素消炎，術(shù)后恢復(fù)1周。卵巢摘除后的大鼠于每天下午的14：00、15：00、16：00、17：00時(shí)檢測陰道電阻，檢測1個(gè)動(dòng)情周期。

(2)激素誘導(dǎo)：卵巢切除術(shù)后的大鼠于0h(第1次皮下注射激素作為計(jì)時(shí)開始)、32h、44h分別皮下注射苯甲酸雌二醇、雌二醇、孕酮[4]。第1次注射激素時(shí)間(即0h)選擇在中午11:30時(shí)注射苯甲酸雌二醇，32h后即第2天下午19:30時(shí)注射雌二醇，44h即第3天早上7:30時(shí)注射孕酮，第4天不注射。連續(xù)激素誘導(dǎo)兩個(gè)動(dòng)情周期，檢測此期間大鼠陰道電阻值。注射時(shí)左手拇指和示指揪起背部皮膚1cm左右，手掌蒙住大鼠眼睛并起固定作用，右手持針從揪起的兩層皮膚中間進(jìn)針，保持進(jìn)針方向與皮膚平行，感覺到針尖傳來突破感即針尖穿破皮質(zhì)，此時(shí)便可推動(dòng)注射器注入激素。注射激素過程中要確保針尖在皮膚里，防止用力過大導(dǎo)致針尖穿透兩層皮膚而刺出皮膚外。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用GraphPad Prism 7.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述。

結(jié) 果

1.陰道電阻法檢測大鼠動(dòng)情周期的結(jié)果:動(dòng)情周期規(guī)律大鼠各時(shí)期陰道表皮細(xì)胞的電阻值符合一定規(guī)律：滿足4天1個(gè)周期循環(huán)，且接受期電阻值≥3kΩ，非接受期電阻值<3kΩ, 說明大鼠動(dòng)情周期規(guī)律(圖1)。動(dòng)情周期不規(guī)律大鼠的陰道電阻值曲線未呈現(xiàn)共同的電阻值變化規(guī)律，因此筆者列舉了兩種典型的電阻圖情況。大鼠的陰道電阻值保持<3kΩ的水平而無周期性波動(dòng)(圖2A)；大鼠的陰道電阻值僅出現(xiàn)一個(gè)動(dòng)情周期而無連續(xù)的周期性變化(圖2B)。此類大鼠的動(dòng)情周期不規(guī)律。

圖1 動(dòng)情周期規(guī)律大鼠陰道電阻波動(dòng)情況(n=10)此圖對動(dòng)情周期規(guī)律大鼠不同時(shí)間測得的陰道電阻值進(jìn)行了同步化調(diào)整

圖2 動(dòng)情周期不規(guī)律大鼠兩種典型的陰道電阻波動(dòng)情況A.大鼠的陰道電阻值保持<3kΩ的水平而無周期性波動(dòng);B.大鼠的陰道電阻值僅出現(xiàn)一個(gè)動(dòng)情周期而無連續(xù)的周期性變化

2.卵巢切除后大鼠的陰道電阻值結(jié)果:連續(xù)檢測5天卵巢切除后的大鼠的陰道電阻值，陰道電阻值失去周期性變化，且處于<3kΩ的水平(圖3)。

圖3 卵巢切除后大鼠的陰道電阻波動(dòng)情況(n=100)

3.激素誘導(dǎo)后大鼠的陰道電阻值結(jié)果:由圖4中電阻值的變化規(guī)律可知，進(jìn)行雌孕激素誘導(dǎo)后兩組大鼠的陰道電阻值均出現(xiàn)以4天為1個(gè)周期，連續(xù)兩個(gè)周期的動(dòng)情周期變化趨勢。其第1、2、4天陰道電阻值<3kΩ,第3天≥3kΩ，證明外源性雌孕激素聯(lián)合給藥可以誘導(dǎo)雌性大鼠規(guī)律且同步的動(dòng)情周期。

討 論

雌性性成熟大鼠動(dòng)情周期的變化與其體內(nèi)卵巢分泌雌孕激素的狀況密切相關(guān)。卵巢內(nèi)性激素導(dǎo)致的卵泡和黃體發(fā)生的一系列變化對應(yīng)了大鼠動(dòng)情周期的不同階段。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)動(dòng)情周期與雌孕激素的相關(guān)性，通過雌孕激素聯(lián)合給藥的方法誘導(dǎo)雌性大鼠的人工周期，為相關(guān)研究提供可靠的大鼠模型。

圖4 激素誘導(dǎo)兩個(gè)周期后大鼠的陰道電阻波動(dòng)情況(n=100)A.動(dòng)情周期規(guī)律大鼠；B.動(dòng)情周期不規(guī)律大鼠

Iwasaki等[8]的研究指出由陰道電阻法測得大鼠的陰道電阻值與大鼠動(dòng)情周期的相關(guān)性較高。Jaramillo等[6]通過檢測大鼠陰道電阻值的方法確定了大鼠的動(dòng)情前期，提出此種方法準(zhǔn)確率高，并可以降低大鼠假孕的概率。在使用陰道電阻值篩選動(dòng)情周期規(guī)律的大鼠時(shí)，合格大鼠的陰道電阻圖呈現(xiàn)動(dòng)情周期持續(xù)4天，接受期電阻值≥3kΩ，非接受期電阻值<3kΩ的特點(diǎn)。而動(dòng)情周期不規(guī)律大鼠的陰道電阻值無相同的規(guī)律可尋。郭浩等[9]在文獻(xiàn)中提出電阻值的變化主要是由于在動(dòng)情周期的不同階段，激素發(fā)生周期性變化，其作用于陰道，使黏液的分泌量及內(nèi)容物發(fā)生了改變，從而陰道內(nèi)的導(dǎo)電性發(fā)生改變，所以電阻值表現(xiàn)為從發(fā)情前期到發(fā)情期的不同變化狀態(tài)。而≥3kΩ的峰值出現(xiàn)的原因可能與黃體分泌的高峰期有關(guān)。而這些研究發(fā)現(xiàn)佐證了激素與大鼠動(dòng)情周期的相關(guān)性。但并非所有雌性性成熟大鼠的動(dòng)情周期都是規(guī)律變化的，很多大鼠的動(dòng)情周期并不規(guī)律，出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能為大鼠本身及外界因素的影響，比如一些氣味的影響以及過頻的電阻儀測量可能會(huì)作為一種刺激影響動(dòng)物的發(fā)情。

卵巢切除術(shù)后大鼠陰道電阻值的波動(dòng)特點(diǎn)顯示，兩組大鼠的陰道電阻值在進(jìn)行卵巢切除術(shù)后均處于較低的水平。動(dòng)情周期規(guī)律的大鼠其陰道電阻值失去其周期性變化處于較低的水平，其≥3kΩ的峰值也消失。Wistar雌性性成熟大鼠在切除卵巢后不能持續(xù)分泌性激素，大鼠的子宮內(nèi)膜及陰道不能受到來自性激素的調(diào)控，其生理學(xué)變化消失，因此大鼠的陰道電阻值處于較低的水平且其周期性變化消失；卵巢切除后，卵泡及黃體的生理學(xué)變化消失，在此基礎(chǔ)上發(fā)生的激素分泌水平的變化隨之消失，由黃體分泌的孕酮即處于低水平狀態(tài)，這與大鼠的陰道電阻值失去其峰值有關(guān)[10]。動(dòng)情周期不規(guī)律大鼠的陰道電阻值不再無規(guī)律可循，同處于低水平。這也證實(shí)了卵巢切除后大鼠的動(dòng)情周期排除了內(nèi)源性激素的影響。

進(jìn)行雌孕激素聯(lián)合給藥誘導(dǎo)后兩組大鼠連續(xù)兩個(gè)動(dòng)情周期的陰道電阻圖均呈現(xiàn)規(guī)律且同步的變化。同時(shí)證明了此方法同樣適用于動(dòng)情周期不規(guī)律的大鼠群體。即在對大鼠進(jìn)行激素誘導(dǎo)之前已經(jīng)排除了其自身激素的影響。在注射苯甲酸雌二醇及雌二醇的第1、2天及未注射激素的第4天，大鼠的陰道電阻值水平<3kΩ，其與大鼠處于非接受期的特點(diǎn)一致；在注射孕酮的第3天，大鼠的陰道電阻值≥3kΩ，與大鼠處于接受期的特點(diǎn)一致。Marcondes等[11]研究報(bào)道雌二醇在大鼠的發(fā)情期開始升高，發(fā)情前達(dá)到峰值，發(fā)情時(shí)回到基線，孕酮分泌在動(dòng)情間期和動(dòng)情后期增加，隨后減少。此項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)在一定程度上證實(shí)了體外激素注射誘導(dǎo)動(dòng)物動(dòng)情周期的可靠性。苯甲酸雌二醇與雌二醇均為雌激素類藥物，但其代謝途徑及代謝產(chǎn)物不盡相同，另外3種激素在大鼠體內(nèi)的代謝速率也會(huì)影響大鼠體內(nèi)的激素水平從而表現(xiàn)為陰道電阻值的變化。

本實(shí)驗(yàn)通過測量陰道電阻值的方法確定大鼠的動(dòng)情周期并通過外源性雌孕激素注射的方法成功誘導(dǎo)大鼠規(guī)律的動(dòng)情周期，為制備動(dòng)情周期同步且規(guī)律的大鼠模型提供了新的方法。同時(shí)，筆者在前期的PMDD藥效實(shí)驗(yàn)證實(shí)了在雌孕激素聯(lián)合給藥誘導(dǎo)大鼠人工動(dòng)情周期的過程中如果進(jìn)行其他的藥物試驗(yàn)并不會(huì)對其產(chǎn)生影響。但關(guān)于如何對激素注射后的大鼠體內(nèi)的內(nèi)分泌代謝改變進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測以掌握激素在大鼠體內(nèi)的詳細(xì)代謝機(jī)制等問題的解答仍需要開展進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。