沈潔娜 李根新 張 強 張丹輝 王 賓楊創(chuàng)學 高更更 雷穎虎* 趙鵬鵬*

(1.陜西省林業(yè)科學院秦嶺大熊貓繁育研究中心，周至，710402；2.陜西省西安市鄠邑區(qū)祖庵鎮(zhèn)人民政府，西安，710308)

大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)屬于季節(jié)性單次發(fā)情動物，每年春季發(fā)情1次，發(fā)情期約1—2周。一般每次發(fā)情排卵期僅為l—2 d，排卵數(shù)1—2枚，偶有3枚[1]，大熊貓的妊娠期差異很大，最短89 d，最長186 d[2]，張志和等[3]曾對51次圈養(yǎng)大熊貓妊娠期進行統(tǒng)計，平均妊娠期為(144±20)d。大熊貓在繁殖期易受外界環(huán)境如地理位置、氣候狀況、生存環(huán)境的影響而發(fā)生變化，目前國內(nèi)外對于大熊貓生殖內(nèi)分泌的研究較多，但對于秦嶺大熊貓的報道鮮有，該研究采用ELISA檢測方法探索秦嶺大熊貓繁殖期尿液中生殖激素變化規(guī)律，旨在確定最佳人工授精時間及成功受孕的大熊貓產(chǎn)仔時間，為提高秦嶺大熊貓人工種群數(shù)量提供參考價值。

1 材料和方法

1.1 實驗對象

陜西省林業(yè)科學院秦嶺大熊貓繁育研究中心成年雌性大熊貓，年齡6—19歲不等。

1.2 樣品收集

大熊貓發(fā)情前期每周采集2次新鮮尿樣，以確定激素基礎值，發(fā)情初期每天采集尿樣1次，中期每天采集2次，高峰期每間隔3—4 h采集1次，配種后每天采集尿樣1次，直至產(chǎn)后1周或假孕結(jié)束。每次采集尿樣約3 mL，樣品-20 ℃保存，發(fā)情高峰期采樣后直接檢測。

1.3 實驗儀器及試劑

抗體(E1G-Ab、P4-Ab)、酶標抗原(E1G-HRP、P4-HRP)、標準品(E1G-st、P4-st)來自Smithsonian Institution；羊抗兔、羊抗鼠、肌苷酸標準品、TMB、NaOH等常規(guī)試劑均來自Sigma-Aldrich；酶標板來自Thermo Fisher Scientific；酶標儀型號DNM-9602系列酶標分析儀，北京普朗新技術有限公司，中國。

表1 大熊貓基本信息

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用酶標儀自帶軟件讀板，用Microsoft Excel 97-2003對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

統(tǒng)計2017—2019年參與繁殖的雌性大熊貓配種時間及產(chǎn)仔情況(表2)。

表2 2017—2019大熊貓配種及產(chǎn)仔情況

該16例雌性大熊貓繁殖期雖然E1G/Cr與P4/Cr變化時間與峰值數(shù)值不同，但是E1G/Cr與P4/Cr的變化趨勢是類似的，因此該文中沒有逐一列出每一例大熊貓激素變化圖，而是利用 Microsoft PowerPoint 畫出了一個簡化模式圖(圖1)，僅代表2種激素變化趨勢，以直觀顯示各階段變化規(guī)律。

2.1 發(fā)情期雌性大熊貓生殖激素變化

上述15例(不包含2017年4#)大熊貓發(fā)情持續(xù)天數(shù)6—15 d不等，最短6 d(7#2019)，最長15 d(4#2019)，平均10.8 d；其中1—5月發(fā)情11例，占73.3%，6—7月發(fā)情4例，占26.7%。對比6、7月和1—5月發(fā)情大熊貓的激素變化水平和發(fā)情持續(xù)天數(shù)，沒有明顯差異。大熊貓發(fā)情前期雌激素和孕激素均處于較低水平，進入發(fā)情期后，雌激素逐漸上升，孕激素開始下降，當雌激素到達峰值后會快速下降，孕酮則逐漸上升，E1G峰值58—240 ng/mgCr，平均147.7 ng/mgCr。

該15例均為人工授精，平均首次人工授精時間在E1G/Cr峰值后29.8 h，即在當雌激素從峰值開始下降，孕酮持續(xù)上升時為最佳人工授精時間。結(jié)果顯示有7例大熊貓受孕(1#2017，1#2019，2#2017，2#2019，以及3例流產(chǎn)，4#2017年雖然成功產(chǎn)仔，但配種未在我中心完成，故未計算在內(nèi))，成功率為46.7%，馮文和[4]等對1980—1993年圈養(yǎng)條件下的大熊貓155次不同配種方式的繁殖結(jié)果進行統(tǒng)計，全人工授精的產(chǎn)仔率為20.4%，說明本研究最佳人工授精時間的判斷是合適的。

對比發(fā)現(xiàn)，P4/Cr在E1G/Cr峰值前開始上升，平均首次人工授精時間在E1G/Cr峰值后24.2 h，低于平均時間；P4/Cr在E1G/Cr峰值后開始上升，平均首次人工授精時間在E1G/Cr峰值后32.6 h，高于平均時間。P4/Cr在E1G/Cr峰值前開始上升E1G/Cr下降的速度更快，P4/Cr的持續(xù)上升意味著已經(jīng)排卵，因此人工授精時間提前。不同大熊貓P4/Cr有可能在E1G/Cr峰值前上升，也有可能在E1G/Cr峰值后上升，且同一只大熊貓在不同年份的發(fā)情，P4/Cr上升有可能在E1G/Cr峰值前，也可能在峰值后(3#2017年與2018年、5#2018年與2017、2019年)。

在不同年齡的雌性大熊貓中，初情大熊貓平均人工授精時間距離EC/CR峰值較經(jīng)產(chǎn)大熊貓早約5.1 h。

2.2 配種后雌性大熊貓生殖激素變化

雌性大熊貓配種后雌激素一直處于較低水平，孕激素在配種后有小幅度升高，在小范圍內(nèi)波動并處于較為穩(wěn)定狀態(tài)，此階段(T2)大熊貓普遍食欲旺盛，正?；顒?表4)。

圖1 雌性大熊貓繁殖期雌激素(E1G/Cr)與孕酮(P4/Cr)變化規(guī)律示意圖Fig.2 Schema of changes in estrogen(E1G)and progesterone(P4)of female giant pandas during reproduction

表3 發(fā)情期生殖激素不同表現(xiàn)類型與平均首次人工授精時間(T1)對比

表4 產(chǎn)仔與未產(chǎn)仔大熊貓P4不同階段平均時間對比

5例產(chǎn)仔大熊貓T2平均為94 d，3例流產(chǎn)大熊貓T2平均為92 d，假孕大熊貓為91 d，未見明顯差異。T3為P4快速上升階段，產(chǎn)仔與流產(chǎn)、假孕大熊貓均在2周左右時間達到孕激素峰值，該階段大熊貓未表現(xiàn)出明顯差異，并均出現(xiàn)減食現(xiàn)象。對比孕激素峰值，產(chǎn)仔大熊貓平均孕激素峰值為1 229 ng/mgCr，高于假孕大熊貓。T4階段為P4峰值到大熊貓產(chǎn)仔時間，產(chǎn)仔大熊貓在P4峰值后平均23 d后產(chǎn)仔，流產(chǎn)大熊貓平均31 d后流產(chǎn)。該研究中有3例流產(chǎn)案例，2018年3#與5#流產(chǎn)表現(xiàn)極其類似，均在P4峰值后36 d和38 d出現(xiàn)流產(chǎn)現(xiàn)象，不同的是5#2019年又發(fā)生流產(chǎn)，但在P4峰值后18 d出現(xiàn)流產(chǎn)現(xiàn)象，2019年5#因有羊水流出及不明紅色團塊樣組織流出，以及產(chǎn)后惡露陸續(xù)排出，故推測其成功受孕，但胎兒未能成活，其流產(chǎn)原因還有待進一步檢查分析。

產(chǎn)仔大熊貓妊娠期平均為132 d，產(chǎn)后或假孕結(jié)束孕激素會逐漸下降至休情期水平并維持在低水平上，直至下次大熊貓發(fā)情出現(xiàn)新一輪的周期性變化。

3 討論

馮文和等[4]認為雌性大熊貓配種或輸精較適時間在發(fā)情高峰期與發(fā)情后期之間，其次為發(fā)情高峰期。在大熊貓發(fā)情高峰前進行人工授精是不適當?shù)?，發(fā)情前期大熊貓卵巢尚處于卵泡發(fā)育階段，尚未排卵，若此時進行麻醉人工授精可能抑制大熊貓排卵。但過晚的人工授精由于卵子受時間限制活力減弱，配種將導致其受孕率降低[5]。本研究成功產(chǎn)仔大熊貓的首次配種時間均在峰值后，與馮文和等結(jié)論一致。

大熊貓配種后孕激素P4的變化可分為3個時期(T2、T3、T4)，T2階段孕激素維持在一定水平，未表現(xiàn)出明顯上升，若大熊貓成功受孕，此時受精卵可能表現(xiàn)出延遲著床現(xiàn)象，延遲著床被認為是由黃體不足引起的[6-7]。T3階段孕激素快速上升，受精卵有可能在該階段著床，一般哺乳動物的孕酮在妊娠期間主要由胎盤分泌，隨著妊娠期胚胎的發(fā)育，胎盤的體積也逐漸增大，也會分泌更多的孕酮[8]，以促進胎兒更好地發(fā)育。配種后假孕大熊貓與成功受孕大熊貓孕激素有相似的變化規(guī)律，甚至未配種的雌性亞成體大熊貓也有假孕現(xiàn)象，并同樣有相似的變化規(guī)律，其原因還有待進一步探索。