王 娜，劉 暢，劉斯靜，WANG Xiao，李玉坤,薛 鵬*

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北省骨科生物力學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050051；2.河北醫(yī)科大學(xué)期刊社，河北 石家莊 050017；3.約翰·霍普金斯醫(yī)學(xué)院肌肉與骨骼研究中心，美國(guó) 馬里蘭 21212)

骨組織可持續(xù)再生，但在病理狀態(tài)下這種自我修復(fù)能力會(huì)被降低。糖尿病等疾病破壞骨轉(zhuǎn)換平衡，導(dǎo)致骨組織再生障礙，骨修復(fù)能力受損，骨微結(jié)構(gòu)異常而易于發(fā)生脆性骨折[1]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs)具有多向分化潛能，可分化為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等[2]，其向成骨細(xì)胞分化能力在骨質(zhì)疏松癥發(fā)病中具有重要意義。BMSCs分化方向受多種因素調(diào)節(jié)，尤其是轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子。其中，具有盤(pán)狀同源區(qū)域結(jié)合序列的轉(zhuǎn)錄共活化因子(transcriptional coactivator with PDZ-binding motif，TAZ)具有廣泛生物學(xué)功能，參與調(diào)節(jié)BMSCs成骨-成脂分化平衡[3]。TAZ通過(guò)結(jié)合Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(runt related transcription factor 2，RUNX2)促進(jìn)成骨分化，或結(jié)合過(guò)氧化物酶體增生物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptorγ，PPARγ)抑制成脂分化[4-5]。作為胰島素通路的樞紐因子，胰島素受體底物1(insulin receptor substrate 1，IRS-1)在糖尿病、骨質(zhì)疏松癥中的作用舉重若輕。目前，關(guān)于IRS-1對(duì)BMSCs分化的影響尚有爭(zhēng)議。據(jù)報(bào)道，IRS-1胞內(nèi)蓄積有利于細(xì)胞向成軟骨方向分化[6]。也有其他學(xué)者認(rèn)為，IRS-1是細(xì)胞分化的抑制因子[7-8]。據(jù)此，本研究將進(jìn)一步探索IRS-1/TAZ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)BMSCs向成骨細(xì)胞分化的潛在機(jī)制，為干細(xì)胞分化調(diào)控程序提供新靶點(diǎn)。報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 3月齡SPF級(jí)雌性未受孕SD(Sprague Dawley)大鼠15只，用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)；4周齡SD大鼠9只，用于BMSCs的原代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證書(shū)號(hào) 1708080。

1.2動(dòng)物分組及骨質(zhì)疏松模型的構(gòu)建 將15只3月齡SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、假手術(shù)組、去卵巢手術(shù)(ovariectomy，OVX)組，每組5只。去卵巢手術(shù)操作步驟如下：大鼠禁食禁水12 h后，對(duì)其進(jìn)行麻醉，于俯臥位對(duì)大鼠卵巢進(jìn)行定位，消毒手術(shù)部位，依次剪開(kāi)皮膚、肌肉及筋膜，分離脂肪團(tuán)，手術(shù)結(jié)扎輸卵管，完整切除雙側(cè)卵巢，止血并逐層縫合。假手術(shù)組僅切除卵巢等體積大小脂肪組織，保留卵巢。術(shù)后3 d內(nèi)連續(xù)應(yīng)用抗生素預(yù)防感染。術(shù)后12周用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3大鼠BMSCs的原代培養(yǎng)及成骨分化 將4周齡SD大鼠CO2麻醉后處死，用75%乙醇浸泡5 min。在無(wú)菌條件下取雙側(cè)股骨，剪除股骨近端骨骺，用5 mL注射器吸取DMEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，用1 mL注射器反復(fù)抽吸制成細(xì)胞懸液。細(xì)胞取出后，以5×106/cm2的密度接種于含12%胎牛血清及1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。原代細(xì)胞達(dá)到80%融合后傳代，P3代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(DMEM含12%胎牛血清，1%青鏈霉素，10 nmol/L地塞米松，10 mmol/L β-甘油磷酸和50 mg/L抗壞血酸)誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化。

1.4微型電腦斷層成像(micro-computed tomography，μCT)分析 取SD大鼠股骨，用4%多聚甲醛固定，4 ℃，24 h。應(yīng)用高分辨率μCT (SkyScan,1176)對(duì)股骨進(jìn)行掃描分析(65 kv,153 μA),分辨率9.0 μm/pixel。應(yīng)用重建軟件(NRecon,v1.6,SkyScan)、數(shù)據(jù)分析軟件(CTAn,v1.9,SkyScan)和三維模型可視化軟件(CTVol,v2.0,SkyScan)對(duì)掃描圖像進(jìn)行處理和分析。分析指標(biāo)包括骨小梁體積分?jǐn)?shù)(bone volume fraction,BV/TV)，骨小梁厚度(trabecular thichness,Tb.Th)和骨小梁分離度(trabecular separation,Tb.Sp)。

1.5免疫熒光分析 取SD大鼠股骨，用4%多聚甲醛固定，4 ℃，24 h；0.5 mol/L乙二胺四乙酸脫鈣3周，4 ℃，搖床；應(yīng)用8%明膠包埋，制作20 μm冰凍切片。將冰凍切片于37 ℃烘干，浸泡于PBS液15 min，5% BSA封閉1 h，一抗孵育(抗大鼠IRS-1，Abcam)，4 ℃，過(guò)夜；TBST清洗，熒光二抗孵育1 h，TBST清洗，DAPI封片。采用Image J軟件對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 課題組在前期實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)自行構(gòu)建IRS-1高表達(dá)質(zhì)粒(pCMV-IRS-1)[9]。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了分別用于敲除IRS-1和TAZ表達(dá)的質(zhì)粒，即嵌入敲除IRS-1表達(dá)的小干擾RNA(SiIRS-1)的質(zhì)粒，和嵌入敲除TAZ表達(dá)的小干擾RNA(SiTAZ)的質(zhì)粒(上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)有限公司)。應(yīng)用脂質(zhì)體3 000(Thermo)對(duì)BMSCs進(jìn)行轉(zhuǎn)染。細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。同時(shí)為上述實(shí)驗(yàn)設(shè)立對(duì)照，未進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組設(shè)置為“空白對(duì)照組”，轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒組作為“陰性對(duì)照組”。

1.7茜素紅染色 將細(xì)胞接種至35 mm塑料培養(yǎng)皿中，成骨誘導(dǎo)基培養(yǎng)14 d。PBS清洗2次，4%多聚甲醛室溫固定20 min。蒸餾水清洗3次后，0.1%茜素紅染色，37 ℃，30 min。蒸餾水清洗3次后，顯微鏡下拍照。然后，應(yīng)用10%氯化十六烷基吡啶對(duì)茜素紅進(jìn)行脫色，室溫，30 min。應(yīng)用酶標(biāo)儀(562 nm)讀取其吸光度值。

1.8蛋白免疫印跡(Western blot) 將細(xì)胞接種至60 mm塑料培養(yǎng)皿中，成骨誘導(dǎo)基培養(yǎng)3 d。利用RIPA裂解液提取蛋白。應(yīng)用12% SDS-PAGE膠對(duì)蛋白進(jìn)行電泳分離后，采用半干法將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%牛奶封閉，37 ℃，室溫。一抗孵育(抗TAZ，Cell Signaling；抗RUNX2，Boster；抗骨鈣蛋白(osteocalcin,OCN)，Boster；抗GAPDH，Bioworld)，4 ℃，過(guò)夜。二抗37 ℃孵育1 h。應(yīng)用image J軟件分析蛋白條帶灰度值，并計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1不同組別大鼠股骨μCT和IRS-1免疫熒光染色比較 采用μCT對(duì)大鼠股骨的松質(zhì)骨相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，3組間BV/TV值、Tb.Th值、Tb.Sp值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；OVX組BV/TV值、Tb.Th值低于對(duì)照組和假手術(shù)組，Tb.Sp值高于對(duì)照組和假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；對(duì)照組和假手術(shù)組BV/TV值、Tb.Th值、Tb.Sp值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。采用免疫熒光染色定量分析大鼠股骨IRS-1的表達(dá)量，結(jié)果顯示，3組間IRS-1+熒光強(qiáng)度百分比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；OVX組IRS-1+熒光強(qiáng)度百分比低于對(duì)照組和假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；對(duì)照組和假手術(shù)組IRS-1+熒光強(qiáng)度百分比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1，表1。

圖1 不同組別大鼠股骨μCT結(jié)果和IRS-1熒光染色的比較

表1 不同組別大鼠股骨μCT定量分析和IRS-1免疫熒光染色定量分析比較Table 1 The quantitative analysis of μCT results of rat femurs and IRS-1 immunofluorescence results in different groups

2.2IRS-1基因高表達(dá)對(duì)茜素紅染色結(jié)果和成骨分化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 BMSCs成骨誘導(dǎo)14 d后，對(duì)其進(jìn)行茜素紅染色，結(jié)果顯示，應(yīng)用pCMV-IRS-1轉(zhuǎn)染后，IRS-1組BMSCs的鈣結(jié)節(jié)明顯多于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(圖2A)。進(jìn)一步對(duì)茜素紅吸光度進(jìn)行定量分析后發(fā)現(xiàn)，3組間茜素紅吸光度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；IRS-1組茜素紅吸光度高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組茜素紅吸光度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。BMSCs成骨誘導(dǎo)3 d后，采用Western blot方法分析成骨分化相關(guān)蛋白TAZ、RUNX2、OCN的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，IRS-1組TAZ、RUNX2、OCN的表達(dá)量明顯高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(圖2B)。進(jìn)一步對(duì)蛋白條帶灰度值進(jìn)行定量分析后發(fā)現(xiàn)，3組間TAZ、RUNX2、OCN的表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；IRS-1組TAZ、RUNX2、OCN的表達(dá)量高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組TAZ、RUNX2、OCN的表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖2，表2。

圖2 IRS-1基因高表達(dá)對(duì)茜素紅染色結(jié)果和成骨分化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表2 IRS-1基因高表達(dá)對(duì)茜素紅染色和TAZ、RUNX2、OCN表達(dá)影響的定量分析 Table 2 The quantitative analysis of the effects of high expression of IRS-1 mRNA on alizarin red staining results and the expression of osteogenic differentiation related proteins

2.3IRS-1或TAZ基因敲除對(duì)茜素紅染色結(jié)果和成骨分化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 茜素紅染色結(jié)果提示， SiIRS-1組和SiTAZ組的鈣結(jié)節(jié)明顯少于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(圖3A)。進(jìn)一步對(duì)茜素紅吸光度進(jìn)行定量分析后發(fā)現(xiàn)，4組間茜素紅吸光度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；SiIRS-1組和SiTAZ組茜素紅吸光度低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組、SiIRS-1組和SiTAZ組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Western blot結(jié)果顯示，SiIRS-1組和SiTAZ組TAZ、RUNX2、OCN的蛋白表達(dá)量明顯低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(圖3B)。進(jìn)一步對(duì)蛋白條帶灰度值進(jìn)行定量分析后發(fā)現(xiàn)，4組間TAZ、RUNX2、OCN的表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；SiIRS-1組和SiTAZ組TAZ、RUNX2、OCN的表達(dá)量低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組、SiIRS-1組和SiTAZ組間TAZ、RUNX2、OCN的表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

圖3 IRS-1或TAZ基因敲除對(duì)茜素紅染色結(jié)果和成骨分化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表3 IRS-1或TAZ基因敲除對(duì)茜素紅染色和TAZ、RUNX2、OCN表達(dá)影響的定量分析Table 3 The quantitative analysis of the effects of IRS-1 or TAZ knockout on alizarin red staining results and the expression of osteogenic differentiation related proteins

3 討 論

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨形成受損、骨吸收增加為特征的骨代謝疾病，骨量降低、骨微結(jié)構(gòu)損害，骨折風(fēng)險(xiǎn)明顯增加。近來(lái)，學(xué)者發(fā)現(xiàn)基因修飾干細(xì)胞可促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化，改善骨細(xì)胞功能，在來(lái)源上增加骨形成[10]。同時(shí)，體外培養(yǎng)BMSCs在骨生理學(xué)研究領(lǐng)域廣為應(yīng)用，可作為干細(xì)胞基因修飾的種子細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示，IRS-1和TAZ之間存在相互作用，這種相互作用是調(diào)節(jié)BMSCs向成骨細(xì)胞定向分化的潛在機(jī)制，是聯(lián)絡(luò)糖尿病和骨質(zhì)疏松癥的關(guān)鍵因素，可作為基因修飾干細(xì)胞治療的新靶點(diǎn)。

IRS-1是胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的船塢蛋白，在胰島素受體結(jié)合SH2結(jié)構(gòu)蛋白中起錨定作用。同時(shí)，IRS-1本身含有21個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，可直接與SH2結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)合，進(jìn)而激活下游信號(hào)通路[11]。此外，IRS-1還包含絲氨酸/蘇氨酸殘基，可被絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶磷酸化，抑制胰島素受體酪氨酸蛋白激酶活性，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、分化等多種功能[12]。近來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)IRS-1在成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞中表達(dá)，而不在破骨細(xì)胞表達(dá)[13-14]。進(jìn)一步研究，IRS-1基因特異性敲低小鼠表現(xiàn)為成骨分化抑制，成骨細(xì)胞數(shù)量減少，導(dǎo)致骨形成率降低[15]?？梢?jiàn)，IRS-1不僅是胰島素抵抗的候選基因，在骨代謝中的作用也不容忽視。但是，目前關(guān)于IRS-1對(duì)細(xì)胞分化的作用尚存爭(zhēng)議。IRS-1是一種細(xì)胞分化抑制因子。Xi等[16]體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，敲低IRS-1減少p53/Kruppel樣因子4復(fù)合體形成，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖和分化。與此相反，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為IRS-1是一種細(xì)胞分化促進(jìn)因子[17]。這可能是因?yàn)?，不同?xì)胞類(lèi)型中，IRS-1對(duì)細(xì)胞分化的作用不盡相同。成肌細(xì)胞中研究發(fā)現(xiàn)，IRS-1是成肌細(xì)胞分化的必需因子，敲低IRS-1成肌細(xì)胞分化減少[18]。本研究部分結(jié)果表明，IRS-1是間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的必需因子，敲低IRS-1則TAZ表達(dá)下調(diào)，成骨分化抑制；過(guò)表達(dá)IRS-1則TAZ表達(dá)上調(diào)，成骨分化加強(qiáng)。

另一方面，本研究還發(fā)現(xiàn)了IRS-1和TAZ之間的密切聯(lián)系。TAZ是調(diào)節(jié)BMSCs成骨-成脂分化平衡的關(guān)鍵因子。最初，TAZ作為14-3-3結(jié)合蛋白被發(fā)現(xiàn)，其89位絲氨酸位點(diǎn)磷酸化后可以與14-3-3結(jié)合，進(jìn)而阻滯于細(xì)胞質(zhì)[19]。TAZ在哺乳動(dòng)物廣泛表達(dá)，與Yes相關(guān)蛋白(Yes-associated protein,YAP)有約50%同源性，且在拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)上十分相似[20]。TAZ和YAP一樣具有轉(zhuǎn)錄激活功能，最先發(fā)現(xiàn)TAZ可分別與成骨分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子RUNX2及成脂分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PPARγ結(jié)合，激活RUNX2轉(zhuǎn)錄，抑制PPARγ轉(zhuǎn)錄活性，從而促進(jìn)成骨分化而抑制成脂分化，即調(diào)節(jié)干細(xì)胞定向分化[21]。本研究首次發(fā)現(xiàn)了IRS-1和TAZ之間的相互作用，這種相互作用可能是IRS-1促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化的潛在機(jī)制。

綜上所述，IRS-1可通過(guò)上調(diào)TAZ表達(dá)，促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化。IRS-1/TAZ可能作為基因修飾干細(xì)胞治療糖尿病骨質(zhì)疏松癥的新靶點(diǎn)。