張雪梅，黃靈泉

廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院病理科，廣西 柳州 545005

宮頸液基細(xì)胞學(xué)檢查是目前宮頸病變篩查最常用的方法[1]，其中未能明確意義的非典型鱗狀細(xì)胞(ASC-US)是最常見(jiàn)的細(xì)胞學(xué)診斷，也是宮頸細(xì)胞學(xué)診斷的難點(diǎn)[2-3]。細(xì)胞包埋術(shù)的出現(xiàn)大大緩解了細(xì)胞學(xué)診斷的壓力，提高了細(xì)胞病理診斷的準(zhǔn)確性[4]。尤其是胸腹水細(xì)胞蠟塊的制作，為胸腹水細(xì)胞病理診斷及后續(xù)相關(guān)免疫組織化學(xué)及分子病理檢測(cè)提供了機(jī)會(huì)，并且制作技術(shù)成熟，已廣泛用于臨床病理診斷。目前對(duì)于宮頸細(xì)胞蠟塊的制作報(bào)道較少，不同方法制片質(zhì)量存在一定差異。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)對(duì)不同的宮頸細(xì)胞蠟塊制作方法進(jìn)行對(duì)比研究，探討不同方法對(duì)制片質(zhì)量的影響，以探索宮頸細(xì)胞蠟塊制作較為理想的方法，為宮頸細(xì)胞病理診斷提供幫助。

1 資料與方法

1.1 病例資料 收集廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院病理科2017年10月至2018年6月經(jīng)宮頸液基細(xì)胞學(xué)檢測(cè)的剩余標(biāo)本45例，其中細(xì)胞學(xué)診斷陽(yáng)性、陰性、可疑陽(yáng)性各15 例。每種方法均選取陽(yáng)性、陰性、可疑陽(yáng)性標(biāo)本各5例。

1.2 主要試劑 95%酒精、瓊脂、細(xì)胞蠟塊制備試劑盒(安必平)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 方法1 采用直接取細(xì)胞沉渣法。將宮頸液基細(xì)胞保存瓶中的剩余標(biāo)本倒入離心管內(nèi)，2 000 r/min離心5 min，棄上清液，往離心管內(nèi)加入8 mL 95%酒精，2 000 r/min離心10 min，靜置4 h后倒去酒精，沉渣聚集成團(tuán)，將沉渣物取出直接放至包埋紙內(nèi)包好，按常規(guī)石蠟包埋制備蠟塊。

1.3.2 方法2 采用瓊脂包裹法。(1)將宮頸液基細(xì)胞保存瓶中的剩余標(biāo)本倒入離心管內(nèi)，2 500 r/min離心5 min，用吸管吸去大部分液體，保留高于沉渣1～2 cm的液體；(2)用10 mL吸管吸取60℃3%瓊脂一滴，滴于胃鏡小標(biāo)本包埋盒的小槽內(nèi)，使其鋪滿包埋盒底部，并放至冰箱冷凍2 min 使瓊脂凝固成形；(3)用吸管反復(fù)抽吸將離心管內(nèi)的沉渣與液體混勻，置于鋪滿瓊脂的包埋盒槽內(nèi)，放置恒溫箱至細(xì)胞沉渣平面由凸面轉(zhuǎn)變?yōu)榘济妫?4)在包埋盒內(nèi)再次加入瓊脂，直至覆蓋沉渣表面，將包埋盒置于冰箱冷凍5 min；(5)取出包埋盒內(nèi)的瓊脂以及細(xì)胞沉淀物，用包埋紙包好，按常規(guī)石蠟包埋制備蠟塊。

1.3.3 方法3 采用試劑盒制備法。(1)將宮頸液基細(xì)胞保存瓶中的剩余標(biāo)本倒入離心管內(nèi)，800 r/min離心5 min，去上清液；(2)滴入1～3滴細(xì)胞蠟塊制備試劑盒試劑A，震蕩，使細(xì)胞與試劑A充分混合，800 r/min離心2 min，棄去多余上清液；(3)滴入2～3滴試劑B，靜置30 s，輕輕搖晃試管，使細(xì)胞團(tuán)與離心管底部分離，用軟吸管將細(xì)胞團(tuán)吸起，轉(zhuǎn)移到包埋紙上，輕壓細(xì)胞團(tuán)，使細(xì)胞團(tuán)變得扁平，包埋紙包好后后放入包埋盒中，按常規(guī)石蠟包埋制備蠟塊。三種細(xì)胞蠟塊制備完成后均進(jìn)行常規(guī)切片，HE染色，由兩位高年資病理診斷醫(yī)師共同閱片。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞蠟塊及切片制作效果

2.1.1 肉眼觀察 將宮頸液基細(xì)胞學(xué)檢測(cè)后的剩余標(biāo)本離心，使細(xì)胞沉渣沉積于離心管底部，沉渣量基本相同(圖1A)。利用上述三種方法分別收集細(xì)胞沉渣，其中方法1取得的細(xì)胞沉渣量相對(duì)較少，部分呈渾濁半固體狀，較分散，離心管底部仍有少量細(xì)胞沉渣不易取出；方法2取得的細(xì)胞沉渣基本都平鋪于瓊脂中央，較集中；方法3取得的細(xì)胞沉渣呈白色塊狀，聚集較緊密(圖1B)。三種方法收集的細(xì)胞沉渣經(jīng)脫水包埋切片染色，其中方法1所得HE切片肉眼觀細(xì)胞沉渣較集中，細(xì)胞量相對(duì)較少；方法2所得細(xì)胞沉渣在切片上較均勻地平鋪分布，切面較大，可觀察的細(xì)胞較多；方法3 所得HE 切片細(xì)胞沉渣較集中，細(xì)胞量相對(duì)較多(圖1C)。

2.1.2 顯微鏡下觀察 方法1制備的細(xì)胞蠟塊切片染色后細(xì)胞較集中，呈片狀聚集或堆疊，細(xì)胞之間不易分散，有時(shí)會(huì)影響觀察；方法2制備的細(xì)胞蠟塊切片染色后細(xì)胞均勻平鋪，可觀察面較大，仍有部分細(xì)胞間分散不徹底，呈片狀，細(xì)胞之間可見(jiàn)少量淡藍(lán)色瓊脂無(wú)定型物；方法3 制備的細(xì)胞蠟塊切片染色后細(xì)胞較集中，細(xì)胞之間易分散，較均勻平鋪，背景干凈(圖2)。

圖1 細(xì)胞蠟塊及切片肉眼觀察

圖2 三種細(xì)胞蠟塊制備法HE切片顯微鏡下形態(tài)

2.2 操作過(guò)程及時(shí)間 方法1操作步驟簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)過(guò)程需要4～5 h；方法2 操作步驟較繁瑣，且需要提前配置3%瓊脂，操作時(shí)長(zhǎng)約0.5 h；方法3 操作簡(jiǎn)單，用時(shí)約10余min。

3 討論

宮頸液基細(xì)胞學(xué)是目前宮頸病變篩查最主要的檢測(cè)方法，陽(yáng)性或可疑陽(yáng)性的病例會(huì)分流至宮頸活檢以及后續(xù)的免疫組化檢查。然而，宮頸活檢取材局限，對(duì)于病變較少的病例容易造成漏診。細(xì)胞蠟塊制備技術(shù)是對(duì)薄層液基細(xì)胞學(xué)有力的補(bǔ)充，將宮頸液基細(xì)胞學(xué)檢測(cè)剩余的標(biāo)本經(jīng)離心固定，制作成細(xì)胞蠟塊，可以連續(xù)切片并永久保存，彌補(bǔ)了細(xì)胞學(xué)標(biāo)本利用不充分以及活檢取材局限的缺點(diǎn)[5]。較多學(xué)者對(duì)細(xì)胞蠟塊聯(lián)合免疫組化檢測(cè)及分子病理檢查進(jìn)行了研究，提示聯(lián)合檢查可以提高宮頸細(xì)胞學(xué)診斷的準(zhǔn)確率[6-9]。

然而，宮頸液基細(xì)胞學(xué)檢查因其刷取的特點(diǎn)，相對(duì)其他脫落細(xì)胞標(biāo)本細(xì)胞數(shù)量較少，因此對(duì)于有限的標(biāo)本量，提高其利用率是宮頸細(xì)胞蠟塊制備的關(guān)鍵。本研究采取三種不同方法對(duì)細(xì)胞沉渣進(jìn)行收集，擬探討一種較好的宮頸細(xì)胞蠟塊制備方法，將其便捷有效地用于宮頸細(xì)胞學(xué)的診斷中。

直接取細(xì)胞沉渣法是較為簡(jiǎn)單的一種方法，主要步驟為離心和固定，其中固定對(duì)于細(xì)胞沉渣的轉(zhuǎn)移及取出尤為重要。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示固定時(shí)間過(guò)短，則細(xì)胞不易聚集，呈渾濁半固態(tài)，仍有部分細(xì)胞沉渣貼附于試管壁，不易取出，這樣制成的細(xì)胞蠟塊，往往細(xì)胞量較少，沉渣利用不充分，與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)論一致[10]。結(jié)果提示，95%酒精固定4 h 能夠較好地使細(xì)胞聚集成形，便于轉(zhuǎn)移細(xì)胞沉渣以及后續(xù)的細(xì)胞塊包埋。其優(yōu)點(diǎn)：方法簡(jiǎn)單易行，成本較低；其缺點(diǎn)：制備時(shí)間最長(zhǎng)，整體流程大于4 h；靜置4 h后細(xì)胞雖能聚集呈團(tuán)，但因沉渣位于離心管底部，在吸取沉渣時(shí)常導(dǎo)致沉渣碎落，吸管及離心管附著較多細(xì)胞，脫水后包埋紙中仍貼附有部分細(xì)胞，導(dǎo)致標(biāo)本的收集效果不理想，標(biāo)本利用率降低。制片后細(xì)胞之間不易分散，容易成片聚集，細(xì)胞堆疊嚴(yán)重，影響觀察。

瓊脂包裹法是文獻(xiàn)報(bào)道中使用較多的方法，該方法采用小號(hào)胃鏡標(biāo)本包埋框進(jìn)行細(xì)胞收集，這樣易使細(xì)胞集中，在包埋框底部加一層瓊脂，使細(xì)胞沉渣得到一定的支撐和依托，細(xì)胞與瓊脂融合后再次加入瓊脂，以瓊脂為依托，包裹細(xì)胞沉渣便于沉渣的取出。本研究發(fā)現(xiàn)，采用文獻(xiàn)報(bào)道[11]中的溫箱凝固瓊脂法，細(xì)胞沉渣容易受固定液揮發(fā)時(shí)間及瓊脂凝固時(shí)間的影響而沉積于瓊脂中深淺不一，致使細(xì)胞在切片時(shí)難以處于同一平面；同時(shí)實(shí)驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)。本研究在顧維娜等研究的基礎(chǔ)上，采用冰箱冷凍法對(duì)瓊脂進(jìn)行凝固，相比較文獻(xiàn)中置入溫箱凝固瓊脂的方法，冰箱冷凍凝固能夠使瓊脂快速成型，使細(xì)胞沉渣平鋪于同一層面，同時(shí)縮短了瓊脂凝固時(shí)間。瓊脂包裹法的優(yōu)點(diǎn)：瓊脂作為細(xì)胞沉渣的支撐物并將細(xì)胞包裹于內(nèi)，使得細(xì)胞得到較大程度的利用，制片后細(xì)胞均勻平鋪，可觀察面大；缺點(diǎn)：鏡下背景中可見(jiàn)淡藍(lán)色瓊脂無(wú)定型物存在，有時(shí)影響觀察，該方法制備時(shí)間較長(zhǎng)，從離心管中吸取細(xì)胞時(shí)也有部分細(xì)胞殘留于吸管內(nèi)，同時(shí)，每次操作均需溶解瓊脂，配置的3%瓊脂亦不能長(zhǎng)期保存，操作步驟繁瑣。

試劑盒制備法采用試劑盒AB 試劑，其中試劑A是一種特殊的分散體系，在試劑B的催化作用下其中的膠體顆粒會(huì)相互連接，搭成架子，形成空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使液體和細(xì)胞充滿在結(jié)構(gòu)空隙中，將細(xì)胞緊密地網(wǎng)在其中，讓細(xì)胞成團(tuán)且不破壞結(jié)構(gòu)。該方法在離心試管內(nèi)加入AB液，使細(xì)胞形成團(tuán)塊，避免了轉(zhuǎn)移時(shí)離心管及吸管內(nèi)的細(xì)胞殘留問(wèn)題，細(xì)胞損失少，且細(xì)胞團(tuán)呈果凍狀，易與管壁分離，從而提高標(biāo)本利用率。其優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，用時(shí)最短，收集效果最好，缺點(diǎn)：該試劑價(jià)格相對(duì)昂貴，標(biāo)本量大時(shí)需要的試劑較多，因此該方法更適用于量少且難收集的標(biāo)本。

綜上所述，直接取細(xì)胞沉渣法操作簡(jiǎn)單，成本低，易于推廣，但標(biāo)本利用率不高，制備時(shí)間長(zhǎng)；瓊脂包裹法制片效果良好，但操作步驟繁瑣；試劑盒制備法操作簡(jiǎn)單，用時(shí)短，標(biāo)本利用率高，但其成本較高。前兩種方法適合基層醫(yī)院推廣，其中瓊脂包裹法更勝一籌。對(duì)于經(jīng)濟(jì)條件較好的地區(qū)，推薦使用試劑盒制備法，大大節(jié)約時(shí)間和人力，制片效果好。