杜 剛

(陜西國(guó)防工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院，陜西 西安 710302)

手性藥物具有獨(dú)特的藥理作用和巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，正在被全世界的藥物學(xué)家所關(guān)注?，F(xiàn)階段手性藥物的獲得依然是個(gè)技術(shù)難題，通常認(rèn)為手性中間體是合成手性藥物的前提和基礎(chǔ)。1-苯乙醇及其衍生物就是一類重要的手性中間體，如S-(-)-苯乙醇可用于合成抗抑郁藥物曲舍林，R-(+)-苯乙醇則可用于合成抑制膽固醇吸收的藥物[1]，如2′-氯苯乙醇是L-氯丙那林的重要中間體[2]。但是由于技術(shù)上的原因，當(dāng)前還無(wú)法對(duì)每一種手性醇中間體實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。1-苯乙醇及其衍生物的合成方法主要有化學(xué)法和生物法。與化學(xué)法相比，生物法具有選擇性高、反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)物光學(xué)純度高等優(yōu)點(diǎn)，是國(guó)內(nèi)外合成手性中間體的主要方法[3-4]，可分為整細(xì)胞催化法、酶催化法等。關(guān)于1-苯乙醇及其衍生物的合成是目前國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。研究較多的是生物不對(duì)稱還原潛手性酮，生物催化拆分外消旋混合物也受到極大的關(guān)注，手性催化劑的選擇、反應(yīng)體系以及反應(yīng)條件的優(yōu)化等都是該領(lǐng)域的研究重點(diǎn)?；诖?，作者從生物催化劑的選擇、整細(xì)胞催化、酶催化等三方面對(duì)1-苯乙醇及其衍生物的生物催化合成研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，為手性藥物的合成提供幫助。

1 生物催化劑的選擇

與化學(xué)催化一樣，催化劑的選擇對(duì)生物催化有著重大影響。生物催化劑決定著手性醇的收率及光學(xué)純度的高低，一般通過(guò)生物方法從自然界中篩選出高效的生物催化劑。目前，可用于生物催化合成1-苯乙醇及其衍生物的生物催化劑有很多，如藍(lán)藻、酵母、真菌、植物細(xì)胞以及酶等。劉慧等[5]利用96微孔板對(duì)300株常用菌株進(jìn)行催化活性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)真菌R.mucilageinosaGIM 2.157對(duì)鄰-、間-、對(duì)-溴苯乙酮均具有較高的催化活性，可得到S-構(gòu)型手性醇產(chǎn)物，收率達(dá)到99%,ee值也達(dá)到99%。Perna等[6]從不同菌株中篩選到L.reuteriDSM 20016，此菌株可整細(xì)胞催化苯乙酮合成(R)-1-苯乙醇，在較短時(shí)間內(nèi)即可完成轉(zhuǎn)化，ee值高達(dá)99%。何軍邀等[7]從土壤中分離得到一株具有很強(qiáng)羰基還原能力的菌株厄斯考維菌(Oerskoviaturbata)ZJPH 1604，可不對(duì)稱催化3-氯苯乙酮合成(R)-1-(3-氯苯基)乙醇，ee值超過(guò)99.9%。Mandal等[8]以苯乙酮為底物對(duì)真菌的催化活性進(jìn)行測(cè)定(表1)，發(fā)現(xiàn)生物催化劑對(duì)手性產(chǎn)物起著決定性的作用，不僅決定其收率，而且決定其構(gòu)型。

表1 用于催化還原苯乙酮的真菌催化劑的篩選

在生物催化羰基酮的過(guò)程中，產(chǎn)物大多遵守Prelog原則[9](圖1)。當(dāng)小的取代基被大的取代基取代時(shí)，或者取代基的位置不同時(shí)，產(chǎn)物空間構(gòu)型就有可能發(fā)生轉(zhuǎn)變，出現(xiàn)反-Prelog原則，因此通過(guò)調(diào)整底物分子取代基，可以得到不同構(gòu)型的手性產(chǎn)物。

圖1 Prelog原則示意圖Fig.1 Schematic of Prelog rule

2 整細(xì)胞催化

整細(xì)胞催化的反應(yīng)條件溫和、操作簡(jiǎn)單、催化劑廉價(jià)易得，反應(yīng)時(shí)無(wú)需添加輔酶，大大降低了成本。裴朝紅等[10]以從土壤中篩選到的紅球菌屬菌株Rhodococcussp.為催化劑，將α-羥基苯乙酮不對(duì)稱還原成(R)-苯乙二醇，菌體轉(zhuǎn)化α-羥基苯乙酮的最優(yōu)濃度為3.0 g·L-1，轉(zhuǎn)化率高達(dá)96.2%，ee值為99.3%。曹綱等[11]在30 ℃條件下，通過(guò)乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactics)整細(xì)胞催化苯乙酮，24 h得到(R)-1-苯乙醇，收率為95%，ee值達(dá)到99.5%以上。

利用基因突變或重組技術(shù)，整細(xì)胞催化往往可以獲得更好的效果。李鳴等[12]以羰基還原酶基因SCRⅡ-A220D和葡萄糖脫氫酶基因gdh共表達(dá)的重組菌株E.coliBL21/pET-SCRⅡ-A220D-SD-AS-gdh為生物催化劑，催化潛手性酮得到(R)-4-甲氧基-1-苯乙醇，收率達(dá)到82%，ee值為98%。

Wei等[13]利用含有羰基還原酶突變體(mut-accr)的BL21(DE3)(pETDuet-gst-mut-accr-gdh)整細(xì)胞催化2-羥基苯乙酮轉(zhuǎn)化為(S)-2-苯乙二醇，該生物催化劑的催化活性是原AcCR重組細(xì)胞的15.9倍，在最佳條件下，收率為95.2%，ee值達(dá)到99%以上。除了利用菌體整細(xì)胞進(jìn)行催化外，Baldassarre等[14]以胡蘿卜根為催化劑，50 h得到ee值大于95%的手性醇；柴文等[15]用胡蘿卜根部細(xì)胞組織生物催化6種苯乙酮衍生物的不對(duì)稱還原反應(yīng)(圖2)，均在72 h內(nèi)得到S-構(gòu)型手性醇，還原產(chǎn)物具有良好的化學(xué)純度(60%～70%)，ee值可達(dá)92%以上。

圖2 苯乙酮衍生物的不對(duì)稱催化還原反應(yīng)Fig.2 Asymmetric catalytic reduction reaction of acetophenone derivatives

在整細(xì)胞催化過(guò)程中，底物與產(chǎn)物會(huì)抑制菌體細(xì)胞的生長(zhǎng)、降低其催化活性。在水相體系中引入有機(jī)相形成兩相體系是提高收率與選擇性的較好策略。有機(jī)相的引入可以增加非極性底物的濃度，同時(shí)底物和產(chǎn)物主要存在于有機(jī)相，減少了對(duì)存在于水相中的菌體細(xì)胞的影響，提高了底物轉(zhuǎn)化率和選擇性。有機(jī)相的引入要考慮生物相容性，溶劑的logP越小，其對(duì)菌體細(xì)胞的毒性就越大。Cho等[16]發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯、環(huán)己酮、鄰苯二甲酸二辛酯等對(duì)重組大腸桿菌細(xì)胞具有較高的生物相容性，logP在4.50左右較為合適(表2)；歐志敏等[17]研究了溶劑對(duì)熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)CGMC 15016細(xì)胞催化活性的影響，發(fā)現(xiàn)菌體細(xì)胞在logP為2～4的有機(jī)溶劑中具有中等的代謝活力，而在logP>4的有機(jī)溶劑中代謝活力能達(dá)到更高。

3 酶催化

酶催化反應(yīng)效率高、條件溫和、容易控制、操作穩(wěn)定性好、受底物濃度影響小，滿足工業(yè)化生產(chǎn)要求。用于酶催化反應(yīng)合成手性醇的酶有水解酶和氧化還原酶。

表2 苯乙酮的分配系數(shù)及有機(jī)溶劑對(duì)重組大腸桿菌細(xì)胞的生物相容性

水解酶中最常用的是酯酶、脂肪酶、裂解酶等，具有高度的選擇性和專一性、不良反應(yīng)少、價(jià)格低廉、在使用中無(wú)需添加輔助因子等特點(diǎn)，已成為研究熱點(diǎn)。秦燕等[18]以異丙醚為反應(yīng)介質(zhì)、乙酸乙烯酯為?；w，利用脂肪酶YCJ01催化拆分對(duì)位取代1-苯乙醇衍生物，底物轉(zhuǎn)化率可達(dá)49.96%，ee值達(dá)到97%以上?？蝶惙宓萚19]在有機(jī)相中用固定化豬胰脂肪酶(PPL)催化1-苯乙醇轉(zhuǎn)酯化拆分反應(yīng)，在反應(yīng)溫度為45 ℃、反應(yīng)時(shí)間為13 h的條件下，ee值可達(dá)99.3%。Yan等[4]用表面活性劑對(duì)米曲霉脂肪酶進(jìn)行改性后，將其用于(RS)-1-苯乙醇與醋酸乙烯酯交換反應(yīng)，轉(zhuǎn)化率為46.8%，(R)-1-苯乙酸乙酯ee值大于99%。

氧化還原酶雖然在反應(yīng)時(shí)需要加入輔酶，但是可以在羰基上引入活性基團(tuán)，具有不可比擬的優(yōu)勢(shì)，被認(rèn)為是最有價(jià)值的一類酶催化劑。陳敏等[20]構(gòu)建了LcSDR和EsGDH雙酶耦聯(lián)體系，將其用于催化不對(duì)稱還原苯乙酮合成(R)-苯乙醇，2 h收率達(dá)到93.8%，ee值不低于99%。楊猛等[21]以Corynebacteriumsp.的酮還原酶KRED30和Bacillussubtilis的D-葡萄糖脫氫酶GDH1構(gòu)建的雙酶復(fù)合交聯(lián)酶聚集體為催化劑，催化還原3-氯苯乙酮，手性醇收率為100%，ee值>98%。Chen等[22]以源于Lactobacilluskefir的變異醇脫氫酶(A94T/F147L/L199H/A202L)結(jié)合葡萄糖脫氫酶(GDH)為催化劑，將2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙酮轉(zhuǎn)化為(S)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇，35 ℃下反應(yīng)6 h的轉(zhuǎn)化率約為100%，ee值為99.5%。劉麗勤等[23]構(gòu)建了重組大腸桿菌E.coliBL21-ADH和E.coliBL21-GDH，將乙醇脫氫酶與葡萄糖脫氫酶偶聯(lián)不對(duì)稱還原2,6-二氯-3-氟苯乙酮，得到抗癌藥物克唑替尼的手性中間體(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇(圖3)，轉(zhuǎn)化率為93.75%，ee值達(dá)到99%。

圖3 酶催化合成(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇Fig.3 Enzyme catalytic synthesis of (S)-1-(2,6-dichloro-3-fluorophenyl)ethanol

4 結(jié)語(yǔ)

與化學(xué)法相比，生物催化合成1-苯乙醇及其衍生物具有反應(yīng)條件溫和、光學(xué)收率高等特點(diǎn)，但是也存在一些問(wèn)題：在整細(xì)胞催化中，由于生物催化劑會(huì)受到細(xì)胞耐受性的影響，通常反應(yīng)底物濃度較低，若底物濃度過(guò)高則產(chǎn)物收率可能會(huì)下降；酶催化雖然被認(rèn)為是最有可能實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的途徑之一，但在酶的提取、保存、固定化等關(guān)鍵技術(shù)上還應(yīng)有所突破。相信，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，生物催化合成1-苯乙醇及其衍生物會(huì)得到越來(lái)越多的重視與研究。