劉沖英，蒲定濤，任佳妮，李 瑾，張麗華，趙 鵬

(陜西中醫(yī)藥大學藥學院 陜西省中藥基礎與新藥研究重點實驗室，陜西 西安 712046)

中藥地黃是玄參科植物地黃(RehmanniaglutinosaLibosch.)的根，根據(jù)其入藥形式可將其分為鮮地黃、生地黃、熟地黃、地黃炭等。地黃最早記載于《神農本草經(jīng)》中，具有滋陰、補血、降血糖等功效，被列為補益類中藥的上品[1]。研究發(fā)現(xiàn)，多糖是地黃的重要活性成分之一，具有增強免疫功能、抗腫瘤及促進造血功能等多種生物活性[2-8]，還具有抗脂質過氧化作用[9]，能夠抑制過氧化氫引起的細胞損傷[10]，用途十分廣泛。

在提取地黃多糖的過程中，地黃含有的色素同時被提取出來，使得地黃多糖呈棕黃色，這既影響了地黃多糖的純度，還給地黃多糖的純化、分析及質量控制帶來了很大困難，極大地影響了其活性，因此，脫色是提高地黃多糖產品品質的關鍵工藝。目前，常用于多糖脫色的方法有：雙氧水法[11]、大孔吸附樹脂法和活性炭法[12-15]，相比較而言，雙氧水法具有條件溫和、操作簡便、脫色率高等優(yōu)點，因而被廣泛應用于多糖的脫色處理[16]。目前，對地黃多糖的研究主要集中在河南、湖北等道地產區(qū)所產地黃多糖，而對于陜產地黃多糖的研究還未見報道，對地黃多糖的抗氧化活性研究也鮮有報道。基于此，作者在單因素實驗的基礎上，采用響應面法對陜產地黃多糖雙氧水法脫色工藝進行優(yōu)化，并對純化后的地黃多糖抗氧化活性進行評價，以期為深度開發(fā)陜產地黃提供幫助。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

地黃粗多糖(已脫除蛋白)，自制。

2,2-聯(lián)苯基-1-苦肼基(DPPH)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；30%雙氧水、氨水、鹽酸羥胺、濃硫酸、鄰苯三酚、苯酚、鄰二氮菲等均為分析純，天津科密歐化學試劑有限公司。

HHS型恒溫水浴鍋，鞏義予華儀器廠；UV1102型紫外可見分光光度儀，上海天美科學儀器有限公司；FA2004型電子天平，上海民橋精科天平廠。

1.2 脫色實驗

配制15 mg·mL-1的地黃粗多糖溶液50 mL，按一定體積比(雙氧水與地黃粗多糖體積比)加入30%雙氧水，調節(jié)pH值后，置于一定溫度的水浴中，攪拌下保溫一段時間，于3 000 r·min-1離心10 min，上清液濃縮后醇沉、過濾，濾餅烘干，即得脫色的地黃多糖。

以地黃多糖脫色率和多糖保留率為評價指標，通過單因素實驗研究雙氧水與地黃粗多糖體積比、脫色溫度、pH值、脫色時間對地黃多糖脫色效果的影響，再通過響應面法優(yōu)化脫色工藝。

1.3 抗氧化實驗

1.3.1 清除羥基自由基的能力

參照文獻[17]的實驗方法略加調整后進行。先配制濃度(mg·mL-1)分別為0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、2.00、2.50、3.00 等8個樣品溶液；分別取1.0 mL，依次加入1.5 mL 7.5 mol·L-1硫酸亞鐵溶液、3.0 mL 8.0 mmol·L-1水楊酸-乙醇溶液和3.0 mL 7.5 mmol·L-1雙氧水溶液，混勻，在37 ℃下反應45 min，測定溶液在510 nm 處吸光度；以VC為陽性對照。按式(1)計算羥基自由基清除率(%)：

(1)

式中：A0為不加樣品的空白對照的吸光度；Ai為加入樣品后的吸光度。

1.3.2 清除超氧陰離子自由基的能力

參照文獻[17]的實驗方法略加調整后進行。按1.3.1配制樣品溶液；分別取0.2 mL，加入3.0 mL pH值為8.2的0.05 mmol·L-1Tris-HCl 緩沖液，混勻，在25 ℃下反應10 min；再加入12 μL 30 mmol·L-1鄰苯三酚溶液，反應4 min，測定溶液在320 nm 處吸光度；以VC為陽性對照。按式(2)計算超氧陰離子自由基清除率(%)：

(2)

式中：A0為不加樣品的空白對照的吸光度；Ai為加入樣品后的吸光度；Ab為Tris-HCl 緩沖液的吸光度。

1.3.3 清除DPPH自由基的能力

參照文獻[17]的實驗方法略加調整后進行。按1.3.1配制樣品溶液；分別取70 μL，加入180 μL 0.04 mg·mL-1的DPPH自由基乙醇溶液，混勻，在27 ℃下暗處反應5 min，測定溶液在517 nm處吸光度；以不加樣品的DPPH自由基溶液為空白，以VC為陽性對照。按式(3)計算DPPH自由基清除率(%)：

(3)

式中：A0為不加樣品的空白對照的吸光度；Ai為加入樣品后的吸光度。

1.4 計算方法

1.4.1 脫色率的計算

配制1 mg·mL-1的地黃多糖水溶液，在波長200～600 nm范圍內對地黃多糖水溶液進行紫外可見光全波段掃描。結果發(fā)現(xiàn)，在該波段范圍內，地黃多糖無明顯的最大吸收。由于多糖溶液呈深棕色，從溶液的互補色考慮，確定450 nm為檢測波長[18]。按式(4)計算脫色率(Y1，%)：

(4)

式中：A前、A后分別為地黃多糖脫色前后的吸光度。

1.4.2 多糖保留率的計算

采用苯酚-硫酸法[19]測定地黃多糖的含量，按式(5)計算多糖保留率(Y2，%)：

(5)

式中：M前、M后分別為脫色前后的地黃多糖含量。

1.4.3 綜合評分的計算

以脫色率(Y1)和多糖保留率(Y2)為評價指標，根據(jù)綜合評判公式(6)計算綜合評分(OD值)：

OD值=MY1+NY2

(6)

式中：M、N分別為Y1和Y2的權重系數(shù)，M=N=0.5[20]。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 雙氧水與地黃粗多糖體積比對脫色效果的影響

在地黃粗多糖溶液pH值為7.0、脫色溫度為40 ℃、脫色時間為90 min的條件下，按不同體積比加入30%雙氧水進行脫色實驗，考察雙氧水與地黃粗多糖體積比對地黃多糖脫色效果的影響，結果如圖1所示。

圖1 雙氧水與地黃粗多糖體積比對脫色效果的影響Fig.1 Effect of volume ratio of hydrogen peroxide to crude polysaccharides on decolorization efficiency

由圖1可知，當雙氧水與地黃粗多糖體積比小于2.0∶1時，隨著雙氧水用量的增加，地黃多糖脫色率快速升高；當雙氧水與地黃多糖體積比超過2.0∶1后，脫色率基本穩(wěn)定。在整個脫色過程中，多糖保留率變化不大。因此，確定適宜的雙氧水與地黃粗多糖體積比為2.0∶1。

2.1.2 脫色溫度對脫色效果的影響

在雙氧水與地黃粗多糖體積比為2.0∶1、pH值為7.0、脫色時間為90 min的條件下，在不同溫度下進行脫色實驗，考察脫色溫度對地黃多糖脫色效果的影響，結果如圖2所示。

圖2 脫色溫度對脫色效果的影響Fig.2 Effect of decolorization temperature on decolorization efficiency

由圖2可知，隨著脫色溫度的升高，地黃多糖脫色率快速升高，當脫色溫度達到45 ℃時，脫色率達到最高；繼續(xù)升高脫色溫度，脫色率反而明顯下降。這說明溫度的升高有助于提高雙氧水的活性，脫色率相應升高；但當溫度過高時，雙氧水會發(fā)生分解，從而降低了脫色能力。同時，隨著脫色溫度的升高，多糖保留率呈下降趨勢。綜合考慮，確定適宜的脫色溫度為45 ℃。

2.1.3 pH值對脫色效果的影響

在雙氧水與地黃粗多糖體積比為2.0∶1、脫色溫度為45 ℃、脫色時間為90 min的條件下，在不同pH值下進行脫色實驗，考察pH值對地黃多糖脫色效果的影響，結果如圖3所示。

圖3 pH值對脫色效果的影響Fig.3 Effect of pH value on decolorization efficiency

由圖3可知，當pH值低于8.0時，隨著pH值的增大，地黃多糖脫色率快速升高；當pH值達到8.0后，脫色率又隨著pH值的增大逐漸下降。這說明在弱堿性條件下，地黃多糖的脫色效果較好。同時，多糖保留率在酸性條件下較低，隨著pH值的增大，多糖保留率逐漸升高，在pH值為7.0時達到最高；隨著pH值的繼續(xù)增大，多糖保留率呈下降趨勢。綜合考慮，確定適宜的pH值為8.0。

2.1.4 脫色時間對脫色效果的影響

在雙氧水與地黃粗多糖體積比為2.0∶1、脫色溫度為45 ℃、pH值為8.0的條件下，考察脫色時間對地黃多糖脫色效果的影響，結果如圖4所示。

圖4 脫色時間對脫色效果的影響Fig.4 Effect of decolorization time on decolorization efficiency

由圖4可知，隨著脫色時間的延長，地黃多糖脫色率逐漸升高；在脫色時間達到120 min時，脫色率達到最高；繼續(xù)延長脫色時間，脫色率反而緩慢下降。同時，隨著脫色時間的延長，多糖保留率一直呈下降趨勢。綜合考慮，確定適宜的脫色時間為120 min。

2.2 響應面實驗結果

2.2.1 結果分析

根據(jù)單因素實驗結果，雙氧水與地黃粗多糖體積比、脫色溫度、pH值和脫色時間這4個因素對地黃多糖脫色效果的影響均比較大，但由于雙氧水與地黃粗多糖體積比在達到2.0∶1時對脫色效果影響不大，無須對其再進行優(yōu)化。因此，根據(jù)Box-Behnken中心組合設計原理，選擇脫色溫度(X1)、pH值(X2)、脫色時間(X3)為自變量，以脫色率(Y1)和多糖保留率(Y2)的綜合評分(OD值)為響應值，通過響應面優(yōu)化軟件，對地黃多糖脫色工藝進行優(yōu)化。響應面實驗的因素與水平見表1，方案設計與結果見表2。

表1 因素與水平

運用Design-Expert v7.1.3軟件，對表2數(shù)據(jù)進行回歸擬合分析，得到模型方程為：Y=0.83-0.057X1+0.018X2+(4.087E-003)X3+(2.250E-003)

表2 方案設計與結果

表3 方差分析

2.2.2 等高線圖和響應面圖分析

通過等高線圖和響應面圖可直觀地看出各因素交互作用影響的顯著性。如果兩個因素之間的交互作用影響不顯著時，得到的響應面圖趨于圓形；反之，如果兩個因素之間的交互作用影響顯著，則得到的響應面圖趨于橢圓形。脫色溫度、pH值、脫色時間等3個因素之間的交互作用對地黃多糖脫色效果影響的等高線圖和響應面圖如圖5所示。

圖5 各因素交互作用對脫色效果影響的等高線圖和響應面圖Fig.5 Contour plot and response surface plot of effect of interaction between each factors on decolorization efficiency

由圖5可知：脫色溫度與pH值、脫色溫度與脫色時間的交互作用對脫色效果的影響不大；3個因素對應的曲線中，變化最大的是代表脫色溫度的曲線，最為密集陡峭，說明脫色溫度的改變會引起OD值的顯著變化，其次是pH值，影響最小的是脫色時間。

對二次多項回歸方程進行極值分析，可預測地黃多糖最優(yōu)的脫色工藝條件為：脫色溫度43.26 ℃、pH值8.16、脫色時間116.32 min，預估的最大OD值為0.841 3。為了檢驗響應面實驗預測得到的工藝條件的可靠性，在上述條件下進行3次地黃多糖脫色平行實驗，考慮到實驗的可操作性，將預測的工藝條件微調成：脫色溫度43 ℃、pH值8.2、脫色時間116 min，得到脫色率為88.03%，多糖保留率為77.56%，計算得到OD值為0.827 8。通過響應面實驗預測的理論值與平行實驗的實測值誤差較小，表明擬合得到的二次多項回歸模型可以較好地預測因素與響應值之間的影響關系。

2.3 地黃多糖的抗氧化活性

2.3.1 對羥基自由基的清除活性(圖6)

圖6 地黃多糖對羥基自由基的清除活性Fig.6 Scavenging activity of polysaccharides fromRehmannia glutinosa Libosch. to hydroxyl free radicals

由圖6可知，地黃多糖對羥基自由基具有一定的清除能力，在其濃度為2.50 mg·mL-1時清除率達到最高，為56.62%；而地黃粗多糖在濃度為1.50 mg·mL-1時清除率達到最高，為42.13%。表明，經(jīng)過純化，地黃多糖清除羥基自由基的能力有了一定提高。

2.3.2 對超氧陰離子自由基的清除活性(圖7)

圖7 地黃多糖對超氧陰離子自由基的清除活性Fig.7 Scavenging activity of polysaccharides from Rehmannia glutinosa Libosch. to superoxide anion free radicals

由圖7可知，地黃多糖對超氧陰離子自由基具有較好的清除能力，在其濃度為2.00 mg·mL-1時清除率達到最高，為75.51%；而地黃粗多糖在濃度為2.00 mg·mL-1時，對超氧陰離子自由基的清除率僅為57.22%。表明，經(jīng)過純化，地黃多糖清除超氧陰離子自由基的能力有了明顯提高。

2.3.3 對DPPH自由基的清除活性(圖8)

圖8 地黃多糖對DPPH自由基的清除活性Fig.8 Scavenging activity of polysaccharides from Rehmannia glutinosa Libosch.to DPPH free radicals

由圖8可知，地黃多糖對DPPH自由基具有一定的清除能力，在其濃度為1.50 mg·mL-1時清除率達到最高，為54.66%；而地黃粗多糖在濃度為2.50 mg·mL-1時清除率達到最高，為42.13%。表明，經(jīng)過純化，地黃多糖清除DPPH自由基的能力有了一定提高。

抗氧化實驗結果表明，純化有助于提高地黃多糖的抗氧化活性，隨著地黃多糖的進一步純化，其抗氧化活性有可能進一步提高。

3 結論

在單因素實驗的基礎上，采用響應面法優(yōu)化了地黃多糖雙氧水法脫色工藝。在雙氧水與地黃粗多糖體積比為2.0∶1、脫色溫度為43 ℃、pH值為8.2、脫色時間為116 min的最優(yōu)條件下，地黃多糖脫色率達到88.03%，多糖保留率為77.56%；純化后的地黃多糖的抗氧化活性有了一定程度的提高。表明，雙氧水法適用于陜產地黃多糖的脫色，可進行工業(yè)化應用。陜產地黃多糖具有較高的抗氧化活性，但其抗氧化活性是否與血糖血脂的調節(jié)、免疫功能的改善等作用機制有關聯(lián)還需進一步研究。本研究為陜產地黃的深入開發(fā)利用提供了一條新的途徑。