吳健，何偉，王建成，楊玉蓉，藍(lán)彩紅，劉盛鋼，吳小霞，林峰，郭安，楊濤,*

1(中南林業(yè)科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙，410000)2(長(zhǎng)沙市食品藥品信息與審評(píng)認(rèn)證中心，湖南 長(zhǎng)沙，410000)3(四川邛崍金六福崖谷生態(tài)釀酒有限公司，四川 成都，611530)4(廣東德慶無(wú)比養(yǎng)生酒業(yè)有限公司，廣東 肇慶，526600)

米香型白酒作為我國(guó)基礎(chǔ)香型白酒之一，感官特點(diǎn)為“蜜香清雅、入口柔綿、落口爽洌、回味怡暢”[1]，主要呈現(xiàn)為乳酸乙酯、β-苯乙醇以及乙酸乙酯的復(fù)合蜜香，吸引了眾多的愛(ài)好者。然而，米香型白酒釀造原料與微生物體系單一，使得酒體干凈之余又風(fēng)味不足，層次不夠豐富飽滿，給部分人一種飲之寡淡的感覺(jué)，這也是小曲酒一直以來(lái)在白酒市場(chǎng)中難以定位高端產(chǎn)品的原因之一。因此，如何增加米香型白酒的良好風(fēng)味，成了相關(guān)企業(yè)的難點(diǎn)。

產(chǎn)香酵母泛指一類在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中可生成以酯類為代表的多種香味成分或其前體物質(zhì)的酵母菌，又叫做產(chǎn)酯酵母或生香酵母[2-3]。近年來(lái)因其產(chǎn)香的特殊生理學(xué)性質(zhì)而被廣泛應(yīng)用于食品發(fā)酵相關(guān)領(lǐng)域，包括煙草香料、醬醋釀造、傳統(tǒng)面食、果酒醬發(fā)酵、白酒釀造等風(fēng)味導(dǎo)向型產(chǎn)業(yè)[4-8]，起到豐富香氣，改善感官品質(zhì)的作用，具備提升酒體感官品質(zhì)的潛力。但單一種類的產(chǎn)酯酵母會(huì)代謝產(chǎn)生其特有的呈香物質(zhì)，釀造過(guò)程中若只是添加單一產(chǎn)酯能力強(qiáng)的酵母，發(fā)酵產(chǎn)物中特定組分的濃度會(huì)增加，大大超出其風(fēng)味閾值，從而破壞整體的良好感官，使白酒中出現(xiàn)明顯的“香蕉水味”“酸臭味”等不良?xì)馕?。因此?duì)于產(chǎn)酯酵母的選擇應(yīng)該多樣化，并對(duì)其相互作用進(jìn)行研究，探索接種的最佳比例及方式，使得最終的發(fā)酵產(chǎn)品風(fēng)味協(xié)調(diào)，層次豐富。同時(shí)產(chǎn)香酵母與小曲釀造微生物之間的相互作用常具有菌株差異性，也會(huì)受到發(fā)酵條件的影響，因此結(jié)合釀造工藝針對(duì)其發(fā)酵特性與菌株間相互作用的研究亟待開(kāi)展。

以篩選得到并鑒定后的異常維克漢遜酵母、扣囊復(fù)膜酵母、克魯維畢赤酵母、釀酒酵母4株菌作為供試菌株，在探索其生長(zhǎng)周期、抗逆性以及發(fā)酵特性的基礎(chǔ)上，研究了酵母間相互作用對(duì)菌體生長(zhǎng)和關(guān)鍵代謝產(chǎn)物的影響。一方面對(duì)酵母相互作用的機(jī)理研究以及發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的進(jìn)一步深入有著參考作用，另一方面使得企業(yè)生產(chǎn)時(shí)能準(zhǔn)確把控整個(gè)發(fā)酵環(huán)節(jié)，解決風(fēng)味的技術(shù)問(wèn)題，對(duì)相關(guān)工藝的調(diào)整起著巨大的作用，這不僅能對(duì)米香型白酒生產(chǎn)的智能化建設(shè)提供技術(shù)支持，促進(jìn)釀酒企業(yè)的發(fā)展，對(duì)整個(gè)白酒行業(yè)健康持續(xù)地發(fā)展也有著積極的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌株

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae，SC)、克魯維畢赤酵母(Pichiakudriazevii，PK)、異常維克漢遜酵母(Wickerhamomycesanomalus，WA)、扣囊復(fù)膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera，SF)，以上菌株均為實(shí)驗(yàn)室篩選鑒定得到并進(jìn)行保藏的菌種。

1.1.2 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(yeast extract peptone dextrose medium，YPD)(g/L)：酵母膏10、蛋白胨20，葡萄糖20，瓊脂2(液體培養(yǎng)基不加瓊脂)，加入純水溶解后121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Potato dextrose agar medium，PDA)(g/L)：馬鈴薯200，葡萄糖20。馬鈴薯濾汁加入葡萄糖，補(bǔ)足水溶解后調(diào)節(jié)pH為4.5，于121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min。

米曲汁培養(yǎng)基：參照毛宜詳?shù)萚9]和黃慧芬[10]的方法制備。

豆芽汁培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基：參照陳小龍等[11]的方法制備；

麩皮浸汁培養(yǎng)基：參照李國(guó)生等[12]的方法制備。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2600紫外、可見(jiàn)光分光光度計(jì)，日本島津公司；LRH-150生化培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；DK-98-2電熱恒溫水浴鍋，上海虔鈞科學(xué)儀器有限公司；SHA-C水浴恒溫?fù)u床，上海金鵬分析儀器有限公司；HZQ-C氣浴恒溫?fù)u床，常州恒隆儀器有限公司；WZ103手持式糖度儀，浙江托普云農(nóng)科技股份有限公司；FE28pH計(jì)，METTLER TOLEDO；YXQ-LS-75G全自動(dòng)數(shù)顯高壓滅菌器，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；BM1000生物顯微鏡，江南永新光學(xué)儀器有限公司；5804R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，艾本德中國(guó)有限公司；Vortex genie2旋渦振蕩器，Scientific Industries。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 形態(tài)學(xué)觀察

參照吳小霞[13]的方法進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

1.3.2 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

參照李宇輝等[14]的方法采取比濁法測(cè)定各菌株的生長(zhǎng)曲線。

1.3.3 抗逆性研究

1.3.3.1 耐酸性

將4種菌株進(jìn)行活化后，參照滕超等[15]的方法，把YPD液體培養(yǎng)基的pH用HCl和NaOH分別調(diào)節(jié)為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，將酵母種子液以5%的接種量接種至培養(yǎng)基中，于30 ℃ 培養(yǎng)48 h后進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3.2 耐熱性

以5%接種量接種酵母活化液至三角瓶中，設(shè)置培養(yǎng)溫度分別為20、24、28、32、36、40、44、48、52 ℃，培養(yǎng)48 h后，利用比濁法在600 nm處測(cè)定吸光值，以培養(yǎng)溫度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制曲線，得到菌株在不同溫度下的生長(zhǎng)情況。

1.3.3.3 乙醇耐受性

用無(wú)水乙醇調(diào)節(jié)YPD液體培養(yǎng)基的乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為0(即不加乙醇)、3%、6%、9%、12%、15%、18%、21%，按5%接種量接種酵母活化液，于30 ℃培養(yǎng)48 h后，在600 nm處測(cè)定吸光值后繪制曲線，得到菌株的最高乙醇耐受濃度，對(duì)其乙醇耐受性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.3.3.4 糖耐受性

用葡萄糖調(diào)節(jié)YPD液體培養(yǎng)基的糖體積分?jǐn)?shù)分別為15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%，按5%接種量接種酵母活化液，于30 ℃培養(yǎng)48 h 后，在600 nm處測(cè)定吸光值后繪制曲線，得到菌株的最高糖耐受濃度，對(duì)其高糖耐受性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.3.4 發(fā)酵特性研究

1.3.4.1 總酸總酯測(cè)定

參考盧亭等[16]的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4.2 發(fā)酵液乙醇濃度測(cè)定

按GB 5009.225—2016[17]中酒精度的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5 菌株相互作用研究

1.3.5.1 共培養(yǎng)對(duì)各菌株活菌數(shù)量的影響

大部分研究證明釀酒酵母對(duì)產(chǎn)香酵母有抑制作用，為排除菌株差異性，考察了兩者間的的相互作用。將釀酒酵母與3株產(chǎn)香酵母分別組合為SC-PK、SC-WA、SC-SF 3個(gè)組，分別按1×106CFU/mL的接種量共接種至米曲汁培養(yǎng)基內(nèi)，于30 ℃培養(yǎng)箱混合培養(yǎng)48 h后，參考HO等[18]與白夢(mèng)洋等[19]的方法對(duì)共培養(yǎng)組中WA、SF、PK、SC 4株酵母進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。同時(shí)分別進(jìn)行純培養(yǎng)后計(jì)數(shù)作為對(duì)照。

同時(shí)，為研究產(chǎn)香酵母間的相互作用，將PK、WA、SF 3株產(chǎn)香酵母兩兩組合，用一種菌的發(fā)酵上清液對(duì)另外1種菌進(jìn)行培養(yǎng)，研究其相互作用。取各菌株種子活化液，按1×106CFU/mL的接種量接種至米曲汁培養(yǎng)基中，在150 r/min的30 ℃氣浴搖床中培養(yǎng)24 h后，以8 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min取其上清液，并在超凈工作臺(tái)中過(guò)0.25 μm有機(jī)濾膜，備用；以組合中的一種產(chǎn)香酵母的發(fā)酵上清液作為培養(yǎng)液，按1×106CFU/mL的接種量接種另外1株產(chǎn)香酵母，于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，利用YPD瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。同時(shí)，用糖度與發(fā)酵上清液相同的米曲汁培養(yǎng)基在相同培養(yǎng)條件下做單菌對(duì)照培養(yǎng)。

1.3.5.2 接種比例對(duì)共培養(yǎng)代謝產(chǎn)物的影響

活化各菌株，參照Z(yǔ)HA 等[20]的接種量將WA、SF、PK種子液分別以3種不同的比例(106∶106∶105CFU/mL、105∶106∶106CFU/mL、106∶106∶106CFU/mL)接種至米曲汁培養(yǎng)基中，于30 ℃下培養(yǎng)72 h，在第24、36、48、60、72 h取樣，并過(guò)0.25 μm有機(jī)濾膜，參照標(biāo)準(zhǔn)DBS52/ 021—2016[21]中的方法測(cè)定乙醇、β-苯乙醇、乳酸乙酯、乙酸乙酯含量。同時(shí)在相同培養(yǎng)條件下進(jìn)行單菌純培養(yǎng)作為對(duì)照培養(yǎng)并做定量分析。

在共培體系中加入SC，將SC、WA、SF、PK的種子活化液以3種不同的比例(105∶106∶106∶106CFU/mL、106∶ 106∶106∶106CFU/mL、107∶106∶106∶106CFU/mL)接種至米曲汁中，于30 ℃下培養(yǎng)72 h，在第24、36、48、60、72 h取樣測(cè)定4種關(guān)鍵物質(zhì)含量。同時(shí)做對(duì)照培養(yǎng)處理：將3株產(chǎn)香酵母按106∶106∶106CFU/mL的比例進(jìn)行接種，在相同培養(yǎng)條件下進(jìn)行對(duì)照培養(yǎng)并做定量分析。

1.3.5.3 接種順序?qū)才囵B(yǎng)代謝產(chǎn)物的影響

為研究制種過(guò)程中釀酒酵母與產(chǎn)香酵母接種順序?qū)旌习l(fā)酵過(guò)程中關(guān)鍵代謝產(chǎn)物的影響規(guī)律，固定產(chǎn)香酵母的接種比例與接種方式為106∶106∶106CFU/mL，同時(shí)接種。待3株產(chǎn)香酵母接種完畢的第0(即同時(shí)接種)、8、12、16、20、24 h后按接種比例為106CFU/mL接種釀酒酵母，再共發(fā)酵72 h，利用氣相色譜分析代謝產(chǎn)物含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株形態(tài)學(xué)

2.1.1 菌株菌落形態(tài)

記錄各菌株單菌落基本形態(tài)，結(jié)果見(jiàn)表1。釀酒酵母與異常維克漢遜酵母形態(tài)相似，均為直徑1～2 mm的凸起狀半圓球；克魯維畢赤酵母為4～5 mm的中間凸起狀圓形菌落，扣囊復(fù)膜酵母為直徑5～7 mm的均勻凸起狀同心圓菌落且不易挑起，表面的假菌絲能輕松刮下，但內(nèi)部呈現(xiàn)出果肉狀的菌體，與紅曲霉菌較為相似，具有一定硬度。各菌株菌落見(jiàn)圖1。

表1 菌株的基本菌落形態(tài)Table 1 The basic colony morphology of the yeast strains

2.1.2 菌株細(xì)胞形態(tài)鏡檢圖

菌株細(xì)胞形態(tài)及鏡檢圖如圖1所示。

a-釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；b-克魯維畢赤酵母(Pichia kudriazevii)；c-扣囊復(fù)膜酵母(Sacharomyyees fibuligera);d-異常維克漢遜酵母(Wickerhamomyces anomalus)圖1 菌株的菌落及細(xì)胞形態(tài)Fig.1 The colony and cell morphology of the yeast strains注：細(xì)胞形態(tài)圖為光學(xué)顯微鏡1 000倍放大鏡檢圖

2.2 菌株生長(zhǎng)曲線

由圖2可知，4株酵母的生長(zhǎng)周期差異明顯，0～4 h均處于生長(zhǎng)延滯期，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，各菌株迅速增殖，由于生長(zhǎng)速度的不一致，菌體濃度、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與生長(zhǎng)因子的消耗速度也有所不同，生長(zhǎng)限制到來(lái)的時(shí)間存在一定差異，在第24 h后，釀酒酵母與扣囊復(fù)膜酵母結(jié)束對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，率先進(jìn)入穩(wěn)定期，生長(zhǎng)趨于平緩；第28 h后異常維克漢遜酵母也隨之進(jìn)入穩(wěn)定期，而克魯維畢赤酵母的生長(zhǎng)速度則相對(duì)較緩，在第32 h后也進(jìn)入了穩(wěn)定期。

圖2 酵母菌株的生長(zhǎng)曲線Fig.2 The growth curve of the yeast strains

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌體活力最強(qiáng)，此階段微生物利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不斷增殖，生長(zhǎng)條件適宜的情況下，基本不會(huì)出現(xiàn)死亡細(xì)胞，因此菌株接種時(shí)應(yīng)選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期增殖活力較強(qiáng)的細(xì)胞。而穩(wěn)定期則是微生物累積代謝產(chǎn)物的階段，通過(guò)不同方法延長(zhǎng)穩(wěn)定期有利于目標(biāo)產(chǎn)物的生成，提高生物轉(zhuǎn)化率。

2.3 菌株抗逆性

實(shí)際工業(yè)釀酒過(guò)程中，會(huì)出現(xiàn)不利于菌株正常生長(zhǎng)發(fā)酵的環(huán)境脅迫，如超過(guò)適宜生長(zhǎng)范圍的高溫、高酸，濃繆發(fā)酵下的高滲透壓脅迫，以及代謝物累積過(guò)程中的高濃度乙醇，均會(huì)對(duì)酵母的發(fā)酵活力與增殖能力產(chǎn)生極大的損害，從而反向抑制發(fā)酵過(guò)程。因此，針對(duì)酵母在各種脅迫下的抗逆性進(jìn)行了研究，考察了酵母的釀造潛力。

由圖3可知，釀酒酵母與產(chǎn)香酵母在44 ℃仍能增殖，但繼續(xù)提升培養(yǎng)溫度至48 ℃，所有酵母均難以生長(zhǎng)。能保證正常發(fā)酵的生長(zhǎng)溫度則具有一定差異性，其中釀酒酵母與異常維克漢遜酵母的最適生長(zhǎng)溫度為28 ℃，40 ℃之后則出現(xiàn)明顯的生長(zhǎng)受限；扣囊復(fù)膜酵母最適生長(zhǎng)溫度為32 ℃，40 ℃之后生長(zhǎng)開(kāi)始受到明顯抑制，菌體增殖較少；而克魯維畢赤酵母在升溫培養(yǎng)的過(guò)程中，表現(xiàn)出了較高的熱敏感性，最適生長(zhǎng)溫度為32 ℃，繼續(xù)升溫其生長(zhǎng)開(kāi)始受限，但其耐熱性能卻是4株酵母中最好的。這可能是發(fā)酵液中存在熱保護(hù)性的物質(zhì)，從而增加了酵母的耐熱性，如糖可以作為熱保護(hù)劑使酵母的耐熱性能得到一定程度的提高[22]。

a-培養(yǎng)溫度；b-培養(yǎng)基pH；c-乙醇體積分?jǐn)?shù)；d-葡萄糖體積分?jǐn)?shù)圖3 酵母的抗逆性測(cè)定Fig.3 Determination on stress resistance of yeast strains

同時(shí)，4株酵母均具備良好的耐酸能力，其中異常維克漢遜酵母最適生長(zhǎng)pH為5.0，能耐受的最低pH為2.0，耐酸性最強(qiáng)，其余3株酵母的最適生長(zhǎng)pH分別為5.5、4.5、6.0，且能耐受的最低pH均為2.5。

在乙醇耐受性方面，釀酒酵母最高，在12%仍能良好生長(zhǎng)，15%時(shí)能長(zhǎng)但嚴(yán)重受抑制；扣囊復(fù)膜酵母次之，在9%能良好生長(zhǎng)，12%能長(zhǎng)但嚴(yán)重受抑制；畢赤酵母和異常維克漢遜酵母最弱，在6%能良好生長(zhǎng)，9%能長(zhǎng)但嚴(yán)重受抑制；4株酵母在乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到18%后基本停止生長(zhǎng)，其中低濃度(3%)能促進(jìn)釀酒酵母與漢遜酵母生長(zhǎng)。雖然高濃度的乙醇會(huì)通過(guò)抑制葡萄糖和氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，以及丙酮酸激酶和己糖激酶等關(guān)鍵的糖酵解酶的變性，并增加膜的通透性使酵母喪失正常的生理功能[23]，但低濃度的乙醇反而對(duì)酵母生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，相關(guān)機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

此外，4株酵母菌也具備良好的糖耐受能力，其中扣囊復(fù)膜酵母高糖耐受性最佳，在40%糖體積分?jǐn)?shù)下能良好生長(zhǎng)，45%時(shí)受到較大生長(zhǎng)抑制；釀酒酵母、異常維克漢遜酵母均在35%糖體積分?jǐn)?shù)下能良好生長(zhǎng)，40%時(shí)受到較大生長(zhǎng)抑制；而畢赤酵母最弱，在30%糖體積分?jǐn)?shù)下能良好生長(zhǎng)，40%時(shí)受到較大生長(zhǎng)抑制。高滲透壓脅迫下，酵母菌會(huì)發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)與酶活力來(lái)適應(yīng)不良環(huán)境[24]，這對(duì)濃繆發(fā)酵具有極大意義。但暴露在極端的滲透壓環(huán)境下，微生物細(xì)胞內(nèi)的水分缺失，細(xì)胞發(fā)生收縮，結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重破壞，從而停滯生長(zhǎng)[25]。

2.4 菌株發(fā)酵特性

釀酒酵母與產(chǎn)香酵母均具備一定產(chǎn)酸酯和乙醇的能力，為了在之后的制曲過(guò)程中對(duì)菌株進(jìn)行合理的搭配，對(duì)4株酵母產(chǎn)酸酯、乙醇等特性進(jìn)行了研究，通過(guò)模擬米香型白酒發(fā)酵，在米曲汁培養(yǎng)基中接種各菌株種子液，考察了其發(fā)酵特性。

由圖4可知，產(chǎn)乙醇的能力由強(qiáng)到弱依次排序?yàn)獒劸平湍?、克魯維畢赤酵母、異常維克漢遜酵母、扣囊復(fù)膜酵母，4株酵母經(jīng)接種后發(fā)酵72 h，發(fā)酵液中的乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為8.0%、5.6%、3.4%、2.2%，除了釀酒酵母外，其余3株產(chǎn)香酵母也具備一定產(chǎn)酒能力；產(chǎn)酸的能力排序?yàn)榭勰覐?fù)膜酵母>畢赤酵母>漢遜酵母>釀酒酵母，分別為3.57、2.96、1.95、1.50 g/L；產(chǎn)酯能力為畢赤酵母>漢遜酵母>扣囊復(fù)膜酵母>釀酒酵母，分別為3.09、2.78、2.54、0.38 g/L。

圖4 酵母發(fā)酵特性的測(cè)定Fig.4 Determination on fermentative characteristic of yeast strains

發(fā)酵體系中，一定含量的酸酯對(duì)于風(fēng)味有積極的作用，加入產(chǎn)香酵母能顯著增強(qiáng)發(fā)酵液中的酯含量，4株酵母中釀酒酵母具備優(yōu)秀的發(fā)酵能力，其余3株產(chǎn)香酵母在擁有一定發(fā)酵產(chǎn)酒能力的同時(shí)，產(chǎn)酯能力可觀，共發(fā)酵過(guò)程中能起到明顯的增香效果。

2.5 菌株相互作用

2.5.1 釀酒酵母與產(chǎn)香酵母共培養(yǎng)對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響

將釀酒酵母分別與其余酵母混合培養(yǎng)，研究?jī)烧唛g相互的生長(zhǎng)影響。由圖5-a可知，3株產(chǎn)香酵母在與釀酒酵母共培后，體系中的活菌數(shù)量顯著性下降，釀酒酵母對(duì)異常維克漢遜酵母、克魯維畢赤酵母、扣囊復(fù)膜酵母的生長(zhǎng)均有不同程度的抑制作用。而從圖5-b中則可看出，在異常維克漢遜酵母影響下，釀酒酵母數(shù)量輕微降低；而扣囊復(fù)膜酵母與克魯維畢赤酵母輕微促進(jìn)了釀酒酵母的生長(zhǎng)。但總體差異不具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可認(rèn)為3株產(chǎn)香酵母對(duì)釀酒酵母的生長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響。

a-釀酒酵母對(duì)產(chǎn)香酵母生長(zhǎng)的影響;b-產(chǎn)香酵母對(duì)釀酒酵母生長(zhǎng)的影響圖5 釀酒酵母與產(chǎn)香酵母相互作用對(duì)活菌數(shù)的影響Fig.5 Effect of the interaction between saccharomyces cerevisiae and the aroma-producing yeast on the number of viable colony注：**表示釀酒酵母對(duì)產(chǎn)香酵母的生長(zhǎng)影響顯著(P<0.05)；不同小寫(xiě)字母表示產(chǎn)香酵母對(duì)釀酒酵母的生長(zhǎng)影響顯著(P<0.05)；A、B、C、D分別表示釀酒酵母、異常維克漢遜酵母、扣囊復(fù)膜酵母、克魯維畢赤酵母純培養(yǎng)活菌數(shù)；“A-B”表示A與B共培養(yǎng)后共發(fā)酵體系中B的活菌數(shù)，A-C、A-D、B-A、C-A、D-A同理

釀酒酵母對(duì)于產(chǎn)香酵母的抑制作用已有很多報(bào)道，通常認(rèn)為是前者的代謝產(chǎn)物造成了后者生長(zhǎng)的不利條件，包括產(chǎn)酸與乙醇，同時(shí)高密度的細(xì)胞也對(duì)產(chǎn)香酵母的增殖造成了消極影響[26]，但兩者的相互作用也有微生物種系的差異性[27]。本實(shí)驗(yàn)共培養(yǎng)研究結(jié)果顯然與這類研究相符，因此釀酒酵母可能會(huì)造成共培養(yǎng)體系中產(chǎn)香酵母的早衰。而產(chǎn)香酵母對(duì)于釀酒酵母在活菌數(shù)量上的影響沒(méi)有顯著的表現(xiàn)，這可能與釀酒酵母良好的乙醇耐受性有關(guān)，同時(shí)也與產(chǎn)香酵母的生長(zhǎng)速度以及產(chǎn)乙醇的能力相關(guān)。與其余2株產(chǎn)香酵母相比，異常維克漢遜酵母對(duì)數(shù)期的生長(zhǎng)速度較快，且到達(dá)穩(wěn)定期后菌體濃度與釀酒酵母相差不大，可能是通過(guò)細(xì)胞間的接觸對(duì)釀酒酵母產(chǎn)生了輕微的抑制作用，但由于釀酒酵母是前期生長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)菌株且具備優(yōu)秀的抗逆性，因此這種影響非常小。同時(shí)有研究認(rèn)為，非釀酒酵母在與釀酒酵母共培養(yǎng)的前期能促進(jìn)后者的糖與氮代謝[28]，對(duì)其生長(zhǎng)有利，這可能也是扣囊復(fù)膜酵母與畢赤酵母輕微促進(jìn)釀酒酵母菌體數(shù)量增加的原因，但作用同樣非常有限。

2.5.2 產(chǎn)香酵母間的共培養(yǎng)對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響

產(chǎn)香酵母種類眾多且生理特性相似，當(dāng)多種產(chǎn)香酵母作為主要功能性微生物共存于一個(gè)發(fā)酵體系中時(shí)，對(duì)其共培生長(zhǎng)規(guī)律的探索必不可少。為研究3株酵母兩兩之間的共培養(yǎng)情況，利用菌株的單菌發(fā)酵上清作為培養(yǎng)液。由圖6-a、圖6-c可知，異常維克漢遜酵母與扣囊復(fù)膜酵母相互間的生長(zhǎng)并無(wú)太大影響，扣囊復(fù)膜酵母與克魯維畢赤酵母間的生長(zhǎng)也沒(méi)有顯著性的抑制或促進(jìn)作用。而由圖6-b 可知，用克魯維畢赤酵母的發(fā)酵上清液對(duì)異常維克漢遜酵母進(jìn)行培養(yǎng)，顯著抑制了后者的增殖；而克魯維畢赤酵母對(duì)于異常維克漢遜酵母則無(wú)明顯影響。

從兩兩組合的培養(yǎng)結(jié)果來(lái)看，3株產(chǎn)香酵母中，只有克魯維畢赤酵母對(duì)于異常維克漢遜酵母的生長(zhǎng)有顯著的抑制作用。利用上清進(jìn)行培養(yǎng)消除掉了因生長(zhǎng)速度與周期不同帶來(lái)的細(xì)胞接觸抑制的可能性，而從發(fā)酵特性來(lái)看，畢赤酵母產(chǎn)酸與乙醇的能力均比漢遜酵母強(qiáng)，因此培養(yǎng)環(huán)境中酸脅迫與乙醇脅迫是導(dǎo)致后者活菌數(shù)量下降的可能原因，而對(duì)比異常維克漢遜酵母與扣囊復(fù)膜酵母的培養(yǎng)組合可以發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)酸能力比克魯維畢赤酵母強(qiáng)的扣囊復(fù)膜酵母同樣造成了一個(gè)酸脅迫的環(huán)境，但對(duì)異常維克漢遜酵母并無(wú)明顯抑制作用，因此推測(cè)乙醇是降低異常維克漢遜酵母菌體數(shù)量的主要因素。而其余菌株間的影響均不明顯，這也體現(xiàn)了菌株的相互作用具有種系的差異，作用機(jī)制深入有待進(jìn)一步研究。

2.5.3 接種比例對(duì)共培養(yǎng)代謝產(chǎn)物的影響

2.5.3.1 不同接種比例對(duì)產(chǎn)香酵母共培養(yǎng)代謝產(chǎn)物的影響

釀酒酵母對(duì)其余3株產(chǎn)香酵母具有明顯的抑制性作用，而產(chǎn)香酵母間除了克魯維畢赤酵母會(huì)一定程度抑制異常維克漢遜酵母生長(zhǎng)之外，其余菌株均無(wú)明顯負(fù)面影響。因此先對(duì)產(chǎn)香酵母間的共培養(yǎng)接種比例進(jìn)行研究，探索不同接種比例下產(chǎn)香酵母代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律。

a-異常維克漢遜酵母與扣囊復(fù)膜酵母的相互影響;b-異常維克漢遜酵母與克魯維畢赤酵母的相互影響;c-扣囊復(fù)膜酵母與克魯維畢赤酵母的相互影響圖6 產(chǎn)香酵母間相互作用對(duì)活菌數(shù)的影響Fig.6 Effect of the interaction in the aroma-producing yeast on the number of viable colony注：不同小寫(xiě)字母表示活菌數(shù)量有顯著性差異(P<0.05)；B、C、D分別表示異常維克漢遜酵母、扣囊復(fù)膜酵母、克魯維畢赤酵母純培養(yǎng)活菌數(shù)；“B-C”表示以B的上清液培養(yǎng)C后C的活菌數(shù)，B-D、C-D同理

結(jié)合供試菌株的發(fā)酵特性并參考了已有的研究基礎(chǔ)[20]，以單菌發(fā)酵作為對(duì)照，并將異常維克漢遜酵母、扣囊復(fù)膜酵母、克魯維畢赤酵母的種子活化液分別以3種不同的比例(106∶106∶105、105∶106∶106、106∶106∶106CFU/mL)接種至米曲汁培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果如圖7所示。

a-β-苯乙醇；b-乳酸乙酸；c-乙酸乙醇；d-乙醇圖7 不同接種比例下產(chǎn)香酵母共培養(yǎng)代謝產(chǎn)物的測(cè)定Fig.7 Changes of metabolites in co-culture of the aroma-producing yeast under different inoculation ratio注：B、C、D分別為異常維克漢遜酵母、扣囊復(fù)膜酵母、克魯維畢赤酵母；B∶ C∶ D-105∶ 106∶ 106表示B、C、D 3株酵母的共培養(yǎng)接種比例分別為105、106、106CFU/mL，其他標(biāo)示同理

隨著發(fā)酵時(shí)間增加，發(fā)酵液中各種風(fēng)味物質(zhì)的含量逐漸上升。在圖7-d中，培養(yǎng)至60 h后，不同比例混合接種的發(fā)酵液中乙醇含量均有提高。但繼續(xù)培養(yǎng)至72 h，各比例發(fā)酵組中乙醇均有不同程度的下降，此時(shí)接種比例為106∶106∶106CFU/mL的發(fā)酵組中乙醇質(zhì)量濃度最高，達(dá)到44 773.23 mg/L。由圖7-a、圖7-c可知，發(fā)酵啟動(dòng)24 h后，不同比例的混菌發(fā)酵液中乙酸乙酯、β-苯乙醇的含量均所有提高，其中106∶106∶106CFU/mL發(fā)酵組的結(jié)果最佳，培養(yǎng)至72 h，分別為4 818.57、372.70 mg/L。在發(fā)酵過(guò)程中乙酸乙酯含量逐漸升高而后趨于平緩，但β-苯乙醇表現(xiàn)為先升后降的趨勢(shì)。而乳酸乙酯的含量則有所不同，如圖7-b所示，扣囊復(fù)膜酵母單菌發(fā)酵產(chǎn)乳酸乙酯的能力在前48 h內(nèi)最強(qiáng)，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)至72 h，105∶106∶106CFU/mL 發(fā)酵組與106∶106∶106CFU/mL發(fā)酵組中的乳酸乙酯含量才高過(guò)扣囊復(fù)膜酵母，此時(shí)最優(yōu)的發(fā)酵組比例是106∶106∶106CFU/mL，乳酸乙酯質(zhì)量濃度為865.71 mg/L。綜上，產(chǎn)香酵母不同比例的混合培養(yǎng)中，當(dāng)接種量為106∶106∶106CFU/mL時(shí)，發(fā)酵液中乙醇、β-苯乙醇、乳酸乙酯、乙酸乙酯含量較高。

乳酸乙酯、乙酸乙酯、β-苯乙醇是米香型白酒香氣與風(fēng)格形成的主要物質(zhì)。其中β-苯乙醇等醇類物質(zhì)除了本身呈香之外，同時(shí)還是生成其他香氣成分如乙酸苯乙酯的前體物，這可能也是發(fā)酵過(guò)程中其含量先增后降的一個(gè)原因。此外從乳酸乙酯的生成情況來(lái)看，扣囊復(fù)膜酵母的單菌發(fā)酵在前48 h內(nèi)的產(chǎn)量較高，后期趨于平緩至穩(wěn)定，而混菌發(fā)酵中雖然前期的產(chǎn)量較低，但一直保持穩(wěn)定的升高。酵母的生長(zhǎng)是代謝產(chǎn)物積累的必要前提，對(duì)比單菌發(fā)酵結(jié)果來(lái)看，產(chǎn)香酵母共培養(yǎng)也可能發(fā)生接觸性抑制從而使得扣囊復(fù)膜酵母的生長(zhǎng)放緩，因此前期乳酸乙酯的含量反而在單菌發(fā)酵液中較高。從單菌發(fā)酵的結(jié)果來(lái)看，克魯維畢赤酵母的乙酸乙酯產(chǎn)量比其余兩株菌要高，因此加大其接種的比例會(huì)一定程度上提高乙酸乙酯含量。3株產(chǎn)香酵母以106∶106∶106CFU/mL的接種量進(jìn)行共培養(yǎng)，對(duì)比各菌株的純培養(yǎng)結(jié)果來(lái)看，各關(guān)鍵物質(zhì)的含量均有所提高，這與白夢(mèng)洋等[29]的研究結(jié)果有相似之處。

2.5.3.2 不同接種比例對(duì)釀酒酵母與產(chǎn)香酵母共培養(yǎng)代謝產(chǎn)物的影響

為進(jìn)一步研究添加釀酒酵母與產(chǎn)香酵母共培后風(fēng)味物質(zhì)的變化情況，在產(chǎn)香酵母共培的研究基礎(chǔ)上，固定產(chǎn)香酵母的接種比例為106∶106∶106CFU/mL，探索不同的釀酒酵母的接種比例對(duì)共培代謝物的影響，結(jié)果如下。

a-β-苯乙醇；b-乳酸乙酯；c-乙酸乙酯；d-乙醇圖8 不同接種比例下釀酒酵母與產(chǎn)香酵母共培養(yǎng)代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律Fig.8 Changes of metabolites in co-culture of Saccharomyces cerevisiae and the aroma-producing yeast under different inoculation ratio注：A、B、C、D分別為釀酒酵母、異常維克漢遜酵母、扣囊覆膜酵母、克魯維畢赤酵母；A∶ B∶ C∶ D-105∶106∶ 106∶ 106表示A、B、C、D 4株酵母的共培養(yǎng)接種比例分別為105、106、106、106CFU/mL，其他標(biāo)示同理

由圖8可知，對(duì)比產(chǎn)香酵母的混合發(fā)酵，添加釀酒酵母與產(chǎn)香酵母混合發(fā)酵至72 h后，發(fā)酵液中β-苯乙醇、乙醇等醇類物質(zhì)的含量明顯提高，但乳酸乙酯、乙酸乙酯等酯類物質(zhì)的含量有不同程度的降低。在圖7-d中，釀酒酵母以3種不同的比例接種到共發(fā)酵體系中，都能顯著增加乙醇的含量，以其中106∶106∶106∶106、107∶106∶106∶106CFU/mL 2種接種比例較好，乙醇質(zhì)量濃度分別為62 194.41、63 145.38 mg/L；β-苯乙醇的生成也具有相似的規(guī)律，如圖8-a所示，其含量在106∶106∶106∶106CFU/mL的混合接種比例中最佳，發(fā)酵72 h后達(dá)到767.75 mg/L。由圖8-b、圖8-c可知，在產(chǎn)酯方面，釀酒酵母的產(chǎn)酯量很低，與對(duì)照組相比，釀酒酵母的接種還降低了發(fā)酵體系中乳酸乙酯與乙酸乙酯的含量。其中106∶106∶106∶106CFU/mL接種的發(fā)酵組中乳酸乙酯相對(duì)較多，質(zhì)量濃度為764.30 mg/L；同時(shí)從乙酸乙酯的生成情況來(lái)看，105∶106∶106∶106CFU/mL與106∶106∶106∶106CFU/mL 2種比例下的乙酸乙酯質(zhì)量濃度較高，分別為3 918.91、3 643.93 mg/L。綜合考慮發(fā)酵體系中風(fēng)味物質(zhì)的多樣性與含量，選擇106∶106∶106∶106CFU/mL作為釀酒酵母與產(chǎn)香酵母混合發(fā)酵的接種比例，最有利于4種關(guān)鍵代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。

從單菌發(fā)酵的結(jié)果來(lái)看，釀酒酵母是高級(jí)醇與乙醇的主要產(chǎn)生菌，通常認(rèn)為β-苯乙醇等高級(jí)醇類物質(zhì)是酵母在酒精發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)埃利希途徑產(chǎn)生[30]，適宜濃度下具有芳香氣味，對(duì)酒體的風(fēng)味起著積極的作用[31]。因此釀酒酵母接種比例增大，這2種物質(zhì)的含量也隨之升高。但釀酒酵母與產(chǎn)香酵母共培養(yǎng)，對(duì)于酯類物質(zhì)的產(chǎn)生起到了負(fù)面的作用，可能是因?yàn)獒劸平湍傅纳L(zhǎng)抑制了產(chǎn)香酵母的生長(zhǎng)，從而減少了酯類代謝物質(zhì)的生成，這與菌株相互作用的研究規(guī)律相符。

2.5.4 接種順序?qū)才囵B(yǎng)代謝產(chǎn)物的影響

考慮到接種釀酒酵母與產(chǎn)香酵母混合培養(yǎng)對(duì)共發(fā)酵體系代謝產(chǎn)物中的酯類物質(zhì)的產(chǎn)生具有一定的抑制作用，因此在接種產(chǎn)香酵母后的0、8、12、16、20、24 h接種釀酒酵母，研究不同接種順序下代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律，找出最適合釀酒酵母的接種方式。結(jié)果如圖9所示。

不同接種順序?qū)τ诠舶l(fā)酵影響較大，如圖9-a所示，隨著釀酒酵母的接種時(shí)間被延后，乙醇產(chǎn)量呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，在第8 h出現(xiàn)最大值67 242.68 mg/L；乳酸乙酯也具有一樣的趨勢(shì)，在第12 h有最大值753.34 mg/L；而β-苯乙醇則相反，其含量隨著釀酒酵母接種時(shí)間的延后而降低；乙酸乙酯則是先升高后降低，在第16 h有最大值4 951.73 mg/L。

釀酒酵母與產(chǎn)香酵母的接種順序?qū)τ?種主要的代謝產(chǎn)物都具有顯著影響，在接種產(chǎn)香酵母后的8 h接種釀酒酵母，測(cè)得發(fā)酵液中乙醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯的含量均有所提升，但β-苯乙醇含量稍微降低。這可能和酵母的生長(zhǎng)以及發(fā)酵特性有關(guān)。3株產(chǎn)香酵母具有一定的產(chǎn)酒能力，但總體的生長(zhǎng)受到乙醇的抑制，接種產(chǎn)香酵母培養(yǎng)一段時(shí)間后，菌株開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，這一方面對(duì)酯類物質(zhì)的產(chǎn)生具有促進(jìn)作用，另一方面由于其本身也產(chǎn)乙醇，因此乙醇含量也有所提高，而β-苯乙醇的含量雖有所降低，但與同時(shí)接種相比并無(wú)明顯差異。ESCRUBANO-VIANA等[32]的研究也發(fā)現(xiàn)了同樣的規(guī)律，認(rèn)為順序接種對(duì)于釀酒過(guò)程中的香氣具有明顯的改善作用，但也具備菌株差異性。因此在混合培養(yǎng)時(shí)，選擇在接種產(chǎn)香酵母后的8 h接種釀酒酵母，對(duì)于呈香物質(zhì)的累積具有積極意義。

3 結(jié)論

以釀酒酵母、異常維克漢遜酵母、扣囊復(fù)膜酵母、克魯維畢赤酵母4株菌為供試菌株，從菌株形態(tài)、生長(zhǎng)周期、抗逆性以及發(fā)酵特性等釀造相關(guān)的生理特性進(jìn)行了研究，并探索了菌株間相互作用對(duì)菌體生長(zhǎng)與代謝的影響。

結(jié)果表明，4株菌都具備良好抗逆性；均可耐受44 ℃；PK、SF、SC均可耐受pH 2.5，WA可耐受pH 2.0；同時(shí)，PK、SF、WA均可耐受9%乙醇，而SC可耐受12%乙醇；此外，PK、SF、SC、WA可耐受的糖體積分?jǐn)?shù)分別為30%、40%、35%、35%。此外在發(fā)酵特性方面，產(chǎn)酸能力最強(qiáng)的是SF，3.57 g/L；產(chǎn)酯能力最強(qiáng)的是PK，3.09 g/L；產(chǎn)乙醇能力最強(qiáng)的是SC，發(fā)酵液中乙醇體積分?jǐn)?shù)為8.0%。

共培養(yǎng)結(jié)果表明，釀酒酵母對(duì)于其余3株產(chǎn)香酵母的生長(zhǎng)均有抑制作用，而產(chǎn)香酵母對(duì)于釀酒酵母的生長(zhǎng)則沒(méi)有明顯的影響。在異常維克漢遜酵母與克魯維畢赤酵母的組合中，后者的代謝產(chǎn)物顯著抑制了前者的生長(zhǎng)，而異常維克漢遜酵母并無(wú)明顯抑制克魯維畢赤酵母生長(zhǎng)的現(xiàn)象，其余的菌株組合中均未出現(xiàn)顯著的抑制或者促進(jìn)作用。同時(shí)，共培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)香酵母的最優(yōu)接種比例為106∶106∶106CFU/mL，釀酒酵母最優(yōu)接種比例為106CFU/mL，在接種產(chǎn)香酵母8 h后進(jìn)行釀酒酵母的接種，共培養(yǎng)發(fā)酵液中風(fēng)味物質(zhì)的含量最優(yōu)，對(duì)于米香型白酒的香氣有積極的作用。