錢星文， 伍小妹， 譚轉(zhuǎn)換

(東方藥林藥業(yè)有限公司，廣東 廣州 510515)

骨質(zhì)疏松癥(OP)是一種骨骼系統(tǒng)疾病，多由骨量減少、骨骼微細結(jié)構(gòu)破壞、骨骼脆性增加、易于骨折等原因引起[1]。在人口壽命延長、老年人口占比必然上升的情況下[2]，OP成為繼心血管疾病、糖尿病之后的第3種常見多發(fā)的慢性疾病[3]，已成為一個全球性的問題[4]。本文研究一種具有增加骨密度作用的中藥保健食品，來源于南方醫(yī)科大學(xué)的名醫(yī)驗方，主要用于增強骨密度，方中所用原料均在既是食品又是藥品的保健品名單中[5]，本實驗擬對東方藥林牌骨碎補馬鹿茸片進行毒理學(xué)實驗，進一步研究東方藥林牌骨碎補馬鹿茸片的安全性，為組方的安全使用提供依據(jù)。

1 材料和試劑

1.1 實驗樣品

東方藥林牌骨碎補馬鹿茸片(中元片)，由淫羊藿、骨碎補、山茱萸、馬鹿茸為原料，添加微晶纖維素、淀粉、硬脂酸鎂、潤濕劑聚維酮 K30制備而成，每日服用量為4.32 g/60 kg(體質(zhì)量，下同)，送檢樣品量為5.0 kg(為中試驗證生產(chǎn)中的未添加輔料的中間產(chǎn)品，批號為20170503)，棕色粉末，相當(dāng)于成品樣品9.72 kg，樣品每日服用劑量為2.22 g/60 kg，東方藥林藥業(yè)有限公司提供。

1.2 實驗動物

SPF級昆明種小鼠和Wistar大鼠，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號為SCXK(京)2016-0011。實驗過程中對動物的處置符合實驗動物倫理學(xué)規(guī)定。

1.3 儀器和試劑

XS6001S動物秤[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；GR85DA高壓滅菌鍋[致微(廈門)儀器有限公司]；TC20細胞計數(shù)儀(美國BIO-RAD公司)；VS-1300L-U超凈工作臺(蘇州安泰公司)；SPX-250智能生化培養(yǎng)箱(金壇市醫(yī)療儀器廠)、OLYMPUS 顯微鏡(OLYMPUS公司)；AU480 全自動生化分析儀(Beckmen Coulter公司)； XT-2000i五分類血球計數(shù)儀(Sysmex公司)。

1.4 方法[6]

1.4.1 小鼠經(jīng)口急性毒性實驗(最大耐受量法，MTD法) 選用雌雄各半20只18～22 g SPF級昆明種小鼠，禁食16 h，以15.0 g/kg的劑量，給予質(zhì)量濃度為0.375 g/mL、灌胃量為0.20 mL/10 g的樣品溶液2次，時間間隔為6 h，給藥后連續(xù)觀察14 d。記錄中毒表現(xiàn)及死亡情況。

1.4.2 大鼠經(jīng)口急性毒性實驗(最大耐受量法) 選用雌雄各半20只180～220 g SPF級Wistar大鼠，禁食16 h，以15.0 g/kg的劑量，給予質(zhì)量濃度為0.375 g/mL、灌胃量為2.0 mL/100 g的樣品溶液2次，時間間隔為6 h，給藥后連續(xù)觀察14 d。記錄中毒表現(xiàn)及死亡情況，判斷受試物的急性毒性。

1.4.3 Ames實驗 采用經(jīng)鑒定符合要求的鼠傷害沙門氏菌組氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102 4株試驗菌株進行實驗。用多氯聯(lián)苯(PCB)誘導(dǎo)大鼠后制備的肝勻漿(S9)作為體外代謝活化系統(tǒng)。受試物質(zhì)量濃度分別為50、10、2、0.4、0.08 mg/mL。實驗設(shè)0、8、40、200、1 000、5 000 μg/皿6個劑量組和陽性對照組。在頂層瓊脂中加入0.1 mL試驗菌株增菌液、0.1 mL受試物和0.5 mL S9混合液(當(dāng)需要代謝活化時)，混勻后倒入底層培養(yǎng)基平板上，每組均做3個平行樣。37 ℃培養(yǎng)48 h，計數(shù)每皿回變菌落數(shù)。若受試物的回變菌落數(shù)是空白對照菌落數(shù)2倍以上、具有劑量-反應(yīng)關(guān)系者，判定為陽性。整套實驗在相同條件下重復(fù)進行1次。

1.4.4 小鼠骨髓細胞微核實驗 采用間隔24 h 2次灌胃法進行實驗。用雌雄各半的50只體質(zhì)量25～30 g小鼠，隨機分為5組，每組10只，以40 mg/kg劑量的環(huán)磷酰胺作為陽性對照，腹腔注射給藥，給藥量為0.1 mL/10 g。實驗組樣品劑量設(shè)定為0、2.5、5.0、7.5 g/kg，稱取樣品加蒸餾水調(diào)配成濃度分別為0、0.125、0.250、0.375 g/mL的樣品溶液，灌胃量為0.2 mL/10 g。于末次給樣品溶液6 h后，頸椎脫臼處死動物，取胸骨骨髓用小牛血清稀釋涂片，甲醇固定，Giemsa染色。在光學(xué)顯微鏡下，每只動物計算1 000個嗜多染紅細胞(PCE)，微核發(fā)生率以含微核的PCE千分率計，并用泊松分布方法進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，并計算PCE/NCE(成熟紅細胞)比例。

1.4.5 小鼠睪丸染色體畸變實驗 用25只體質(zhì)量25～30 g的性成熟小鼠，隨機分成5組，每組5只，陽性對照組給予2.0 mg/kg劑量的絲裂霉素，給藥量為0.1 mL/10 g，每天腹腔注射給藥1次，連續(xù)2 d。實驗組樣品劑量設(shè)定為0、2.5、5.0、7.5 g/kg，取樣品加蒸餾水分別調(diào)配成濃度為0、0.125、0.250、0.375 g/mL的樣品溶液，灌胃量均為0.2 mL/10 g，每日灌胃1次，連續(xù)5 d，于首次給予受試物后的第13天，5組動物同時腹腔注射給予6 mg/kg劑量的秋水仙素1次，6 h后處死，取雙側(cè)睪丸制片，Giemsa染色，每組分析5只動物的染色體，每只動物分析100個中期相細胞，計算睪丸染色體畸變發(fā)生率(以百分率計)。

1.4.6 亞急性毒性實驗 選用體質(zhì)量60～80 g SPF級Wistar大鼠80只，雌雄各半，隨機分為3個樣品組及對照品組，每組20只，樣品飼喂劑量設(shè)計為：0、0.93、1.85、3.70 g/kg(分別相當(dāng)于未去除輔料成品人擬用劑量的0倍、25倍、50倍、100倍)，動物單籠喂養(yǎng)，自由飲食。連續(xù)30 d觀察實驗動物的一般情況，實驗結(jié)束禁食16 h后，處死動物并檢查實驗動物的體質(zhì)量、血液指標(biāo)、生化指標(biāo)以及臟器及胸、腹腔大體病理變化。各組數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0進行統(tǒng)計，方差分析方法進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 經(jīng)口急性毒性實驗

實驗結(jié)果顯示，14 d實驗期內(nèi)未見明顯的中毒表現(xiàn)和動物死亡，各主要臟器亦未見異常，說明受試物對兩種性別的大、小鼠的經(jīng)口最大耐受劑量(MTD)均大于15.0 g/kg，根據(jù)急性毒性分級，東方藥林牌骨碎補馬鹿茸片屬無毒類物質(zhì)。

2.2 Ames實驗

樣品各劑量組回變菌落數(shù)均未超過空白對照菌落數(shù)2倍；對鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100、TA102 4株實驗菌株，加與不加S9，回變菌落數(shù)均未超過空白對照組菌落數(shù)的2倍，Ames實驗中未見劑量-反應(yīng)關(guān)系，實驗結(jié)果為陰性，未出現(xiàn)基因突變情況。

2.3 小鼠骨髓細胞微核實驗

由表1可見，樣品各劑量組微核率與陰性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而環(huán)磷酰胺組與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明東方藥林牌骨碎補馬鹿茸片小鼠骨髓細胞微核實驗結(jié)果為陰性。

2.4 小鼠睪丸染色體畸變實驗

樣品各劑量組小鼠睪丸染色體畸變發(fā)生率均為0，與陰性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而絲裂霉素陽性對照組小鼠睪丸染色體畸變發(fā)生率為0.3%，與陰性對照組相比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明東方藥林牌骨碎補馬鹿茸片不會導(dǎo)致小鼠睪丸染色體畸變產(chǎn)生。

2.5 亞急性毒性實驗結(jié)果

2.5.1 一般情況觀察 以0.93、1.85、3.70 g/kg的劑量樣品飼料喂飼大鼠30 d期間，動物未出現(xiàn)拒食現(xiàn)象，一般情況表現(xiàn)良好。各組隨機選取10只動物的每周食物利用率、總食物利用率、體質(zhì)量和增重與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見圖1～圖4。

圖1 實驗期間大鼠的體質(zhì)量變化

圖2 實驗期間大鼠每周的進食量變化

圖3 實驗期間大鼠每周食物利用率

2.5.2 受試物對大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響 由表2、3可見，實驗?zāi)┢谘簩W(xué)的各項指標(biāo)中，僅雌性動物中劑量組紅細胞計數(shù)明顯高于對照組(P<0.05)，但均在本檢測單位正常值范圍內(nèi)。其余各劑量組的各項指標(biāo)與對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.5.3 受試物對大鼠生化指標(biāo)的影響 由表4可見，實驗?zāi)┢?，各劑量組實驗動物的各項生化指標(biāo)均在本檢測單位正常值范圍內(nèi)，各項指標(biāo)與空白對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.5.4 受試物對大鼠臟器的影響 受試物各劑量組動物的大體解剖檢查未發(fā)現(xiàn)異常和明顯病變，臟器質(zhì)量及臟體比值與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表5、6)(P>0.05)。

2.5.5 組織學(xué)檢查結(jié)果 試驗結(jié)束時，對各劑量組實驗動物進行大體檢查，通過鏡下觀察高劑量組與對照組，未發(fā)現(xiàn)與樣品相關(guān)的病理組織學(xué)改變，因此，選擇高劑量組和對照組，進行肝、腎、胃、十二指腸、脾臟、睪丸和卵巢的組織學(xué)檢查。個別受檢動物，肝臟匯管區(qū)可見少量小圓形炎細胞浸潤(對照組3/20，高劑量組2/20)、腎間質(zhì)可見少量小圓形炎細胞浸潤(對照組1/20，高劑量組2/20)，但兩組2種病變例數(shù)之間無顯著性差異，提示所出現(xiàn)的病變與受試物無關(guān)，可能是動物的自發(fā)病變。除此之外，胃、十二指腸、脾臟、睪丸和卵巢中均未見異常的病理改變，各劑量組動物臟器均未發(fā)現(xiàn)由受試物引起的損害性改變。

圖4 實驗期間大鼠的總增重、總進食量、總食物利用率變化

表2 受試物對大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響Table 2 Effect of test substance on hematological indexes in

表3 受試物對大鼠白細胞分類的影響

表4 受試物對大鼠生化指標(biāo)的影響Table 4 Effect of test substance on blood biochemical indexes in

表5 受試物對大鼠臟器質(zhì)量的影響

表6 受試物對大鼠臟體比的影響

3 討論

東方藥林牌骨碎補馬鹿茸片對2種性別的大、小鼠最大耐受劑量(MTD)均大于15.0 g/kg；3項遺傳毒性實驗結(jié)果均為陰性；30 d喂飼試驗期間，各組動物體質(zhì)量、增重、食物利用率及臟體比值與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；血液學(xué)指標(biāo)、生化指標(biāo)均在本檢測單位正常值范圍內(nèi)；大體解剖未發(fā)現(xiàn)與受試樣品相關(guān)的病理組織學(xué)改變。綜上所述，本產(chǎn)品對大、小鼠細胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)無致突變作用、無遺傳毒性和亞急性毒性，根據(jù)國家衛(wèi)生部相關(guān)分級標(biāo)準(zhǔn)判斷，東方藥林牌骨碎補馬鹿茸片屬于無毒級，是一種食用安全的保健食品。

骨碎補馬鹿茸片以淫羊藿、骨碎補、山茱萸、馬鹿茸四味經(jīng)典的補腎中藥材為主要原料，研究發(fā)現(xiàn)，補腎中藥具有促進成骨細胞的骨形成、抑制碎骨細胞的骨吸收的作用，能通過多種途徑防治骨質(zhì)疏松癥[7]。方中淫羊藿主要含有淫羊藿苷、總黃酮等生物活性成分[8]；淫羊藿治療股骨頭壞死具有多成分、多靶點的特點，其主要通路不僅直接參與骨重建的細胞增殖、凋亡及分化，調(diào)節(jié)成骨、破骨代謝平衡，還通過調(diào)節(jié)免疫、炎癥及應(yīng)激反應(yīng)等干預(yù)和影響骨微環(huán)境以達到控制疾病發(fā)生發(fā)展的目的，與目前治療股骨頭壞死的作用機制相符合[9]。補骨脂活性成分主要有香豆素類、黃酮類、萜酚類等，是抗骨質(zhì)疏松的主要活性物質(zhì)，具有促進成骨細胞的分化、增殖，促進骨形成的作用[10-11]。山茱萸的現(xiàn)代研究顯示，山茱萸總苷可調(diào)節(jié)骨質(zhì)疏松大鼠骨組織TRPV6、TRPV5、通道蛋白表達，改變TRPV6/TRPV5倍比關(guān)系，影響成骨細胞和破骨細胞功能，促進成骨方向的骨代謝轉(zhuǎn)變及提高骨密度[12]。鹿茸具有骨生長因子，能促進傷口愈合、組織修復(fù)，可能對股骨頭缺血性壞死具有治療作用，現(xiàn)代實驗研究結(jié)果提示鹿茸粉能通過增加骨形成、改善脂肪代謝和增加血管形成來治療激素誘導(dǎo)性股骨頭壞死[13]。以上內(nèi)容提示本產(chǎn)品具有改善骨質(zhì)疏松癥、增強骨密度的作用，本產(chǎn)品的研發(fā)順應(yīng)了人口老齡化的加劇、骨質(zhì)疏松癥多發(fā)的社會問題現(xiàn)狀，和如今社會對骨質(zhì)疏松癥的高度重視、藥物治療可能引起嚴重副作用、價格高等問題，通過合理地攝入增強骨密度功能食品來預(yù)防和延緩骨質(zhì)疏松的發(fā)生和發(fā)展、促進人體健康必不可少，可見本產(chǎn)品具有良好的開發(fā)前景，本研究也進一步證實了產(chǎn)品的安全性，為本產(chǎn)品的增強骨密度的功效及作用研究提供良好基礎(chǔ)，加速其研發(fā)速度，以降低骨質(zhì)疏松的發(fā)生和發(fā)展。本產(chǎn)品的研發(fā)理念為針對男女生理構(gòu)造和需要的不同而研發(fā)出男性專用的中元片和女性專用的欣月片，而要更好地確定本產(chǎn)品在增加骨密度、預(yù)防骨質(zhì)疏松發(fā)生的作用靶點和對男女之間是否存在明顯區(qū)別，還需要更深入的研究和探索，為產(chǎn)品的更好應(yīng)用提供證據(jù)。