付勝利， 劉海粟， 廖紹安*， 郭 政*

(1. 天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 天津 300384； 2. 華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院∥廣東省水產(chǎn)優(yōu)質(zhì)環(huán)保養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心， 廣州 510631)

暗紋東方鲀(Takifuguobscurus)屬硬骨魚綱，輻鰭亞綱，鱸形總目，鲀形目(Letrodontiforms)，鲀科(Terradontidae)，東方鲀屬(Takifugu)，在我國主要分布在東海、渤海、黃海以及長江中上游[1]，其味道鮮美，脂肪含量低，蛋白質(zhì)含量高，是享譽(yù)國內(nèi)外的“長江三鮮”之一[2]. 2016年9月我國出臺(tái)了新的河豚產(chǎn)品購銷政策，取消了對暗紋東方鲀和紅鰭東方鲀的限制性養(yǎng)殖，中國河豚市場初步開放，其人工養(yǎng)殖產(chǎn)量亦逐年增長，具有廣闊的開發(fā)和利用前景[3]. 隨著河豚養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，養(yǎng)殖面積不斷擴(kuò)大，集約化程度不斷提高，養(yǎng)殖水質(zhì)易惡化，在養(yǎng)殖過程中，魚病害頻發(fā)，對河豚養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失. 嗜水氣單胞菌作為一種廣泛存在于淡水、污水以及土壤中的病原菌，是我國危害養(yǎng)殖魚種類最多、影響區(qū)域最廣、流行季節(jié)最長、發(fā)病率和死亡率高、造成經(jīng)濟(jì)損傷最嚴(yán)重的細(xì)菌性病原之一，對我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的威脅[4-6].

在硬骨魚中，脾臟作為主要的免疫器官之一，也是紅細(xì)胞和各種粒細(xì)胞等產(chǎn)生、儲(chǔ)存和成熟的主要場所，可為魚體提供充足的血液和大量的免疫細(xì)胞[7-8]，其功能主要包括：清除大分子物質(zhì)，降解和呈遞抗原以及抗體生成等[9]. 當(dāng)硬骨魚受到外源刺激時(shí)，脾臟可以產(chǎn)生大量的黑色素巨噬細(xì)胞，它可以通過結(jié)合抗體和淋巴細(xì)胞來調(diào)節(jié)免疫功能[10]. 目前，對于暗紋東方鲀抵抗病原菌的研究較少，主要集中在基因表達(dá)層面上的探究[11-13]，而相對于基因組學(xué)，蛋白質(zhì)組學(xué)對生命現(xiàn)象的詮釋更直接、更準(zhǔn)確. 本研究采用TMT標(biāo)記、高效液相色譜(HPLC)分級技術(shù)以及基于質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，檢測病原菌感染暗紋東方鲀后脾臟蛋白的表達(dá)變化，分析其抵抗病原菌的關(guān)鍵蛋白和富集通路，為進(jìn)一步探究病原菌感染暗紋東方鲀的致病機(jī)理提供了一定的理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康暗紋東方鲀購于廣州市金洋水產(chǎn)有限公司，平均體質(zhì)量為45.4 ± 2.2 g，體長為9.2 ± 1.3 cm. 購買回來的暗紋東方鲀暫養(yǎng)2周，使其適應(yīng)養(yǎng)殖環(huán)境，暫養(yǎng)期間飼養(yǎng)于300 L/桶循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中，養(yǎng)殖循環(huán)水溫度為23～25 ℃，pH為7.5～7.7，氨氮的質(zhì)量濃度≤0.05 mg/L，溶解氧的質(zhì)量濃度≥6.0 mg/L，期間個(gè)體死亡率極低(≤0.5%).

1.2 主要試劑和儀器

碘代乙酰胺(Iodoacetamide)、二硫蘇糖醇(Dithiothreitol)、尿素(Urea)、三氯乙酸(Trichloroacetic Acid)、四乙基溴化銨(TEAB)購買于美國Sigma公司；1×磷酸緩沖鹽溶液(1×PBS)、RPMI-1640培養(yǎng)液購買于美國Gibco公司；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、Fluo-3 AM、BCA試劑盒購買于中國碧云天生物技術(shù)公司；TMT標(biāo)記試劑盒購買于德國Thermo公司； Easy nLc色譜系統(tǒng)、Q ExactiveTM質(zhì)譜儀、Multiskcan FC酶標(biāo)儀購買于德國Thermo公司；低溫高速離心機(jī)、真空離心濃縮儀購買于德國Eppendorf公司；勻漿儀購買于中國杭州米歐有限公司；AKTA Purifier 100純化儀購買于美國GE Healthcare公司；流式細(xì)胞儀購買于美國BD公司.

1.3 暗紋東方鲀感染及取樣

暗紋東方鲀致病菌嗜水氣單胞菌(BYK00810)(購買于水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海海洋大學(xué))經(jīng)活化計(jì)數(shù). 暗紋東方鲀分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，各50尾，實(shí)驗(yàn)組每尾注射100 μL菌液，菌液濃度為1×108CFU/mL[1]，對照組注射等體積無菌磷酸緩沖鹽溶液(PBS). 在注射后0、3、6、12、24、48、72 h各采集實(shí)驗(yàn)組和對照組脾臟，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各3尾，脾臟細(xì)胞用于流式細(xì)胞儀檢測. 另外，感染12 h時(shí)，采集實(shí)驗(yàn)組和對照組脾臟各5尾，-80 ℃凍存. 感染嗜水氣單胞菌后的暗紋東方鲀相對于健康暗紋東方鲀，游動(dòng)緩慢，肝臟充血.

1.4 脾臟細(xì)胞凋亡率

將取好的脾臟組織用2.5 mL注射器搗碎后通過75 μm一次性篩網(wǎng)過濾組織，細(xì)胞提取步驟參照本實(shí)驗(yàn)室潘訓(xùn)彬等[14]的實(shí)驗(yàn)方法，利用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡. 將脾臟細(xì)胞稀釋后計(jì)數(shù)，用無菌PBS稀釋至1×106個(gè)/mL，取200 μL細(xì)胞懸液，加入2.5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI工作液避光染色15 min，再加入50 μL 5×Annexin V 結(jié)合緩沖液后上機(jī)檢測.

1.5 胞內(nèi)游離Ca2+含量

以Fluo-3AM為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)游離的鈣離子含量. 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室XIAN等[15]的實(shí)驗(yàn)步驟. 取上述脾臟細(xì)胞懸液200 μL，加入10 μmol/L Fluo-3AM避光孵育30 min，1×PBS洗滌3次，每次500×g、4 ℃離心3 min，洗滌結(jié)束后用1×PBS懸浮細(xì)胞，上機(jī)檢測.

1.6 蛋白質(zhì)提取及酶解

取適量組織樣品，于研缽中充分研磨至粉末，期間不斷添加液氮制冷. 將粉末轉(zhuǎn)移至含有4倍體積裂解緩沖液(8 mol/L尿素，1%蛋白酶抑制劑)離心管中，超聲裂解后離心，離心條件：4 ℃，12 000 r/min，10 min，去除細(xì)胞碎片，上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管，利用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測定.

向蛋白溶液中添加終濃度為5 mmol/L的二硫蘇糖醇，56 ℃孵育30 min. 之后加入終濃度為11 mmol/L的碘代乙酰胺，室溫避光孵育15 min. 將樣品的尿素濃度稀釋至2 mol/L以下. 加入胰酶適量(m(胰酶)∶m(蛋白)=1∶50)，酶解過夜. 再加入胰酶適量(m(胰酶)∶m(蛋白)=1∶50)，酶解4 h.

1.7 TMT標(biāo)記和HPLC分級

將上述酶解蛋白用Strata X C18 (Phenomenex)除鹽后真空冷凍干燥. 然后用0.5 mol/L 四乙基溴化銨溶解，操作參照陳敏氡等[16]步驟.

將每組標(biāo)記后的肽段采用高pH反向HPLC分級，在Agilent 300 Extend C18 (5 μm粒徑，4.6 mm內(nèi)徑，250 mm長)中進(jìn)行分離. 操作如下：分級梯度為8%～32%乙腈，調(diào)整pH 9，60 min分離60個(gè)組分，然后肽段合并為18個(gè)組分，真空冷凍干燥后進(jìn)行后續(xù)操作.

1.8 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析

肽段用液相色譜流動(dòng)相A相(體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸水溶液)溶解后. 使用EASY-nLC 1000超高效液相系統(tǒng)進(jìn)行分離. 液相梯度設(shè)置：0～24 min 7%～25%；24～32 min 25%～40%；32～36 min 35%～80%；36～40 min 80%，流速維持在350 nL/min. 肽段用液相色譜流動(dòng)相A相(0.1%甲酸和2%乙腈的水溶液)溶解后進(jìn)行分離. 分離后的肽段注入NSI離子源中進(jìn)行電解，然后用Q ExactiveTM質(zhì)譜儀進(jìn)行分析. 具體分析步驟參照陳敏氡等[16]步驟.

1.9 數(shù)據(jù)庫搜索

用Maxquant(v1.5.2.8)檢索二次質(zhì)譜分析數(shù)據(jù). 檢索參數(shù)設(shè)置：數(shù)據(jù)庫為本實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)錄組(57 208條序列)，添加了反庫以計(jì)算隨機(jī)匹配造成的假陽性率(FDR)，并且在數(shù)據(jù)庫中加入了常見的污染庫，用于消除鑒定結(jié)果中的污染蛋白的影響，具體分析步驟參照陳敏氡等[16]步驟. 定量方法設(shè)置為TMT-6plex，蛋白鑒定、PSM鑒定的FDR都設(shè)置為1%. 依據(jù)蛋白質(zhì)豐度水平，以注射PBS組暗紋東方鲀脾臟為參考，將注射嗜水氣單胞菌12 h的暗紋東方鲀脾臟樣品與之比較，當(dāng)差異倍數(shù)≥1.3(上調(diào))或≤0.77(下調(diào))，且經(jīng)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)其P<0.05時(shí)，視為差異表達(dá)蛋白質(zhì).

1.10 生物信息學(xué)分析

Gene Ontology (GO)對蛋白組學(xué)層面的注釋來源于UniProt-GOA數(shù)據(jù)庫(www.http://www.ebi.ac.uk/GOA/). 首先，系統(tǒng)會(huì)將蛋白ID轉(zhuǎn)化為UniProt ID，之后用UniProt ID去匹配GO ID，并依據(jù)GO ID從UniProt-GOA數(shù)據(jù)庫中調(diào)取相應(yīng)的信息. 如果UniProt-GOA數(shù)據(jù)庫中沒有所查詢的蛋白信息，那么會(huì)使用InterProScan，去預(yù)測該蛋白的GO功能，通過KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫(http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)分析差異表達(dá)蛋白主要參與的生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑.

2 結(jié)果與分析

2.1 脾臟細(xì)胞凋亡率和胞內(nèi)游離鈣離子含量

利用流式細(xì)胞儀檢測感染嗜水氣單胞菌后的暗紋東方鲀脾臟細(xì)胞凋亡水平和細(xì)胞質(zhì)游離鈣離子含量變化，PBS組為對照. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖1)：感染3 h后脾臟細(xì)胞凋亡率升高，相對于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，在12 h達(dá)到最高值，為對照組的5.4倍，之后逐步下降(圖1A)，但仍極顯著高于對照組(P<0.01). 病原菌介導(dǎo)脊椎動(dòng)物細(xì)胞凋亡主要有2條途徑：一條是外在或死亡受體途徑，另一條是內(nèi)在或線粒體途徑，兩者相互關(guān)聯(lián)，最終通過含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)家族基因，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[1]. 暗紋東方鲀的Caspase家族基因的結(jié)構(gòu)和功能有待進(jìn)一步分析.

感染6 h后，脾臟細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中游離鈣離子含量顯著上調(diào)，差異極顯著(P<0.01)，在12、24 h達(dá)到最大值，分別為對照組的3.74、3.71倍，之后逐步下調(diào)(圖1B)，72 h后仍極顯著高于對照組(P<0.01). 胞內(nèi)鈣離子來源主要包括胞外的鈣離子內(nèi)流和鈣庫的鈣離子外流[17]，硬骨魚的鈣離子信號通路與病原菌感染之間的關(guān)系有待進(jìn)一步探究.

圖1 感染嗜水氣單胞菌后暗紋東方鲀的脾臟細(xì)胞凋亡水平和細(xì)胞質(zhì)游離鈣離子含量變化Figure 1 The apoptosis level of spleen cells and the concentration of free Ca2+ in the cytoplasm of T. obscurus after infection with A. hydrophila

2.2 差異表達(dá)蛋白的統(tǒng)計(jì)及分析

2.2.1 差異表達(dá)蛋白統(tǒng)計(jì) 本實(shí)驗(yàn)通過光譜儀獲得的光譜數(shù)188 618，與對比蛋白匹配的光譜數(shù)32 913，獲得肽段21 588個(gè)，鑒定到蛋白4 133個(gè)，包括定量蛋白3 672個(gè). 以差異倍數(shù)值變化超過1.3倍作為顯著上調(diào)、小于1/1.3作為顯著下調(diào)的變化標(biāo)準(zhǔn)，獲得差異表達(dá)蛋白306個(gè)，其中120個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào)，186個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)，其中和免疫相關(guān)的差異蛋白有整合素β1(ITGB1)、血漿血管性血友病因子(VWF)、Ⅰ型膠原α1(COL1A)、CD44、免疫球蛋白重鏈(IGH)、1，3，4-三磷酸肌醇5/6激酶(InsP3)、CD38、經(jīng)典蛋白激酶Cβ型(PRKCB)、一氧化氮合成酶(NOS1)、磷脂酰肌醇磷脂酶C(PLCD).

2.2.2 差異表達(dá)蛋白的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位分析 使用Wolfpsort軟件對差異表達(dá)蛋白進(jìn)行了亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的預(yù)測和分類統(tǒng)計(jì)，從結(jié)果(表1)中可以看出：上調(diào)蛋白和下調(diào)蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)中的比例最高，分別占22%和27%，上調(diào)蛋白定位在細(xì)胞膜和線粒體中也較多，而下調(diào)蛋白則定位在細(xì)胞核和胞外的較多.

表1 上調(diào)和下調(diào)差異表達(dá)蛋白的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位分布情況Table 1 The location of subcellular structures of up- and down-regulated expression proteins

2.2.3 差異表達(dá)蛋白的GO注釋 對差異表達(dá)蛋白的生物進(jìn)程、細(xì)胞組成和分子功能進(jìn)行分析(表2、表3)，結(jié)果表明：差異表達(dá)蛋白參與的主要生物進(jìn)程有8個(gè)，上調(diào)蛋白參與最多的生物進(jìn)程是代謝過程，下調(diào)蛋白參與最多的是細(xì)胞進(jìn)程；從差異蛋白所屬細(xì)胞組分(5個(gè))來看，上調(diào)蛋白以細(xì)胞膜上蛋白居多，下調(diào)蛋白以細(xì)胞中蛋白居多；在主要分子功能(4個(gè))方面，上調(diào)蛋白和下調(diào)蛋白均以結(jié)合功能和催化活性為最多.

表2 上調(diào)蛋白在GO二級注釋中的分布情況Table 2 The distribution of up-regulated expression proteins in GO annotation

表3 下調(diào)蛋白在GO二級注釋中的分布情況Table 3 The distribution of down-regulated expression proteins in GO annotation

2.2.4 差異表達(dá)蛋白的功能富集分析 將GO注釋中除了一級三大類之外的條目進(jìn)行了富集分析(圖2). 細(xì)胞組分上，上調(diào)蛋白主要富集到6個(gè)，其中胞外區(qū)富集最多，而下調(diào)蛋白主要富集到8個(gè)，其中核糖核蛋白復(fù)合體富集最多；分子功能上，上調(diào)蛋白和下調(diào)蛋白各富集到8個(gè)類別，其中上調(diào)蛋白主要富集到鈣離子結(jié)合、羧酸酯水解酶活性、果糖二磷酸醛糖酶活性、醛裂合酶活性、脂結(jié)合蛋白、氧化還原酶活性、血紅素結(jié)合、四吡咯結(jié)合等功能，下調(diào)蛋白主要富集到結(jié)構(gòu)分子活動(dòng)、核糖體的結(jié)構(gòu)組成、細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)組成、三價(jià)鐵離子結(jié)合、黃素單核苷酸結(jié)合、水解酶活性、鐵離子結(jié)合、肌動(dòng)蛋白結(jié)合等功能；生物進(jìn)程上，上調(diào)蛋白富集到12條生物進(jìn)程，包括碳水化合物代謝過程、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、多元醇代謝過程等進(jìn)程，下調(diào)蛋白富集到14條生物進(jìn)程，包括翻譯、細(xì)胞酰胺代謝過程、肽生物合成過程等進(jìn)程.

圖2 差異表達(dá)蛋白的GO富集結(jié)果Figure 2 The GO enrichment results of DEPs

差異表達(dá)蛋白KEGG通路富集結(jié)果顯示(圖3)：上調(diào)蛋白主要富集到和代謝相關(guān)通路上，如葉酸合成、精氨酸和脯氨酸代謝、組氨酸代謝、煙酸和煙酰胺代謝、藥物代謝；而下調(diào)蛋白主要富集到核糖體、視黃醇代謝、鈣離子信號通路、ECM受體相互作用、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路. 其中和免疫相關(guān)通路主要是鈣離子信號通路和ECM受體相互作用，注釋到這2條通路上的差異蛋白具體見表4和表5.

圖3 差異表達(dá)蛋白的KEGG通路富集結(jié)果Figure 3 The KEGG pathway enrichment of DEPs

表4 嗜水氣單胞菌感染暗紋東方鲀后脾臟和免疫相關(guān)表達(dá)上調(diào)的差異蛋白Table 4 The immune-related up-regulated DEPs in spleen of pufferfish after A. hydrophila infection

表5 嗜水氣單胞菌感染暗紋東方鲀后脾臟和免疫相關(guān)表達(dá)下調(diào)的差異蛋白Table 5 The immune-related down-regulated DEPs in spleen of pufferfish after A. hydrophila infection

2.3 差異蛋白的PRM驗(yàn)證

選取4個(gè)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行PRM驗(yàn)證，其中包括1個(gè)上調(diào)表達(dá)蛋白ITGB1和3個(gè)下調(diào)表達(dá)蛋白IGH、CD38、COL1A(表6). 結(jié)果顯示：蛋白質(zhì)組測序和PRM結(jié)果一致，說明本次測序具有一定可靠性.

表6 PRM實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證差異表達(dá)蛋白Table 6 The confirmation of DEPs detected in PRM analysis

3 討論

本實(shí)驗(yàn)利用TMT蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，探究了暗紋東方鲀感染嗜水氣單胞菌前后脾臟組織蛋白質(zhì)表達(dá)變化. 實(shí)驗(yàn)共篩選到306個(gè)差異表達(dá)蛋白，其中120個(gè)差異蛋白上調(diào)，186個(gè)差異蛋白下調(diào)；從中篩選4個(gè)和免疫相關(guān)的差異表達(dá)蛋白(1個(gè)上調(diào)，3個(gè)下調(diào))，利用PRM試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，表達(dá)結(jié)果一致. 對免疫相關(guān)的差異蛋白進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：上調(diào)蛋白有整合素β1、血漿血管性血友病因子，下調(diào)蛋白有Ⅰ型膠原α1、CD44、免疫球蛋白重鏈、1,3,4-三磷酸肌醇5/6激酶、CD38、經(jīng)典蛋白激酶Cβ型、一氧化氮合成酶、磷脂酰肌醇磷脂酶C.

整合素β1(ITGB1)是整合素家族的跨膜蛋白，作為主要的細(xì)胞黏附分子和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)相關(guān)分子，其激活的下游通路參與了多種細(xì)胞功能的調(diào)控，包括增值、存活、遷移和分化[18]. 對小菜蛾(Plutellaxylostella)ITGB1基因進(jìn)行克隆表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其在昆蟲免疫的包囊作用中起到重要作用，表明ITGB1蛋白在小菜蛾血細(xì)胞免疫過程中發(fā)揮重要作用[19]. 在稀有鮈鯽(Gobiocyprisrarus)的研究表明：ITGB1的缺失對凋亡相關(guān)基因的表達(dá)有一定影響，同時(shí)降低了草魚腸孤病毒(GCRV)的進(jìn)入效率[20]. 暗紋東方鲀受到嗜水氣單胞菌感染后脾臟ITGB1蛋白表達(dá)量上調(diào)，說明其可能參與了暗紋東方鲀抵抗病原菌感染過程，其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步探究.

血漿血管性血友病因子(VWF)是一種重要的血漿成分，參與血小板的黏附和聚集過程[21]. 斑馬魚中的研究表明，斑馬魚血小板聚集過程中VWF表達(dá)上調(diào)[22]. 暗紋東方鲀受到嗜水氣單胞菌感染后脾臟VWF蛋白表達(dá)量上調(diào)，說明嗜水氣單胞菌感染后可能造成暗紋東方鲀血小板聚集進(jìn)而導(dǎo)致血管堵塞.

CD44是一種細(xì)胞表面糖蛋白，存在于許多正常細(xì)胞，主要是淋巴細(xì)胞和上皮細(xì)胞[23]. 通過多種途徑廣泛參與細(xì)胞-細(xì)胞/基質(zhì)間黏附、細(xì)胞內(nèi)外信號傳導(dǎo)及淋巴細(xì)胞歸巢等重要功能[24]，其多種生理活性表現(xiàn)在多種疾病的病理中，暴露癌癥、關(guān)節(jié)炎、細(xì)菌和病毒感染等[25]. 目前，硬骨魚中CD44相關(guān)研究未見報(bào)道. 在哺乳動(dòng)物中，有研究表明，CD44可以通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞中的CCL2的表達(dá)來調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移，TNF-α可以顯著提高細(xì)胞中CD44的表達(dá)[26]；CD44與糖胺聚糖透明質(zhì)酸(HA)相互作用可介導(dǎo)白細(xì)胞遷移和活化[27]；利用CD44缺失小鼠，確定了CD44在炎癥部位白細(xì)胞募集中的作用，同時(shí)揭示了CD44在限制炎癥反應(yīng)和解決炎癥方面的作用[28]. 暗紋東方鲀受到嗜水氣單胞菌感染12 h后脾臟CD44蛋白表達(dá)量下調(diào)，其基因和蛋白水平動(dòng)力學(xué)變化有待進(jìn)一步確定，其功能有待進(jìn)一步探究.

鈣離子是細(xì)胞內(nèi)最古老、作用最廣泛的信號物質(zhì)，鈣離子參與細(xì)胞增殖、分化、生長、衰老等生命活動(dòng)的信息傳遞與調(diào)控，并在各種生理活動(dòng)中起著十分重要的作用[29-30]. 細(xì)胞質(zhì)鈣離子來源主要有2個(gè)：一個(gè)是胞外鈣離子內(nèi)流，另一個(gè)是細(xì)胞器鈣離子外流[31]. 胞外鈣離子內(nèi)流存在3種機(jī)制：(1)配體結(jié)合觸發(fā)的鈣離子跨膜流動(dòng)，即受體門控性鈣通道(ROCs)；(2)細(xì)胞膜去極化激活電壓門控性鈣通道(VOCs)導(dǎo)致的鈣內(nèi)流；(3)當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子耗竭，為了補(bǔ)充鈣離子不足，儲(chǔ)存開啟性鈣通道(SOCs)開放，促使鈣離子大量內(nèi)流. 胞內(nèi)鈣離子外流是指鈣庫(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或肌質(zhì)網(wǎng))中鈣離子通過鈣離子釋放通道1，4，5-三磷酸肌醇(InsP3)受體和Ryanodine受體(RyR)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)[30]. 鈣庫中鈣儲(chǔ)量下降時(shí)，鈣離子可以從細(xì)胞外進(jìn)入細(xì)胞，這一過程在基因表達(dá)調(diào)控以及免疫反應(yīng)中都發(fā)揮著重要作用[29]. 鈣離子外排主要有Na+/Ca2+交換體可協(xié)助鈣離子從細(xì)胞中排出和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的Ca2+-ATP酶(SERCA)、線粒體上的MCU將細(xì)胞質(zhì)鈣離子攝入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或線粒體中[32-33]. 暗紋東方鲀脾臟感染病原菌后，鈣離子信號通路相關(guān)蛋白如免疫球蛋白重鏈(IGH)、CD38、ITPK、PRKCB、NOS1和PLCD均發(fā)生下調(diào)，而流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量在6 h開始出現(xiàn)顯著上調(diào)(圖1B)，可能是由于病原菌進(jìn)入后與細(xì)胞表面BCR結(jié)合后激活了初始鈣離子信號通路[34]. CD38催化環(huán)腺苷二磷酸核糖(cADPR)合成，通過作用于魚尼丁受體(RyR)參與細(xì)胞內(nèi)鈣庫的鈣動(dòng)員[35]，其表達(dá)量的下調(diào)說明病原菌感染后暗紋東方鲀胞內(nèi)鈣離子濃度的上調(diào)可能主要是胞外鈣離子內(nèi)流導(dǎo)致的. 鈣離子信號通路相關(guān)蛋白在抵抗病原菌中的功能有待進(jìn)一步研究.

綜上所述，本研究應(yīng)用TMT蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，定量分析了暗紋東方鲀感染嗜水氣單胞菌后脾臟蛋白質(zhì)組的表達(dá)變化，并對差異表達(dá)蛋白在參與的生物學(xué)過程、分子功能、亞細(xì)胞定位以及富集通路等進(jìn)行了歸納整理，并深入分析了免疫相關(guān)蛋白功能，為揭示嗜水氣單胞菌的分子致病機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ).