湯威威 趙宏 孔令洲 高琪 焦瑩瑩 張宇 吳麗麗 沈宇 王宇亮

摘 要 目的：揭示沙棘治療阿爾茨海默病（AD）的作用機(jī)制，為進(jìn)一步探究沙棘治療AD的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供理論參考。方法：通過TCMSP、Uniprot、GeneCards等數(shù)據(jù)庫篩選沙棘活性成分、靶點(diǎn)及AD相關(guān)靶點(diǎn)基因;采用Cytoscope 3.7.1軟件構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖;通過STRING數(shù)據(jù)庫制作靶點(diǎn)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，篩選度值較高的沙棘治療AD的潛在靶點(diǎn)與沙棘活性成分進(jìn)行分子對(duì)接;采用Clue GO插件對(duì)沙棘治療AD的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO基因本體（GO）分析、京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。取50只小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組[D-半乳糖120 mg/（kg·d）及AlCl3溶液20 mg/（mL·d）]、陽性藥物組[奧拉西坦260 mg/（kg·d）]、沙棘果油提取物組[1.6 g/（kg·d）]、沙棘多酚提取物組[1.6 g/（kg·d）]，每組10只。各組小鼠分別灌胃相應(yīng)藥物的同時(shí)灌胃造模劑，空白組灌胃等體積蒸餾水，每天1次，連續(xù)給藥60 d。通過Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)定各組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測(cè)小鼠海馬體組織免疫因子水平，采用蘇木素-伊紅染色（HE）法觀察海馬體的病理學(xué)變化，對(duì)沙棘治療AD的作用機(jī)制進(jìn)行初步驗(yàn)證。結(jié)果：沙棘22個(gè)活性成分（槲皮素、山柰酚、異鼠李素、β-胡蘿卜素、β-谷固醇等）可能通過調(diào)控絲氨酸/蘇氨酸激酶編碼蛋白（AKT1）、氨基端激酶 （JUN）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK1）等147個(gè)靶點(diǎn)影響核受體活性、脂多糖介導(dǎo)的信號(hào)通路等生物過程及白細(xì)胞介素17（IL-17）信號(hào)傳導(dǎo)途徑、腫瘤壞死因子（TNF）信號(hào)傳導(dǎo)途徑等114條代謝通路。分子對(duì)接結(jié)果顯示，沙棘主要活性成分與主要靶點(diǎn)蛋白結(jié)合分值均在4.25以上，具有較好的結(jié)合活性。藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沙棘提取物能夠使AD模型小鼠的逃避潛伏期縮短、穿越平臺(tái)次數(shù)增加，減輕其腦海馬體組織損傷，降低其腦海馬體組織中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17含量。結(jié)論：沙棘的活性成分可調(diào)控AD發(fā)病重要通路中的多個(gè)靶點(diǎn);動(dòng)物實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證其可通過抑制炎癥因子的表達(dá)，來減輕AD模型小鼠海馬體損傷，改善小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

關(guān)鍵詞 沙棘;阿爾茨海默病;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);分子對(duì)接

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To explore the mechanism of Hippophae rhamnoides in the treatment of Alzheimers disease （AD）， and to provide theoretic reference for further exploring the material basis. METHODS： TCMSP， Uniprot， GeneCards database were used to screen the active components of H. rhamnoides， targets and AD-related target gene. The “ingredients-targets-related diseases” network was constructed by Cytoscape 3.7.1 software. STRING database was adopted to construct protein interaction （PPI） network， molecular docking was conducted between the potential targets with high degree values and active components of H. rhamnoides. The gene ontology （GO） analysis and Kyoto encyclopedia of genes and genomes （KEGG） pathway enrichment analysis were performed by Clue GO for the potential target of H. rhamnoides in the treatment of AD. Totally 50 mice were randomly divided into blank group， model group [D-galactose 120 mg/（kg·d）， AlCl3 solution 20 mg/（mL·d）]， positive ? ? ? ? ?drug group [oxiracetam 260 mg/（kg·d）]， seabuckthorn oil extract group [1.6 g/（kg·d）]， seabuckthorn polyphenols group ? ? ? ?[1.6 g/（kg·d）]， with 10 mice in each group. ?The mice was given relevant medicine intragastrically and modeling agent; blank group was given constant volume of distilled water intragastrically， once a day， for consecutive 60 d. The learning and memory abilities were detected by Morris water maze test; the levels of immune factors in hippocampus tissue were measured by ELISA. Pathological morphology of hippocampus tissue was observed by HE staining. The mechanism of H. rhamnoides in the treatment of AD was validated preliminarily. RESULTS： Totally 22 active components of H. rhamnoides （quercetin， kaempferol， isorhamnetin， β-carotene， β-sitosterol） may affect biological processes such as nuclear receptor activity， lipopolysaccharide-mediated signal pathway， and may affect 114 methabolism pathways such as IL-17 signal transduction pathway， TNF signal transduction pathway by regulating 147 targets such as serine/threonine kinase coding protein （AKT1）， amino terminal kinase （JUN） and mitogen activated protein kinase （MAPK1）. The results of molecular docking showed that binding scores of the main active components of H. rhamnoides and the main target proteins were all above 4.25， which showed good binding activity. Results of pharmacology experiment showed that H. rhamnoides extract could shorten the escape latency of AD model mice， increased the times of crossing platform， relieved hippocampus injury of cerebral tissue， and decreased the contents of inflammatory factors TNF-α， IL-1β， IL-6 and IL-17 in hippocampus of cerebral tissue. CONCLUSIONS： The active components of H. rhamnoides can regulate multiple targets in the important pathway of AD; animal experiments preliminarily verify that H. rhamnoides can relieve the hippocampus injury and improve the learning and memory ability of AD model mice by inhibiting the expression of inflammatory factors.

KEYWORDS ? Hippophae rhamnoides; Alzheimers disease; Network pharmacology; Molecular ?docking

阿爾茨海默病（Alzheimers disease，AD）是一種嚴(yán)重威脅老年人生命健康的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。目前，全世界約有5 000萬人患有AD，且患病人數(shù)逐年上升，預(yù)計(jì)到2050年AD患病人數(shù)會(huì)增加3倍以上[1]。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為，AD歸屬于中醫(yī)“呆病”“神呆”“善忘”的范疇，其病機(jī)涉及脾胃虛弱、氣血虛衰、痰瘀交阻、氣血凝滯等[2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，AD發(fā)病機(jī)制與氧化應(yīng)激、膽堿能損傷、神經(jīng)炎癥等相關(guān)[3-5]。目前，治療AD的藥物主要為膽堿酯酶抑制劑，如多奈哌齊、美金剛等單一靶點(diǎn)藥物，治療效果不顯著，因此尋找高效低毒、便于長(zhǎng)期服用、有效延緩或治愈AD的新型藥物已成為研究者的首要目標(biāo)[6]。

傳統(tǒng)中藥及其提取物具有安全、不良反應(yīng)少等特點(diǎn)，已被用于治療AD新藥的研發(fā)，并顯示出良好的效果[7]。沙棘是胡頹子科植物沙棘Hippophae rhamnoides L.的干燥成熟果實(shí)，味酸、澀，性溫，歸脾、胃、肺、心經(jīng)，常用于脾虛食少、咳嗽痰多、瘀血經(jīng)閉、跌撲瘀腫的治療[8]。據(jù)《民族藥成方制劑》記載，沙棘的成方制劑吉祥安神丸具有補(bǔ)氣安神作用;《蒙醫(yī)金匱》中記載有沙棘十七味散，主治胃、腎、肝等臟腑之瘀血癥，與中醫(yī)治療AD患者時(shí)使用增補(bǔ)氣血、化瘀血、充盈腦髓的藥物相符[9]。本課題組前期研究表明，沙棘中含有多酚、油脂等活性成分，具有抗氧化、抗AD等作用[10]。因此，沙棘抗AD的作用，可能與其補(bǔ)氣健脾、化痰祛濁、活血化瘀的藥效相關(guān)[11-13]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是利用計(jì)算機(jī)科學(xué)、分子生物學(xué)、藥學(xué)等學(xué)科的成果，對(duì)傳統(tǒng)中藥成分的潛在靶點(diǎn)、藥理作用進(jìn)行多基因、多靶點(diǎn)、多途徑的系統(tǒng)研究，可為中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究提供新的思路[14]。分子對(duì)接則是通過受體特征及受體與藥物分子之間的相互作用方式來預(yù)測(cè)其結(jié)合模式和親合力的一種理論模擬方法[15]。本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對(duì)接法對(duì)沙棘治療AD的分子機(jī)制進(jìn)行研究，闡明沙棘活性成分治療AD的藥理作用機(jī)制并進(jìn)行初步的藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，為沙棘在治療AD方面的應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

FA2004型電子分析天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）;Morris 水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）;FC型酶標(biāo)儀[賽默飛世爾（上海）儀器有限公司];XH-C型漩渦混合器（無錫萊浦儀器設(shè)備有限公司）;JJ-12J型脫水機(jī)、JB-L7型包埋機(jī)（武漢俊杰電子有限公司）;RM2016型病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）;XSP-13C-LP型顯微鏡（上海精密儀器儀表有限公司）。

1.2 藥品與試劑

氯化鋁（AlCl3，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：170814，分析純）;D-半乳糖（北京化學(xué)試劑公司，批號(hào)：1711016，分析純）;奧拉西坦膠囊（石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司，批號(hào)：485180416，規(guī)格：0.4 g/粒） ;腫瘤壞死因子α（TNF-α）試劑盒（批號(hào)：2018011）、白細(xì)胞介素 ? 1β（IL-1β）試劑盒（批號(hào)：2011104）、IL-6試劑盒（批號(hào)：2018031）、IL-10試劑盒（批號(hào)：2017125）均購自碧云天生物科技公司。

沙棘購于佳木斯民生藥行（批號(hào)：180312），經(jīng)佳木斯大學(xué)藥學(xué)院張宇教授鑒定為胡頹子科植物沙棘H. rhamnoides L.的干燥果實(shí)，經(jīng)石油醚回流提取，經(jīng)高溫水化法脫膠、高溫淡堿法脫酸、活性白土脫色精制后，得沙棘果油提取物。沙棘用71%乙醇提取，得沙棘多酚提取物（多酚含量：56.25%）。以上提取物由佳木斯大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供并測(cè)定。

1.3 動(dòng)物

清潔級(jí)KM小鼠60只，6周齡，體質(zhì)量18 g～22 g，購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（黑）2014-003。小鼠飼養(yǎng)于SPF 級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。

2 方法

2.1 沙棘活性成分與相應(yīng)靶點(diǎn)基因收集與篩選

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）數(shù)據(jù)庫（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）中，以“沙棘”為關(guān)鍵詞，以類藥性（DL）≥0.18、口服生物利用度（OB）≥30%為條件對(duì)化學(xué)成分進(jìn)行篩選，獲取沙棘活性成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)信息，然后在 ?UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）獲取靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)基因名，并下載活性成分的三維結(jié)構(gòu)文件，得到沙棘的主要活性成分[16]。

2.2 沙棘活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

以“Alzheimers disease”為關(guān)鍵詞，通過人類基因平臺(tái)（GeneCards）數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）獲取AD的相關(guān)靶點(diǎn)，使用R語言中Venny程序映射活性成分、預(yù)測(cè)靶點(diǎn)和疾病相關(guān)靶點(diǎn)，獲得沙棘與AD的交集靶點(diǎn)，即為沙棘治療AD的潛在靶點(diǎn)。將“2.1”項(xiàng)下獲得的沙棘活性成分與沙棘治療AD的潛在靶點(diǎn)，導(dǎo)入生物信息分析軟件Cytoscape 3.7.1，構(gòu)建沙棘活性成分-AD靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)（Node）表示靶點(diǎn)或化合物，邊（Edge）表示活性成分與疾病之間相互作用。復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)中心性可用于衡量節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中影響能力大小，以判斷節(jié)點(diǎn)的重要性。其中，度值為重要參數(shù)，度值越高代表該成分或靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的位置越重要。

2.3 沙棘治療AD靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將“2.2”項(xiàng)下映射后的沙棘治療AD的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入蛋白質(zhì)相互作用（STRING）數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），將最低相互作用閾值調(diào)整為“中置信度（Medium confidence）”，其值為0.400，其余參數(shù)選擇默認(rèn)設(shè)置，獲得靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系數(shù)據(jù)，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件中以“Network analyzer”插件制作靶點(diǎn)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)[17]。選擇度值排名靠前的沙棘治療AD的潛在靶點(diǎn)作為關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接。

2.4 分子對(duì)接

篩選“2.3”項(xiàng)下的關(guān)鍵靶點(diǎn)與“2.1”項(xiàng)下的沙棘活性成分，導(dǎo)入SYBYL-X 2.1軟件（https：//en.freedownloadmanager.org/Windows-PC/SYBYL-X.html）中進(jìn)行分析、預(yù)測(cè)，評(píng)價(jià)沙棘活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)之間的結(jié)合活性，并以分值來評(píng)價(jià)其結(jié)合活性：分值>4.25表示兩者有一定的結(jié)合活性，分值>5.0表明有較強(qiáng)的結(jié)合活性，分值>7.0表明具有很強(qiáng)的結(jié)合活性[18]。

2.5 GO分析與KEGG通路富集分析

將“2.2”項(xiàng)下沙棘治療AD的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件，使用“Clue GO”插件進(jìn)行基因本體（Gene ontology，GO）分析、京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and gnomes，KEGG）通路富集分析。以P<0.05表示信號(hào)通路為顯著富集。

2.6 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.6.1 分組、造模及給藥 選取50只小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組[皮下注射5% D-半乳糖溶液，120 mg/（kg·d）;灌胃AlCl3溶液，20 mg/（mL·d）]、陽性藥物組[奧拉西坦，260 mg/（kg·d）]、沙棘果油提取物組[按2015年版《中國(guó)藥典》[8]人用劑量折算為小鼠等效劑量，即相當(dāng)于生藥量1.6 g/（kg·d）;下同]、沙棘多酚提取物組[相當(dāng)于生藥量1.6 g/（kg·d）]，每組10只。各組小鼠分別灌胃，給予相應(yīng)藥物的同時(shí)給予造模劑，空白組給予等體積的蒸餾水，每天1次，連續(xù)給藥治療60 d。

2.6.2 各組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力檢測(cè) 采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。（1）定位航行實(shí)驗(yàn)：給藥結(jié)束后，以小鼠面向池壁放入水中至找到平臺(tái)時(shí)間為逃避潛伏期。實(shí)驗(yàn)時(shí)間設(shè)置為120 s，若超時(shí)未找到平臺(tái)，則引導(dǎo)小鼠至平臺(tái)停留片刻，將其逃避潛伏期計(jì)為120 s。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行5 d，每天訓(xùn)練1次，于第5天記錄小鼠逃避潛伏期。（2）空間探索實(shí)驗(yàn)：于水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)第6天撤去水池中的平臺(tái)，將小鼠面向池壁放入無平臺(tái)的水池中自由游泳。實(shí)驗(yàn)時(shí)間設(shè)置為120 s，記錄120 s內(nèi)小鼠穿越原來平臺(tái)位置的次數(shù)[19]。

2.6.3 各組小鼠血清中免疫因子檢測(cè)和海馬體組織病理學(xué)變化觀察 采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法和蘇木精-伊紅（HE）染色檢測(cè)。水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組小鼠禁食、自由飲水24 h。然后將小鼠脫頸處死后，于冰臺(tái)上迅速剝離大腦并取出海馬體。取海馬體的一半，制成10%海馬組織勻漿液，4 ℃下以1 000 r/min離心10 min，取上清液于4 ℃下保存，嚴(yán)格按試劑盒說明書測(cè)定海馬組織勻漿中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10的水平。另一半海馬體用4%多聚甲醛固定，采用HE法染色，于100倍顯微鏡下進(jìn)行圖像采集分析，觀察其病理結(jié)構(gòu)[20]。

2.6.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 沙棘活性成分與其作用靶點(diǎn)

經(jīng)DL≥0.18、OB≥30%條件篩選，獲得沙棘活性成分33個(gè)，刪除無對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)信息的活性成分后得到22個(gè)活性成分，主要包括多酚及油脂類成分，例如槲皮素、山柰酚、異鼠李素、β-胡蘿卜素、β-谷固醇等，結(jié)果詳見表1。22個(gè)活性成分共對(duì)應(yīng)423個(gè)作用靶點(diǎn)，刪除重復(fù)靶點(diǎn)后剩余213個(gè)作用靶點(diǎn)，包括AKT1、JUN、MAPK8、MAPK14等。

3.2 沙棘活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

由GeneCards數(shù)據(jù)庫得到8 731個(gè)AD相關(guān)基因，經(jīng)R語言Venny映射，得到147個(gè)沙棘治療AD的潛在靶點(diǎn)。建立的沙棘活性成分-AD靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖中共包括171個(gè)節(jié)點(diǎn)及450條邊，其中槲皮素、山柰酚、β-胡蘿卜素、異鼠李素、β-谷甾醇、豆甾醇的度值較高，為主要活性成分，結(jié)果詳見圖1（圖中，一個(gè)活性成分可對(duì)應(yīng)多個(gè)靶點(diǎn)，如槲皮素對(duì)應(yīng)IL-6、IL-1β、JUN等;一個(gè)靶點(diǎn)也可與多個(gè)活性成分相對(duì)應(yīng)，如JUN對(duì)應(yīng)槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇等）。

3.3 PPI網(wǎng)絡(luò)

采用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建的沙棘治療AD靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖共包括129個(gè)節(jié)點(diǎn)及514條邊，圖中度值越大則節(jié)點(diǎn)顏色越深。度值排名靠前的靶點(diǎn)有AKT1、JUN、MAPK1、轉(zhuǎn)錄因子p65 （RELA）、IL-6、MAPK8、MAPK14、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、c-fos原癌基因蛋白（FOS），結(jié)果詳見圖2。

3.4 分子對(duì)接結(jié)果

分子對(duì)接結(jié)果顯示，沙棘主要活性成分與主要靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合分值均在4.25以上，部分分值超過5.0、接近7.0;β-胡蘿卜素對(duì)接JUN、MAPK1的分值甚至超過了7.0，表明其具有很強(qiáng)的結(jié)合活性，結(jié)果詳見表2。

3.5 GO分析和KEGG代謝通路富集分析結(jié)果

將147個(gè)沙棘治療AD的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，主要包括分子功能、細(xì)胞組成和生物過程3個(gè)部分。結(jié)果，上述靶點(diǎn)的分子功能集中于激活轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、抑制轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等;其細(xì)胞組成與小窩等相關(guān)性較大;主要參與了細(xì)胞對(duì)活性氧的反應(yīng)、核受體活性、脂多糖介導(dǎo)的信號(hào)通路、神經(jīng)遞質(zhì)的生物合成過程等生物過程，結(jié)果詳見圖3。

在KEGG代謝通路富集分析中，共富集到114條相關(guān)代謝通路（P<0.05），包括Toll樣受體（TLRs）信號(hào)通路、IL-17信號(hào)傳導(dǎo)途徑、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白信號(hào)通路等，結(jié)果詳見圖4。

3.6 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.6.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與空白組比較，模型組小鼠逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)（P<0.01），穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少（P<0.05），表明模型組小鼠出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶障礙，造模成功;與模型組比較，陽性藥物組、沙棘果油提取物組和沙棘多酚提取物組小鼠逃避潛伏期顯著縮短（P<0.05或P<0.01），穿越平臺(tái)次數(shù)顯著增加（P<0.05或P<0.01），結(jié)果詳見表3。

3.6.2 大鼠海馬體病理學(xué)觀察結(jié)果 空白組小鼠海馬體細(xì)胞排列整齊、緊密，細(xì)胞層次較多、結(jié)構(gòu)清楚，細(xì)胞核形態(tài)完整、染色正常;模型組小鼠海馬體細(xì)胞分布較稀疏、排列較散亂，出現(xiàn)大面積細(xì)胞壞死，有大量空泡，細(xì)胞核著色較深;與模型組比較，各給藥組小鼠海馬體細(xì)胞排列整齊、緊密，細(xì)胞層次增多，局部有少量細(xì)胞核染色加深，未出現(xiàn)空泡，細(xì)胞整體狀態(tài)較好，結(jié)果詳見圖5。

3.6.3 小鼠海馬體組織中免疫因子檢測(cè)結(jié)果 與空白組比較，模型組小鼠海馬體組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17水平顯著升高（P<0.05）;與模型組比較，陽性藥物組、沙棘果油提取物組及沙棘多酚提取物組上述水平含量顯著降低（P<0.05或P<0.01），結(jié)果見表4。

4 討論

在傳統(tǒng)中醫(yī)治療中，對(duì)癡呆病癥的認(rèn)識(shí)相對(duì)較早，但是缺乏系統(tǒng)性的診斷標(biāo)準(zhǔn)[21]。中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是融合系統(tǒng)生物學(xué)、生物信息學(xué)、計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)分析技術(shù)、蛋白組學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域的新興學(xué)科，可通過計(jì)算機(jī)構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)模型對(duì)中藥的整體作用進(jìn)行分析，為中藥的有效性和科學(xué)性提供理論科學(xué)基礎(chǔ)，同時(shí)一步闡釋中藥多靶點(diǎn)協(xié)同作用的特點(diǎn)[22]。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)沙棘抗AD的作用機(jī)制進(jìn)行探討，發(fā)現(xiàn)沙棘抗AD共有22個(gè)活性成分，包括槲皮素、山柰酚、異鼠李素、β-谷甾醇、豆甾醇、β-胡蘿卜素等。清代陳士鐸在《辨證錄》中指出：“治呆無奇法，治痰即治呆”，在中醫(yī)治療中考慮對(duì)AD患者化痰祛濁的治療[23]。李學(xué)堅(jiān)等[24]研究發(fā)現(xiàn)，芒果苷有抗炎和祛痰作用，槲皮素有抗炎作用但無祛痰作用，但兩藥在祛痰實(shí)驗(yàn)中有明顯的協(xié)同效應(yīng)，槲皮素能明顯提高芒果苷的祛痰藥效。因此，沙棘在治療AD過程中，其活性成分槲皮素或可與其他成分相互作用而發(fā)揮化痰祛濁的作用。AD患者多由于年老體虛、肝血不足、血虛精少導(dǎo)致脾胃虛弱、氣血虛衰，因而在AD的臨床治療中應(yīng)當(dāng)注意對(duì)患者氣血的補(bǔ)充。邊亞倩等[25]基于系統(tǒng)中藥學(xué)的黃芪補(bǔ)氣潛在功效標(biāo)志物的研究，發(fā)現(xiàn)異鼠李素可通過改善物質(zhì)代謝、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等方面發(fā)揮補(bǔ)氣功效。因此，沙棘在治療AD過程中，其活性成分異鼠李素可能發(fā)揮補(bǔ)氣健脾作用。可見，對(duì)于瘀血內(nèi)阻而氣血精微不能上榮于元神者，治宜活血化瘀、醒腦開竅。趙文竹[26]在對(duì)玉米須功能因子活性評(píng)價(jià)及其降血糖機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，甾醇類化合物具有抗凝血作用。因此，沙棘在治療AD過程中，其活性成分豆甾醇或?qū)l(fā)揮活血化瘀作用。

本研究對(duì)沙棘活性成分作用靶點(diǎn)與AD 疾病靶點(diǎn)進(jìn)行了交集分析，共發(fā)現(xiàn)147個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，這147個(gè)靶點(diǎn)可能是沙棘治療AD的靶點(diǎn)。結(jié)合PPI網(wǎng)絡(luò)與分子對(duì)接結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AKT1、JUN、MAPK1、RELA、IL-6、MAPK8、MAPK14、EGFR、FOS是網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵靶點(diǎn)，且與沙棘活性成分具有較好的結(jié)合活性。其中，AKT1作為一種絲氨酸/蘇氨酸激酶編碼蛋白，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中是一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)控因子，用于神經(jīng)細(xì)胞調(diào)節(jié)，而AKT1的氧化修飾可導(dǎo)致突觸功能障礙，導(dǎo)致AD患者產(chǎn)生認(rèn)知功能障礙[27]。MAPK可傳導(dǎo)細(xì)胞膜受體信號(hào)到細(xì)胞核，參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元增殖、凋亡等，其與學(xué)習(xí)記憶能力聯(lián)系緊密，可調(diào)控與AD密切相關(guān)的病理機(jī)制如神經(jīng)毒性、神經(jīng)炎癥和突觸功能障礙等[28]。因此，以上靶點(diǎn)可能在沙棘治療AD中發(fā)揮重要作用。

GO富集分析結(jié)果顯示，從分子功能富集結(jié)果來看，沙棘治療AD主要體現(xiàn)為激活轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合;從細(xì)胞組成富集結(jié)果來看，沙棘治療AD主要體現(xiàn)在小窩;從生物過程富集結(jié)果來看，沙棘治療AD主要體現(xiàn)為細(xì)胞對(duì)活性氧的反應(yīng)、核受體活性、脂多糖介導(dǎo)的信號(hào)通路。這提示沙棘治療AD呈現(xiàn)多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的作用特點(diǎn)。

KEGG代謝通路富集結(jié)果顯示，沙棘治療AD涉及的信號(hào)通路包括TLRs信號(hào)通路、IL-17信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白信號(hào)通路等。TLRs是天然免疫受體，TLRs家族中的TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可通過髓樣分化因子88的激活和相應(yīng)的下游效應(yīng)因子，使核因子κB（NF- ? κB）的抑制因子IκB磷酸化，從而活化NF-κB，啟動(dòng)相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄[29]。NF-κB是最重要的轉(zhuǎn)錄因子之一，具有多向性轉(zhuǎn)錄激活功能，可參與炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等多種生理病理過程[30]。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白家族可通過Trk酪氨酸激酶受體結(jié)合發(fā)揮作用。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白/Trk信號(hào)通路通過連接多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)，對(duì)于神經(jīng)發(fā)育、學(xué)習(xí)記憶起著重要作用[31]。因此，推測(cè)沙棘活性成分可通過抑制TLRs家族中TLR4信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，減少NF-κB信號(hào)通路下游的炎性因子（如IL-1β、IL-6、TNF-α）等的分泌;同時(shí)還可抑制IL-17信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，降低IL-17含量;激活神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白信號(hào)通路，增加神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白因子含量，發(fā)揮抗AD作用。結(jié)合分子對(duì)接和KEGG代謝通路富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沙棘治療AD是通過炎癥相關(guān)通路及炎癥因子發(fā)揮著重要作用，因此后續(xù)需通過體內(nèi)藥理實(shí)驗(yàn)對(duì)炎癥相關(guān)通路進(jìn)行驗(yàn)證。

本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，沙棘提取物對(duì)AlCl3聯(lián)合D-gal所致AD模型小鼠有積極影響：在水迷宮試驗(yàn)中，沙棘提取物能夠使模型小鼠的逃避潛伏期縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)增加，提高其學(xué)習(xí)記憶能力;組織病理學(xué)觀察結(jié)果顯示，沙棘提取物能使模型小鼠的腦海馬體組織損傷減輕;機(jī)制研究顯示，沙棘提取物能夠降低模型小鼠腦海馬體組織中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17含量，該結(jié)果與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果一致。

綜上所述，本研究初步預(yù)測(cè)了沙棘治療AD的活性成分、靶點(diǎn)以及信號(hào)通路，其中活性成分可調(diào)控多個(gè)靶點(diǎn)，關(guān)鍵靶點(diǎn)同時(shí)參與多個(gè)重要信號(hào)通路的調(diào)控，體現(xiàn)出沙棘多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同作用的特點(diǎn);同時(shí)，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證了沙棘可通過抑制炎癥因子的表達(dá)，來減輕AD模型小鼠海馬體損傷，改善小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。本課題組將以此結(jié)果為理論基礎(chǔ)，對(duì)沙棘的活性成分及治療AD的藥理機(jī)制進(jìn)行深入研究，為沙棘治療AD機(jī)制的進(jìn)一步研究及其相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供依據(jù)。

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（收稿日期：2020-04-13 修回日期：2020-09-07）

（編輯：羅 瑞）