許燁 李志明 遠方

摘 要 目的：研究四君子湯對慢性腎臟病-蛋白質(zhì)能量消耗（CKD-PEW）模型小鼠骨骼肌萎縮的改善作用，并探討其可能的作用機制。方法：將80只小鼠隨機分為假手術(shù)組（n=10）和造模組（n=70）。造模組小鼠采用切除5/6腎聯(lián)合低蛋白（4%酪蛋白）飲食法建立CKD-PEW模型。將造模成功的50只小鼠隨機分為模型組，四君子湯低、中、高劑量組[2.34、4.68、9.36 g/（kg·d），以生藥量計]和復方α-酮酸片組[陽性對照，1 g/（kg·d）]，每組10只。各給藥組小鼠灌胃相應藥物，假手術(shù)組和模型組小鼠灌胃等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)灌胃14 d。末次給藥后，稱定小鼠體質(zhì)量、左側(cè)脛骨前?。═A）濕質(zhì)量，并測定TA橫截面積;檢測小鼠TA蛋白合成與分解代謝情況;采用實時熒光定量-聚合酶鏈式反應法檢測小鼠TA中B淋巴細胞瘤2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）及胱天蛋白酶3（Caspase-3） mRNA表達水平;采用Western blotting法檢測小鼠TA中肌萎縮蛋白Fbox-1（Atrogin-1）、肌環(huán)指蛋白1（MuRF-1）、Rho相關(guān)蛋白激酶1（ROCK1）、磷酸化腫瘤抑制基因（p-PTEN）、磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）及磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）蛋白的表達水平。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組小鼠的體質(zhì)量、TA濕質(zhì)量、TA蛋白合成代謝能力以及PI3K、p-Akt蛋白表達水平顯著降低（P<0.05），TA橫截面積顯著減小（P<0.05），TA蛋白分解代謝能力、Bax/Bcl-2比值、Caspase-3 mRNA表達水平和Atrogin-1、MuRF-1、ROCK1、p-PTEN蛋白表達水平顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，四君子湯中、高劑量組和復方α-酮酸片組小鼠上述指標均顯著改善（P<0.05）。結(jié)論：四君子湯能夠增加CKD-PEW模型小鼠體質(zhì)量，抑制其骨骼肌萎縮;其機制可能與調(diào)控ROCK1/PTEN/Akt信號通路，抑制Atrogin-1和MuRF-1表達有關(guān)。

關(guān)鍵詞 四君子湯;慢性腎臟病;蛋白質(zhì)能量消耗;Rho相關(guān)蛋白激酶1;磷酸化腫瘤抑制基因;磷脂酰肌醇-3-激酶;蛋白激酶B;小鼠

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To study the improvement effects of Sijunzi decoction on skeletal muscle atrophy in chronic kidney disease-protein energy wasting （CKD-PEW） model mice， and to explore its potential mechanism. METHODS： A total of 80 mice were randomly divided into sham operation group （n=10） and modeling group （n=70）. CKD-PEW model was established by removing 5/6 kidneys and giving a low-protein diet （4% casein） for mice in modeling group. Totally 50 modeled mice were randomly divided into model group， Sijunzi decoction low-dose， medium-dose and high-dose groups [2.34， 4.68， 9.36 g/（kg·d），by crude drug]， Compound α-ketoacid tablets group [positive control， 1 g/（kg·d）]， with 10 mice in each group. Administration groups were given relevant medicine intragastrically; sham operation group and model group were given constant volume of normal saline intragastrically， once a day， for consecutive 14 d. After last medication， body weight of mice and wet mass of left tibialis anterior muscle （TA） were weighed; TA cross-sectional area was determined; protein synthesis and decomposition metabolism ability of TA were detected; mRNA expressions of Bcl-2， Bax and Caspase-3 in TA were detected by Real-time PCR; protein expressions of muscular dystrophin Fbox-1 （Atrogin-1）， myofloin-1 （MuRF-1）， Rho-related protein kinase 1 （ROCK1）， phosphorylated PTEN （p-PTEN）， phosphatidylinositol-3-kinase （PI3K） and phosphorylated Akt （p-Akt） in TA were detected by Western blotting. RESULTS： Compared with the sham operation group， the body weight， TA wet weight， protein synthesis metabolism ability of TA as well as protein expressions of PI3K and p-Akt were decreased significantly in model group （P<0.05）; the cross-sectional area of TA decreased significantly （P<0.05）; protein decomposition metabolism ability of TA， Bax/Bcl-2 ratio， Caspase-3 mRNA expression， protein expressions of Atrogin-1， MuRF-1， ROCK1 and p-PTEN were increased significantly （P<0.05）. Compared with model group， above indexes of mice were all improved significantly in Sijunzi decoction medium-dose， high-dose groups and Compound α-ketoacid tablets group （P<0.05）. CONCLUSIONS： Sijunzi decoction can increase the body weight of CKD-PEW model mice and alleviate the skeletal atrophy; the mechanism may be related to regulating ROCK1/PTEN/Akt signaling pathway activity， inhibiting the expression of Atrogin-1 and MuRF-1.

KEYWORDS ? Sijunzi decoction; Chronic kidney disease; Protein energy wasting; Rho-related protein kinase 1; PTEN; Phosphatidylinositol-3-kinase; Akt; Mice

慢性腎臟?。–hronic kidney disease，CKD）是一個嚴重的公共健康問題，其發(fā)病率逐年增高，且有年輕化的趨勢[1]。CKD常伴有多種代謝性紊亂，其中將近50%的患者會出現(xiàn)營養(yǎng)不良，導致蛋白質(zhì)能量消耗（Protein energy wasting，PEW），主要表現(xiàn)為肌肉萎縮、體質(zhì)量下降、血清白蛋白水平降低等，這不僅影響了患者的生存質(zhì)量、降低了其治療耐受性，而且還是造成CKD患者死亡的主要誘因之一[2]。中醫(yī)學認為，CKD歸屬“水腫”“慢腎風”“尿血”“腰痛”等范疇，病機主要與脾、腎、肺有關(guān)[3]。有研究認為，CKD以脾、腎虧虛為主，脾虛導致陽氣不升、谷氣下流，因此CKD的中醫(yī)治療多以健脾為主[4]。

四君子湯是益氣健脾的代表方劑，出自《太平惠民和劑局方》，由人參、茯苓、白術(shù)和甘草4味中藥組成。本課題組前期將四君子湯應用于脾腎兩虛型CKD患者的治療，發(fā)現(xiàn)其可明顯改善CKD患者PEW狀態(tài)[5]，但是其作用機制尚未闡明。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，Rho相關(guān)蛋白激酶1（ROCK1）/人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因（PTEN）/蛋白激酶B（Akt）信號通路具有調(diào)節(jié)CKD-PEW模型骨骼肌發(fā)育與蛋白質(zhì)代謝的能力，其主要組成蛋白ROCK1、PTEN、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）及Akt的活性變化對CKD-PEW疾病進展具有重要影響，是CKD患者PEW狀態(tài)的潛在干預靶點[6-7]。鑒于此，本課題組擬通過研究四君子湯對CKD-PEW模型小鼠骨骼肌ROCK1/PTEN/Akt信號通路及其下游蛋白的影響，探討其改善CKD相關(guān)PEW的可能作用機制，為四君子湯用于CKD-PEW患者的治療提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Triathler型液體閃爍及發(fā)光測定儀（京樂自然基因生命科學有限公司）;Ti-S型熒光倒置顯微鏡（日本Nikon公司）;RM2235型石蠟切片機（德國Leica公司）;7500型實時熒光定量-聚合酶鏈式反應（PCR）儀（美國ABI公司）;Mini-Sub Cell GT Cell型電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 藥品與試劑

四君子湯（由遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院藥劑科提供，批號：201801014，規(guī)格：每1 mL含生藥量為0.5 g）;復方α-酮酸片（北京費森尤斯卡比醫(yī)藥有限公司，批號：U1430，規(guī)格：0.63 g/片）;酪蛋白（廣東捷倍斯生物科技公司，批號：201803214）;Masson染色試劑盒（北京索萊寶生物技術(shù)有限公司，批號：20190623）;B淋巴細胞瘤2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、胱天蛋白酶3（Caspase-3）、β-肌動蛋白（β-actin）引物購于上海生工生物技術(shù)有限公司;HiFiScript cDNA 第一鏈合成試劑盒、UltraSYBR Mix（北京康為世紀生物技術(shù)有限公司，批號：201712135-01、201801012-03）;兔源肌萎縮蛋白Fbox-1（Atrogin-1）、肌環(huán)指蛋白1（MuRF-1）、ROCK1、PTEN、磷酸化PTEN（p-PTEN）、PI3K、Akt、磷酸化Akt（p-Akt）、β-actin抗體（美國CST公司，批號：CST4041T、CST6367T、CST4035T、CST9188S、CST9551S、CST4249S、CST582- 95S、CST9614S、CST4970S）;總蛋白提取試劑盒、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒（北京碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：121017200621、0106201700628）;辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗兔IgG二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號：2018001005）;酪氨酸標準品（美國Sigma公司，批號：209-113-1，純度：99%）;14+C-苯丙氨酸（中國原子能科學研究院）;其他試劑均為國產(chǎn)分析純或?qū)嶒炇页Ｓ靡?guī)格，水為蒸餾水。

1.3 動物

SPF級C57BL/6雄性小鼠80只，6～8周齡，體質(zhì)量18～20 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2016-0002]。小鼠飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學實驗動物中心實驗室[恒溫（22±4） ℃、恒濕（60±5）%、明暗時間各12 h]，自由飲食。本研究實驗方案得到了遼寧中醫(yī)藥大學實驗動物福利倫理委員會批準。

2 方法

2.1 造模

采用切除5/6腎聯(lián)合低蛋白飲食法建立CKD-PEW模型。利用3.5%水合氯醛麻醉小鼠后，將其背部左側(cè)毛發(fā)剃除，用碘伏進行消毒處理。用干凈紗布將剃毛處四周遮住，露出手術(shù)區(qū)域，并用剪刀剪開一個小口，逐層剝離，暴露腎臟，擠出左側(cè)腎臟并剝離腎臟兩極組織，分離腎蒂周圍及結(jié)締組織，完全游離左腎;從上至腎門約0.4 cm、下至腎門約0.4 cm預置縫合線，勒緊縫合線并切除兩極腎臟組織;7 d后暴露右側(cè)腎臟，止血鉗夾緊腎門處并緊靠血管夾下方放置縫合線，在血管夾上方切除腎臟，縫合并消毒手術(shù)切口，以復制CKD模型。假手術(shù)組小鼠同期進行手術(shù)，僅剝離腎包膜，不切除腎組織。術(shù)后，用棉簽壓迫法止血，縫合傷口并涂上碘伏消毒，將小鼠放入鼠籠飼養(yǎng)。手術(shù)1周后對CKD造模小鼠分別給予4%酪蛋白飲食飼養(yǎng)至實驗結(jié)束，以建立CKD-PEW模型;假手術(shù)組給予正常飲食。通過比較各組小鼠體質(zhì)量、肌酐、尿素氮、白蛋白及24 h尿蛋白水平判斷模型制備是否成功[8]。

2.2 分組與給藥

將80只小鼠分為假手術(shù)組（n=10）和造模組（n=70），分別按照“2.1”項下方法進行假手術(shù)或者CKD-PEW造模。將造模成功的50只小鼠隨機分為模型組，四君子湯低、中、高劑量組[2.34、4.68、9.36 g/（kg·d），以生藥量計;根據(jù)成人（60 kg）臨床等效劑量的1、2、4倍換算]和復方α-酮酸片組[陽性對照，1 g/（kg·d）;根據(jù)成人（60 kg）臨床等效劑量換算]，每組10只。小鼠灌胃給藥，每天給藥1次，連續(xù)給藥14 d;假手術(shù)組和模型組小鼠同法灌胃等體積生理鹽水。

2.3 樣本采集及處理

在末次給藥1 h后，稱定小鼠體質(zhì)量;然后利用3.5%水合氯醛麻醉小鼠后，剪開小鼠皮膚，迅速分離出完整的左側(cè)脛骨前?。═ibialis anterior，TA），稱量并記錄TA濕質(zhì)量。將一半TA樣本量（n=5）用4%多聚甲醛固定，用于測量TA橫截面積。另一半TA樣本量（n=5）取部分新鮮組織立即用于蛋白合成和分解代謝檢測;剩余組織置于-80 ℃冰箱中保存，用于凋亡相關(guān)基因mRNA表達和Atrogin-1、MuRF-1及ROCK1/PTEN/Akt信號通路相關(guān)蛋白表達的檢測。

2.4 TA橫截面積測定

取出4%多聚甲醛固定的TA，流水沖洗數(shù)小時后，分別經(jīng)70%、80%、90%、100%乙醇脫水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各透明15 min，再放入石蠟Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中分別浸蠟60 min，并進行連續(xù)切片（5 μm）。切片脫蠟水化，Weigert鐵蘇木素染色液染色5～10 min，酸性乙醇分化5～15 s，流水洗3 min;Masson藍化液返藍3～5 min，流水洗3 min;水洗1 min，麗春紅酸性品紅染色液染色5～10 min;弱酸工作液洗1 min，磷鉬酸溶液洗1～2 min，弱酸工作液洗1 min，放入苯胺藍染色液中染色1～2 min;弱酸工作液洗1 min，95%乙醇快速脫水，無水乙醇分別脫水10 s×3次，二甲苯透明5 min×3次，中性樹膠封片。將切片置于倒置顯微鏡下觀察，并利用Image pro plus 6.0軟件計算TA橫截面積。

2.5 TA蛋白合成代謝能力檢測

將新鮮的TA置于DMEM培養(yǎng)基（5 mL）中，37 ℃下充氧孵育30 min，然后在含放射性同位素14+C-苯丙氨酸的DMEM培養(yǎng)基中繼續(xù)孵育1 h，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗5 min×3次，隨后制備50% TA勻漿液，加入10%三氨乙酸（TCA）沉淀蛋白質(zhì);吸棄上清，加入0.5 mol/L NaOH溶液溶解沉淀的蛋白。取1.8 mL該蛋白溶液加入閃爍液進行液閃計數(shù)，取0.2 mL該蛋白溶液利用BCA試劑盒進行蛋白濃度檢測，檢測單位時間內(nèi)（1 h）摻入的14+C-苯丙氨酸的放射性含量，分析蛋白合成代謝能力[8]。

2.6 TA蛋白分解代謝能力檢測

將新鮮的TA置于KRB緩沖液中，37 ℃下充氧孵育2 h，取該孵育液用10%TCA沉淀，取上清0.5 mL與1.0 mL 5%TCA混合均勻，依次加入0.75 mL硝酸、0.75 mL一氧化二氮，混合均勻，55 ℃下孵育30 min;隨后加入2 mL雙氯乙烯萃取，吸取上清液200 μL至96孔板中，利用酶標儀在450 nm波長處讀取吸光度值，根據(jù)前期繪制的標準曲線[以不同濃度（0～1 nmol/L）酪氨酸為橫坐標、吸光度值為縱坐標]，計算TA蛋白分解代謝能力[8]。

2.7 TA中凋亡相關(guān)基因mRNA表達檢測

采用實時熒光定量-PCR法檢測TA中Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表達水平。采用Trizol法提取小鼠TA中總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作合成cDNA，然后以cDNA為模板采用兩步法進行PCR擴增。反應體系（共 20 μL）：cDNA 2 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，2×Top Green qPCR SuperMix 10 μL，ddH2O 7.2 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min;95 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，共40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法測定目的基因mRNA的表達水平（式中Ct表示目標擴增產(chǎn)物達到設定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)），并計算Bax、Bcl-2 mRNA表達水平的比值（Bax/Bcl-2）。引物序列及擴增產(chǎn)物長度見表1。

2.8 TA中Atrogin-1、MuRF-1及ROCK1/PTEN/Akt信號通路相關(guān)蛋白表達的檢測

采用Western blotting法進行檢測。利用總蛋白提取試劑盒提取小鼠TA中總蛋白，根據(jù)BCA試劑盒測定蛋白濃度。加入蛋白上樣緩沖液，進行蛋白變性，然后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳（100 V、1.5 h），濕法轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上（250 mA 、90 min）;TBST緩沖液洗膜5 min×3次，5%脫脂牛奶封閉1 h;分別加入Atrogin-1、MuRF-1、ROCK1、PTEN、p-PTEN、PI3K、Akt、p-Akt及β-actin一抗（稀釋度均為1 ∶ 1 000），4 ℃孵育過夜;次日，TBST緩沖液洗膜5 min×3次，加入二抗（稀釋度為1 ∶ 1 000），室溫孵育1 h;經(jīng)ECL化學發(fā)光顯色后，使用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。采用Image J 1.8.0軟件對圖像光密度進行分析，以目的蛋白條帶與內(nèi)參β-actin條帶的光密度比值表示目的蛋白的相對表達水平，以p-PTEN/PTEN、p-Akt/Akt的光密度比值表示PTEN、Akt蛋白的磷酸化水平。

2.9 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。試驗數(shù)據(jù)均以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠體質(zhì)量和TA濕質(zhì)量測定結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠體質(zhì)量、TA濕質(zhì)量顯著降低（P<0.05）;與模型組比較，四君子湯中、高劑量組和復方α-酮酸片組小鼠體質(zhì)量、TA濕質(zhì)量均顯著升高（P<0.05），且均顯著高于四君子湯低劑量組（P<0.05）;四君子湯中、高劑量組和復方α-酮酸片組之間小鼠體質(zhì)量、TA濕質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。各組小鼠體質(zhì)量、TA濕質(zhì)量測定結(jié)果見表2。

3.2 小鼠TA橫截面積測定結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠TA明顯萎縮，肌纖維變細，橫截面積顯著減?。≒<0.05）;與模型組比較，四君子湯中、高劑量組和復方α-酮酸片組小鼠TA肌纖維變粗，橫截面積顯著增大（P<0.05），且四君子湯高劑量組和復方α-酮酸片組小鼠TA橫截面積顯著大于四君子湯低劑量組（P<0.05）;四君子湯中、高劑量組和復方α-酮酸片組之間小鼠TA橫截面積差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。各組小鼠的TA橫截面顯微圖見圖1，橫截面積測定結(jié)果見表3。

3.3 小鼠TA蛋白合成與分解代謝能力測定結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠TA單位時間內(nèi)蛋白質(zhì)合成代謝能力顯著減弱、分解代謝能力顯著增強（P<0.05）;與模型組比較，四君子湯中、高劑量組和復方α-酮酸片組小鼠TA單位時間內(nèi)蛋白質(zhì)合成代謝能力顯著增強、分解代謝顯著減弱（P<0.05）;與四君子湯低劑量組比較，四君子湯高劑量組和復方α-酮酸片組小鼠單位時間內(nèi)蛋白質(zhì)合成代謝能力顯著增強、分解代謝顯著減弱（P<0.05）;四君子湯中、高劑量組和復方α-酮酸片組之間小鼠TA單位時間內(nèi)蛋白合成與分解代謝能力差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。各組小鼠單位時間內(nèi)蛋白合成與分解代謝能力測定結(jié)果見表4。

3.4 小鼠TA中凋亡相關(guān)基因mRNA表達水平測定結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠TA中Bax/Bcl-2比值和Caspase-3 mRNA表達水平顯著升高（P<0.05）;與模型組比較，四君子湯中、高劑量組和復方α-酮酸片組小鼠TA中Bax/Bcl-2比值和Caspase-3 mRNA表達水平顯著降低（P<0.05）;與四君子湯低劑量組比較，四君子湯中、高劑量組和復方α-酮酸片組小鼠TA中Bax/Bcl-2比值和Caspase-3 mRNA表達水平顯著降低（P<0.05）;四君子湯中、高劑量組和復方α-酮酸片組之間小鼠TA中Bax/Bcl-2比值和Caspase-3 mRNA表達水平差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。各組小鼠TA中Bax/Bcl-2比值和Caspase-3 mRNA表達水平測定結(jié)果見表5。

3.5 小鼠TA中Atrogin-1、MuRF-1蛋白表達水平測定結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠TA中Atrogin-1、MuRF-1 蛋白表達水平顯著升高（P<0.05）;與模型組比較，四君子湯中、高劑量組和復方α-酮酸片組小鼠TA中Atrogin-1、MuRF-1蛋白表達水平顯著降低（P<0.05）;與四君子湯低劑量組比較，四君子湯中、高劑量組和復方α-酮酸片組小鼠TA中Atrogin-1、MuRF-1蛋白表達水平顯著降低（P<0.05）;四君子湯中、高劑量組和復方α-酮酸組之間小鼠TA中Atrogin-1、MuRF-1蛋白表達水平差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。各組小鼠TA中Atrogin-1、MuRF-1蛋白表達電泳圖見圖2，蛋白表達水平測定結(jié)果見表6。

3.6 小鼠TA中ROCK1/PTEN/Akt信號通路相關(guān)蛋白表達水平測定結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠TA中ROCK1蛋白表達水平、p-PTEN/PTEN比值顯著升高（P<0.05），PI3K蛋白表達水平、p-Akt/Akt比值顯著降低（P<0.05）;與模型組比較，四君子湯中、高劑量組和復方α-酮酸片組小鼠TA中ROCK1蛋白表達水平、p-PTEN/PTEN 比值顯著降低（P<0.05），PI3K蛋白表達水平、p-Akt/Akt比值顯著升高（P<0.05）;與四君子湯低劑量組比較，四君子湯中、高劑量組和復方α-酮酸片組小鼠TA中ROCK1蛋白表達水平、p-PTEN/PTEN 比值顯著降低（P<0.05），PI3K蛋白表達水平、p-Akt/Akt比值顯著升高（P<0.05）;四君子湯中、高劑量組和復方α-酮酸片組之間小鼠TA中上述指標差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。各組小鼠TA中ROCK1/PTEN/Akt信號通路相關(guān)蛋白表達電泳圖見圖3，蛋白表達水平測定結(jié)果見表7。

4 討論

肌肉萎縮是伴隨著CKD的治療同步發(fā)生的一種并發(fā)癥。有研究表明，超過半數(shù)的血液透析CKD患者存在PEW狀態(tài)[9]。而肌肉萎縮是CKD患者PEW的主要表現(xiàn)形式，也可作為預測CKD患者預后的重要指標之一。CKD-PEW患者大多會缺乏必需氨基酸，復方α-酮酸片不僅可以直接補充必需氨基酸，并且可與體內(nèi)的氨基結(jié)合生成必需氨基酸，使體內(nèi)蛋白質(zhì)合成代謝增加，改善營養(yǎng)狀況[10]，故本研究選用復方α-酮酸片作為陽性對照藥。四君子湯具有補氣、益氣健脾之功效，杜紅蓮等[11]的研究結(jié)果證實了四君子湯能夠改善脾腎兩虛型CKD患者的腎功能。為了探討四君子湯對CKD患者PEW的作用，本課題組通過5/6腎切除法構(gòu)建CKD小鼠模型，同時根據(jù)CKD患者PEW的臨床特點，給予4%酪蛋白飲食建立了CKD-PEW小鼠模型[12]。結(jié)果顯示，四君子湯給藥14 d后，CKD-PEW模型小鼠體質(zhì)量和TA濕質(zhì)量減輕、TA橫截面積減小的情況有不同程度改善，且四君子湯還能夠升高模型小鼠TA蛋白合成代謝、降低其蛋白分解代謝，這說明四君子湯對CKD-PEW模型小鼠的骨骼肌萎縮具有一定的緩解作用。

CKD-PEW引起的代謝性酸中毒、胰島素抵抗、炎癥反應、血管緊張素Ⅱ分泌增多等因素均可激活 Caspase-3 及泛素蛋白酶體系統(tǒng)（Ubiquitin proteasome system，UPS），導致肌肉萎縮[13]。有研究表明，在CKD-PEW模型大鼠中骨骼肌嚴重萎縮，同時肌纖維中促凋亡基因Bax、Caspase-3表達上調(diào)，而抗凋亡基因Bcl-2表達顯著下調(diào)，說明線粒體凋亡途徑在骨骼肌蛋白能量消耗過程中具有重要作用[14]。本研究結(jié)果顯示，給予四君子湯治療14 d后，CKD-PEW模型小鼠TA中Bax/Bcl-2比值和Caspase-3 mRNA表達水平顯著降低，說明四君子湯可抑制骨骼肌細胞凋亡，從而緩解肌肉萎縮。在CKD中，P13K/Akt信號通路受損是引起骨骼肌蛋白質(zhì)丟失的主要原因。該信號通路受損后繼發(fā)UPS激活，繼而引起Atrogin-1和MuRF-1的表達升高，這是骨骼肌萎縮的經(jīng)典機制[15-16]。因此，骨骼肌組織中的Atrogin-1和MuRF-1的表達量可作為衡量肌肉蛋白質(zhì)分解代謝情況的生物學標志[17]。本研究結(jié)果顯示，四君子湯治療14 d后，CKD-PEW模型小鼠TA中Atrogin-1和MuRF-1的蛋白表達水平均顯著降低，說明四君子湯可通過抑制UPS的激活來減輕CKD-PEW小鼠的骨骼肌萎縮。

Caspase-3也是參與蛋白降解的蛋白酶，可切割肌球蛋白和肌原纖維蛋白，并切割特定的19S蛋白酶體亞基，加速26S蛋白酶體的降解，而且Caspase-3能夠切除ROCK1 的C端半胱氨酸結(jié)構(gòu)域而使其活化[18]?；罨腞OCK1能夠增強PTEN磷酸化，而活化的PTEN又可抑制PI3K/Akt的活性，從而促進蛋白降解，引起肌肉萎縮[19]。有研究發(fā)現(xiàn)，敲低ROCK1水平可抑制PTEN活性，從而負調(diào)控PI3K與p-Akt蛋白的表達，并通過下調(diào)Atrogin-1和MuRF-1表達來調(diào)控肌肉蛋白質(zhì)代謝[20]。另有研究運用 ROCK1的抑制劑法舒地爾干預CKD模型小鼠后發(fā)現(xiàn)，法舒地爾可使CKD模型小鼠的肌肉質(zhì)量顯著提升、體質(zhì)量顯著增長，故推測其是通過抑制ROCK1來降低PTEN活性、激活Akt來降低Atrogin-1 和 MuRF-1 表達，從而抑制蛋白質(zhì)分解代謝、延緩肌肉萎縮[21]?？梢姡琑OCK1/PTEN/Akt途徑在骨骼肌萎縮的發(fā)生發(fā)展中具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)，四君子湯治療14 d后，CKD-PEW模型小鼠TA中ROCK1、p-PTEN蛋白表達水平顯著降低，而PI3K與p-Akt蛋白表達水平顯著升高，說明四君子湯也可通過調(diào)控ROCK1/PTEN/Akt信號通路，抑制Atrogin-1和 MuRF-1表達，來改善CKD-PEW模型小鼠的骨骼肌萎縮。

綜上所述，四君子湯可增加CKD-PEW模型小鼠體質(zhì)量，抑制骨骼肌萎縮，這可能是通過調(diào)控ROCK1/PTEN/Akt信號通路、抑制Atrogin-1和 MuRF-1表達實現(xiàn)的。但本研究只是初步探討了四君子湯改善CKD-PEW模型小鼠骨骼肌萎縮的作用機制，具體分子學機制仍需進一步研究。

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（收稿日期：2020-05-30 修回日期：2020-08-09）

（編輯：林 靜）