鄭勵(lì)力，孫青芳

腦膠質(zhì)瘤為臨床常見神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，惡性程度高，侵襲和遷移能力強(qiáng)。因此，治療后復(fù)發(fā)率較高，預(yù)后不良[1,2]。鋅指基因1（juxtaposed with another zinc finger gene 1，JAZF1）在甲狀腺乳頭狀癌、子宮內(nèi)膜間質(zhì)腫瘤等腫瘤中呈現(xiàn)異常高表達(dá)[3,4]，且與腫瘤的惡性、嚴(yán)重程度相關(guān)聯(lián)。本文主要研究腦膠質(zhì)瘤中JAZF1 基因的表達(dá)特點(diǎn)及其對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株購(gòu)于上海銳賽生物技術(shù)有限公司；綠色熒光蛋白標(biāo)記的腺病毒載體Adv-GFP和Adv-JAZF1-GFP 由元和上海公司構(gòu)建；RPMI 1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、非必需氨基酸、丙酮酸鈉、谷氨酰胺購(gòu)于Gibco 公司；全蛋白提取試劑盒購(gòu)于索萊寶科技有限公司；PVDF膜購(gòu)于Millipore公司；ECL 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)于愛必信（上海）生物科技有限公司；MTT試劑盒購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞采用含10%胎牛血清、1%谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、1%丙酮酸鈉的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。取傳至第5 代且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，分為3 組：對(duì)照組、空載組和過表達(dá)組；分別于無血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，加入Adv-JAZF1-GFP或空載體Adv-GFP，對(duì)照組不予轉(zhuǎn)染腺病毒，24 h常規(guī)培養(yǎng)后收集各組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.2 MTT 比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖 收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以5×103/mL的濃度接種于96孔板，200 μL/孔，37 ℃、5%CO2過夜培養(yǎng)，于1、3、5、7 d 進(jìn)行MTT 檢測(cè)（參照說明書），采用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD490值，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，離心并收集細(xì)胞，PI染色后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.4 Western blot 法檢測(cè)Wnt 信號(hào)通路各蛋白表達(dá)量 細(xì)胞以1×105/孔接種于6孔板，轉(zhuǎn)染細(xì)胞，融合達(dá)到50%～60%時(shí)提取總蛋白質(zhì)，常規(guī)進(jìn)行Western blot 檢測(cè)，孵育的一抗為糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase，GSK-3β）、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）、腺瘤性結(jié)腸息肉病相關(guān)基因（adenomatous polyposis coli，APC）、Bax、Bcl-2，ECL顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0軟件處理數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布以及方差齊性的計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞活力比較

對(duì)照組、空載組和過表達(dá)組的細(xì)胞活力分別為（88.42±6.72）%、（89.49±4.27）%和（51.48±9.26）%；對(duì)照組和空載組細(xì)胞的活力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），過表達(dá)組細(xì)胞的活力低于其他2組（P＜0.05）。

2.2 各組凋亡情況比較

對(duì)照組、空載組和過表達(dá)組的凋亡率分別為（8.63±2.01）%、（10.21±3.17）%和（26.37±5.15）%；對(duì)照組和空載組細(xì)胞的凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），過表達(dá)組的細(xì)胞的凋亡率高于其他2組（P＜0.05）。

2.3 Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)量比較

對(duì)照組和空載組β-actenin、GSK-3β、APC、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），過表達(dá)組β-actenin、GSK-3β、APC 和Bax 蛋白表達(dá)低于其他2 組，Bcl-2 蛋白表達(dá)高于其他2組（P＜0.05），見表1。

表1 Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)量比較（±s）

表1 Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)量比較（±s）

注：與過表達(dá)組比較，①P＜0.05

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是由外胚葉組織衍化而來的神經(jīng)間質(zhì)細(xì)胞的腫瘤[5]。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，相關(guān)致病突變基因較多，臨床常規(guī)治療以手術(shù)聯(lián)合化療以及放射治療為主[6]，但療效果并不理想。有研究顯示，腦膠質(zhì)瘤手術(shù)后加上精確的放療，1 年的存活率為79%，2年的存活率為55%，3年的存活率為46%[7]。

JAZF1 是核蛋白編碼基因，由3 個(gè)C2H2 樣鋅指結(jié)構(gòu)構(gòu)成，有助于染色質(zhì)穩(wěn)定性維持[1]。JAZF1是一個(gè)與2型糖尿病、子宮內(nèi)膜間質(zhì)肉瘤、甲狀腺乳頭狀癌和前列腺癌相關(guān)聯(lián)的基因[8,9]。JAZF1水平在不同級(jí)別的腦膠質(zhì)瘤患者中表達(dá)有差異，且級(jí)別越高差異越明顯。推測(cè)JAZF1 對(duì)腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展具有一定的調(diào)控作用，且與腦膠質(zhì)瘤的嚴(yán)重程度有關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，上調(diào)JAZF1后，體外培養(yǎng)的人腦膠質(zhì)瘤活力降低、凋亡增加。

Wnt信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞的增殖、凋亡可進(jìn)行調(diào)控[10-12]。Wnt信號(hào)通路的成分都非常保守，其由Wnt 分泌蛋白、β-catenin、T 細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子（TCF/LEF）、APC、GSK3β、軸蛋白等組成[13,14]。β-catenin以3種方式存在于正常成熟細(xì)胞中，但少量游離β-catenin 存在于細(xì)胞內(nèi)，大部分則與E-cadherin結(jié)合，剩余的則形成復(fù)合體通過氨基端磷酸化被U3 泛素連接酶β-轉(zhuǎn)導(dǎo)素重復(fù)蛋白（β-TRCP）識(shí)別并被泛素化，最后被26S蛋白酶體降解。

JAZF1可能在腦膠質(zhì)瘤的進(jìn)程中發(fā)揮抑制作用。本研究結(jié)果顯示：上調(diào)JAZF1可抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞的增殖、凋亡是重要的生物學(xué)現(xiàn)象且受到多種基因的嚴(yán)格控制[15]。Bcl-2 蛋白家族通過控制線粒體通透性調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，Bcl-2 有三大亞家族：抗凋亡蛋白、促凋亡蛋白和孔隙形成促凋亡蛋白，例如Bax 蛋白[16]。本研究中，Western blot 結(jié)果證實(shí)了上調(diào)JZAF1，促進(jìn)了β-actenin、GSK-3β、APC 和Bax 的表達(dá)，抑制了Bcl-2蛋白表達(dá)水平。當(dāng)Wnt通路被激活時(shí)，一系列的分子事件會(huì)使β-catenin 蛋白增多，β-catenin 進(jìn)入細(xì)胞核與其他因子相結(jié)合形成核內(nèi)復(fù)合物[17,18]。

綜上所述，上調(diào)JAZF1 可能通過作用于Wnt/β-catenin 信號(hào)通路，調(diào)控β-catenin、GSK-3β、Bax、APC、Bcl-2蛋白的表達(dá)，抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡。