王怡霖,趙 濤,孫庚午,刁雨菲,馮軍利,于 濤,何邦令*,劉會(huì)香*

1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/山東省林業(yè)有害生物防控工程技術(shù)研究中心,山東 泰安 271018

2.泰安市徂徠山林場(chǎng),山東 泰安 271027

3.淄博市淄川林業(yè)局,山東 淄博 255100

蘋果樹腐爛病(Valsa canker of apple)是由蘋果黑腐皮殼菌（Valsa mali）引起的一種嚴(yán)重枝干病害，分布廣，危害嚴(yán)重[1]。開(kāi)展蘋果樹腐爛病菌致病相關(guān)機(jī)制的研究對(duì)于科學(xué)防控病害具有重要意義。目前蘋果樹腐爛病菌致病相關(guān)因子主要包括降解酶類物質(zhì)、毒性次生代謝物、分泌蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等[2-5]。降解酶類物質(zhì)主要包括果膠酶和根皮苷降解酶等[6]，毒性次生代謝物包括聚酮合成酶、二甲基丙烯基色氨酸合成酶、非核糖體多肽合成酶和異香豆素類物質(zhì)等[6]，分泌蛋白、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子如HMG[8]、VmSeb1[9]、VmPacC[10]、VmPxE1[11]、天鵝絨蛋白（Velvet protein）家族中的VmVe[12]以及VmPoDs[6]、VmXyl1[7]、VmPmk1[13]、VmE02[14]、VMAGO2[6]和編碼異源三聚體G蛋白α亞基的基因Gvm2和Gvm3[15]等，上述致病相關(guān)因子在病菌的生長(zhǎng)發(fā)育和致病過(guò)程中均發(fā)揮重要作用。

Som1（cAMP-dependent protein kinase pathway protein）是位于環(huán)化腺苷酸信號(hào)途徑（cAMP-PKA）下游的重要轉(zhuǎn)錄因子。目前，對(duì)于Som1基因在酵母（Saccharomyces cerevisiae）中的同源基因flo8的研究較為深入，flo8可與轉(zhuǎn)錄抑制子Sfl1 共同調(diào)控酵母細(xì)胞間的粘附力，使酵母牢固附著并穿透培養(yǎng)基[16]。在絲狀真菌中構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans），Som1的同源基因SomA調(diào)控真菌菌絲形態(tài)建成和致病性，煙曲霉中SomA基因的缺失導(dǎo)致生長(zhǎng)緩慢和無(wú)性發(fā)育的阻滯，只能形成沒(méi)有進(jìn)一步分化的氣生菌絲，且SomA是生物膜形成所必需的[17]。在Magnaporthe oryzae中，MoSom1在孢子和附著物的發(fā)育是必需的，并且在孢子形成期間在細(xì)胞壁分化，調(diào)節(jié)黑色素沉著和細(xì)胞表面疏水性中起作用，對(duì)于亞細(xì)胞定位和生物學(xué)功能是必需的[18,19]。大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）中，Som1調(diào)控真菌粘附和根部穿透、控制隔膜定位和空泡的大小，隨后控制菌絲形成，包括氣生菌絲形成和正常菌絲分支，致病性所需的發(fā)育遺傳網(wǎng)絡(luò)[20]。在模式昆蟲病原真菌（Metarhizium acridum）中，Som1的同源基因MaSom1的缺失降低了分生孢子產(chǎn)量，延遲了分生孢子萌發(fā)，并削弱了對(duì)熱和UV-B的真菌耐受性，降低了真菌的毒力。此外，MaSom1對(duì)于細(xì)胞壁完整性和分生孢子表面結(jié)構(gòu)也有重要作用[21]。

在實(shí)驗(yàn)室前期已構(gòu)建的Valsa maliATMT（Agrobacterium tumefaciensmediated transformation,ATMT）突變體庫(kù)基礎(chǔ)上[22]，通過(guò)轉(zhuǎn)化子表型篩選，獲得了一突變株V23。應(yīng)用hiTAIL-PCR方法分離克隆了側(cè)翼序列，獲得了VmSom1突變基因。本研究分析了基因序列和編碼蛋白功能域特征，研究結(jié)果為進(jìn)一步明確該基因功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

蘋果樹腐爛病菌菌株sdau11-175由本實(shí)驗(yàn)室分離保存；隨機(jī)挑選pKO1-HPH載體所構(gòu)建的ATMT轉(zhuǎn)化子50個(gè)[22]，所有轉(zhuǎn)化子均由本實(shí)驗(yàn)室獲得并在20%甘油4 ℃低溫保存；引物合成及序列測(cè)定由北京華大基因科技有限公司完成；大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α感受態(tài)細(xì)胞、pMD18-T載體購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司、克隆載體pEASY-T1購(gòu)自北京全式金生物有限責(zé)任公司。

1.2 突變體篩選

篩選以轉(zhuǎn)化子菌落生長(zhǎng)速率、培養(yǎng)學(xué)特性和致病性差異顯著性為評(píng)價(jià)指標(biāo)。以野生型菌株sdau11-175為參照菌株，在25 ℃PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，十字交叉法測(cè)定5 d的菌落生長(zhǎng)直徑，計(jì)算菌落生長(zhǎng)速率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次；同時(shí)記錄菌落形狀、顏色和氣生菌絲發(fā)達(dá)程度；準(zhǔn)備成熟度和大小一致紅富士蘋果，采用五點(diǎn)刺傷接種法，每個(gè)蘋果接種4個(gè)點(diǎn)，每個(gè)轉(zhuǎn)化子共接種12個(gè)點(diǎn)，接種后使用保鮮膜保濕，置于25 ℃黑暗培養(yǎng)，重復(fù)3次，7 d后測(cè)定病斑直徑，數(shù)據(jù)處理采用SPSS方法（P<0.05）[8]。

1.3 突變體側(cè)翼序列克隆

以上述篩選出的突變體為目標(biāo)菌株進(jìn)行基因組總DNA提取，突變體T-DNA插入位點(diǎn)左右的側(cè)翼序列擴(kuò)增采用hiTAIL-PCR方法[23]。L（R）B2不添加5’端接頭。在一級(jí)反應(yīng)中，使用的模板是突變體菌株的基因組總DNA，在二級(jí)和三級(jí)反應(yīng)中，使用模板則分別為上一級(jí)反應(yīng)產(chǎn)物稀釋1000倍。產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，以1 kb Maker為參照，將PCR特異性產(chǎn)物經(jīng)回收、連接、大腸桿菌轉(zhuǎn)化，菌落PCR檢測(cè)和華大基因測(cè)序后得到的側(cè)翼序列進(jìn)行NCBI Blastx在線分析，使用BioEdit軟件結(jié)合G enbankValsa mali03-8基因組序列進(jìn)行本地分析[4]，獲得兩端側(cè)翼序列全長(zhǎng)。引物序列見(jiàn)表1，反應(yīng)程序見(jiàn)[24]。

表1 本研究hiTAIL-PCR 引物Table 1 Primers of hiTAIL-PCR in this research

1.4 突變基因全長(zhǎng)序列克隆

依據(jù)上述兩端側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物（F1-ATGAATAACGTCA ACATGGCCAATATGGA，R1-TCAC CGGACCCTAAGTCTCTATCTCCG），分別以野生型菌株sdau11-175和突變株基因組總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲取突變基因和含有T-DNA的突變基因全長(zhǎng)序列。同時(shí)與已報(bào)道的V.mali03-8菌株的基因組序列進(jìn)行比對(duì)分析，以確定T-DNA的插入位點(diǎn)及方式。

1.5 突變基因序列分析

使用NCBI的在線工具ORF FINDER和Graphics分別確定VmSom1的開(kāi)放閱讀框和內(nèi)含子；在Genbank下載Neurospora crassa、Aspergillus nidulans、Magnaporthe oryzae、Aspergillus fumigatus、V.mali03-8、Candida albicans、Saccharomyces cerevisiae、Phaeoacremonium minimum、Diaporthe ampelina、Colletotrichum orbiculare、Colletotrichum gloeosporioides、Colletotrichum salicis、Eutypa lata、Verticillium alfalfae、Madurella mycetomatis、Ophiocordyceps sinensis、Ustilaginoidea virens、Fusarium fujikuroi、Metarhizium guizhouense以及Valsa malivar.Pyri中與sdau11-175VmSom1基因同源性高的序列，用MEGA 6采用Neighbor-Joining method方法對(duì)突變基因進(jìn)行1000次置信度自展系統(tǒng)進(jìn)化分析；使用ExPASy-ProtParam在線工具對(duì)突變基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行分析；使用ExPASy-ProtScale在線工具對(duì)突變基因編碼蛋白質(zhì)的疏水性進(jìn)行分析；使用在線SOPMA和Phyre2對(duì)突變基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。應(yīng)用在線軟件CDD-search (https://www.ncbi.nlm.nih.gov)和http://smart.emblheidelberg.de/index2.cgi對(duì)蛋白功能域進(jìn)行預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體篩選

與野生型菌株sdau11-175相比，隨機(jī)挑選的50個(gè)蘋果樹腐爛病ATMT轉(zhuǎn)化子中有49個(gè)生長(zhǎng)速率、菌落特征與致病力差異不顯著。轉(zhuǎn)化子V23表現(xiàn)出生長(zhǎng)速率顯著減慢和致病力完全喪失的特征（圖1）。同時(shí)V23菌落表面比較濕潤(rùn)，氣生菌絲生長(zhǎng)弱、不產(chǎn)生子實(shí)體（圖2）。說(shuō)明突變體V23調(diào)控的基因?qū)μO果樹腐爛病菌的生長(zhǎng)發(fā)育及致病性有重要作用。

圖1 蘋果腐爛病菌轉(zhuǎn)化子的生長(zhǎng)速率和致病性測(cè)定Fig.1 Growth rates and pathogenicity characters of transformants of pathogen

圖2 突變體V23 和野生型sdau11-175 菌落形態(tài)、子實(shí)體產(chǎn)生和致病性測(cè)定結(jié)果Fig.2 Colony morphology,fruiting body generation and pathogenicity of mutant V23 and wild-type SDAU11-175

2.2 突變體側(cè)翼序列及全長(zhǎng)序列的克隆

以突變體V23基因組DNA為模板，應(yīng)用hiTAIL-PCR方法進(jìn)行T-DNA插入側(cè)翼序列克隆。在突變體V23的T-DNA左邊界L3得到了約1900 bp的特異性片段，在右邊界R3得到了約2200 bp的特異性片段。V23突變體側(cè)翼序列不同步驟PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖3。以V.malisdau11-175基因組DNA為模板，使用兩端側(cè)翼引物序列克隆全長(zhǎng)突變基因，其大小為2723 bp。

圖3 突變體V23 的側(cè)翼序列克隆Fig.3 Cloning of flanking sequences of V23 mutants

2.3 突變基因序列分析

2.3.1 突變基因核苷酸序列分析 突變基因編碼區(qū)長(zhǎng)2475 bp，編碼824 個(gè)氨基酸，基因組DNA 含有5 個(gè)外顯子和4 個(gè)內(nèi)含子。將突變基因全長(zhǎng)序列和V.mali03-8 序列比對(duì)，并將二者的氨基酸序列比對(duì)，去除密碼子簡(jiǎn)并性因素，二者的氨基酸完全一致，說(shuō)明在同一種真菌中該突變基因編碼的蛋白相對(duì)保守。突變體V23 中的T-DNA 插入位點(diǎn)位于V.mali第12 號(hào)染色體（CM003109.1）的69537與69547 之間，在編碼假定蛋白的基因VMIG_09677（GenBank:KUI74346.1）的第一個(gè)外顯子中（圖4）。被注釋為編碼蛋白Adhesion defective protein 3，該基因與Som1同源，故將其命名為VmSom1，在V.mali03-8 基因組中比對(duì)發(fā)現(xiàn)，VmSom1為單拷貝。

圖4 突變體T-DNA 側(cè)翼序列測(cè)序及T-DNA 插入位點(diǎn)Fig.4 T-DNA flanking sequences and insertion position of mutants

系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)（圖5），蘋果腐爛病菌VmSom1基因與其他20種真菌中的Som1及其同源基因的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近各不相同，其中與同屬真菌（梨腐爛病菌）真菌內(nèi)Som1基因編碼的氨基酸序列相似性很高，同源性高達(dá)98.79%；與不同屬真菌（如稻瘟病菌、煙曲霉、構(gòu)巢曲霉等）差異較大，蛋白質(zhì)的特異性及功能主要取決于一級(jí)結(jié)構(gòu)，推測(cè)不同屬真菌的Som1蛋白功能可能存在一定差異。

圖5 蘋果腐爛病菌VmSom1 蛋白的NJ 系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.5 NJ Phylogenetic analysis of VmSom1 protein of Valsa mali

2.3.2 突變基因編碼蛋白的功能域預(yù)測(cè)Valsa mali與Magnaporthe oryzae、Aspergillus fumigatus中均存在LisH 結(jié)構(gòu)域和核定位信號(hào)肽（NLS）結(jié)構(gòu)域，其中VmSom1 蛋白的LisH 結(jié)構(gòu)域位于N 端43-75 aa，長(zhǎng)為33 aa，同時(shí)在259-272 aa 處存在著核定位信號(hào)肽NLS，長(zhǎng)為14 aa（圖6）。

圖6 三種病原菌Som1 基因編碼蛋白的功能域分析Fig.6 Functional domain analysis of proteins encoded by three pathogenic Som1 genes

2.3.3 突變基因編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)分析 利用Expasy-Protparam 在線工具對(duì)蛋白的基本理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)后發(fā)現(xiàn)，蘋果腐爛病菌VmSom1基因的蛋白分子式為C3707H5808N1150O1211S60，相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）為87785.47，蛋白質(zhì)等電點(diǎn)pI 為6.39，理論蛋白分子量約87.82 kDa，不穩(wěn)定指數(shù)為61.07，脂肪指數(shù)為39.59，親水性平均指數(shù)為-0.959，親水性較強(qiáng)（圖7）。蛋白中存在著20 種氨基酸，其中脯氨酸（13.2%）、谷氨酰胺（13%）、丙氨酸（10%）和天門冬酰胺（9.5%）含量較高，半胱氨酸（0.2%）、色氨酸（0.4%）和酪氨酸（1.1%）含量較低。使用在線Expasy-Protscale 程序分析VmSom1 蛋白質(zhì)的疏水性后發(fā)現(xiàn)，在第134 位氨基酸處有最大疏水值為1.422，在第85 位氨基酸處有最小疏水值為-3.067。VmSom1 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中含有α螺旋211 AA（25.61%），延伸結(jié)構(gòu)37 AA（4.49%），β轉(zhuǎn)角27 AA（3.28%）和無(wú)規(guī)則卷曲549 AA（66.63%）。

圖7 突變基因編碼的蛋白質(zhì)疏水性圖Fig.7 Protein hydrophobicity map encoded by mutant gene

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)篩選到了V23 菌株，該菌株生長(zhǎng)速率明顯減慢，菌落表面較為濕潤(rùn)，菌絲生長(zhǎng)弱，致病性完全喪失，不產(chǎn)生子實(shí)體。確定了T-DNA 插入突變基因位于蘋果樹腐爛病菌第12 號(hào)染色體69537和69547 之間。該基因的氨基酸序列與Som1基因編碼的camp-dependent protein kinase pathway protein聚為一類，命名為VmSom1?；虼笮?723 bp，含有5 個(gè)外顯子和4 個(gè)內(nèi)含子，為單拷貝，編碼區(qū)長(zhǎng)2475 bp，編碼824 個(gè)氨基酸，包含LisH 結(jié)構(gòu)域和NLS 結(jié)構(gòu)域，蛋白分子式為C3707H5808N1150O1211S60，理論蛋白分子量約87.82 kDa，等電點(diǎn)pI 為6.39，親水性較強(qiáng)。

3.2 討論

Som1 是作用于環(huán)化腺苷酸信號(hào)途徑（cAMP-PKA）下游的轉(zhuǎn)錄因子。在絲狀真菌中僅構(gòu)巢曲霉（A.nidulans，Som1）、煙曲霉（A.fumigatus，SomA）、稻瘟病菌（M.oryzae，MoSom1）、大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）和昆蟲病原真菌綠僵菌（Metarhizium acridum，MaSom1）中有報(bào)道[17-21,25]。

本研究通過(guò)蘋果樹腐爛病菌ATMT 突變體表型篩選，獲得了一突變株V23，并發(fā)現(xiàn)了突變基因VmSom1。蘋果樹腐爛病菌突變株V23 與稻瘟病菌Som1 缺失突變株（ΔMoSom1）和煙曲霉缺失SomA突變株（ΔSomA）均表現(xiàn)出生長(zhǎng)減慢、致病性喪失和不產(chǎn)孢等相似表型[17,18,22]，分析發(fā)現(xiàn)它們含有相同的LisH 和NLS 結(jié)構(gòu)域，但是系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示不同屬中Som1基因序列差異較大，說(shuō)明VmSom1可能與MoSom1 和SomA 存在相似功能，但也可能存在不同功能，需要深入研究。

本研究從轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)速率、菌落特征、子實(shí)體產(chǎn)生情況及致病性指標(biāo)進(jìn)行了突變體篩選，下一步需要找尋更多指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)突變體，繼而挖掘更多的突變基因。

本研究是在Liu YG[23]和Wang Z[26]方法基礎(chǔ)上進(jìn)行，引入了接頭簡(jiǎn)并引物，改良了hiTAIL-PCR法，有效提高了克隆效率且有效地降低了短鏈產(chǎn)物產(chǎn)生。該技術(shù)也適合于其它真菌染色體步移或側(cè)翼序列克隆，具有高通量的特點(diǎn)，值得推廣使用。