陳文彬，張 楠，謝 鳳，王 穎

0 引言

貝伐珠單抗(Bevacizumab,BEV)作為針對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)的抗腫瘤藥物，通過(guò)與VEGF特異性結(jié)合阻礙VEGF與其受體在內(nèi)皮細(xì)胞表面相互作用，抑制血管生成，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。它被廣泛用于治療各種惡性腫瘤，如結(jié)直腸癌[1-3]、轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌[4]、非小細(xì)胞肺癌[5]及卵巢癌[6]等。但高血壓、蛋白尿、出血和血栓性靜脈炎是BEV比較常見的不良反應(yīng)[7]。BEV相關(guān)蛋白尿尚無(wú)有效預(yù)防及治療方法，其是否會(huì)影響患者的腎功能仍有爭(zhēng)議，對(duì)于應(yīng)用BEV出現(xiàn)嚴(yán)重蛋白尿的患者，一般采取停止使用BEV，但這樣會(huì)影響其臨床治療效果。多項(xiàng)研究證實(shí)，血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑及中藥雷公藤多苷具有改善腎小球足細(xì)胞的裂隙膜蛋白、穩(wěn)定足細(xì)胞的細(xì)胞骨架、維持腎小球?yàn)V過(guò)屏障、減少尿蛋白泄漏的作用[8-10]。借鑒已有研究，筆者將其移植到BEV不良反應(yīng)蛋白尿的研究之中。本研究觀察氯沙坦及雷公藤多苷對(duì)BEV相關(guān)小鼠腎損傷的預(yù)防性保護(hù)作用并探索其可能的作用機(jī)制，為治療BEV導(dǎo)致的蛋白尿提供有益的探索和幫助。

1 資料與方法

1.1 藥物與試劑 貝伐珠單抗注射液,規(guī)格：每瓶4 ml/100 mg，進(jìn)口藥品注冊(cè)證號(hào)：S20120068，購(gòu)自瑞士羅氏制藥公司；氯沙坦鉀片(Losartan potassium tablets)，規(guī)格：每片50 mg，國(guó)藥準(zhǔn)字：J20130148，購(gòu)于杭州默沙東制藥有限公司；雷公藤多苷片(Tripterygium glycosides tablets)，規(guī)格：每片10 mg，國(guó)藥準(zhǔn)字：Z31020415，購(gòu)于上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司；兔抗鼠VEGF、nephrin、podocin單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；GAPDH一抗購(gòu)于proteintech公司；免疫組化EliVision檢測(cè)試劑盒購(gòu)于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2 儀器 電子分析天平購(gòu)于上海梅特勒-托利多；生物顯微鏡購(gòu)于日本Nikon；高壓滅菌器購(gòu)于日本三洋；生物組織包埋機(jī)購(gòu)于德國(guó)Leica；石蠟切片機(jī)購(gòu)于德國(guó)美康；多功能酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)BioTek。

2 方法與結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)ICR雄性小鼠，6～8周齡，體重18～22 g(小鼠飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部SPF級(jí)動(dòng)物房)，購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(遼)2015-0001。自由采食及飲水。

2.2 方法

2.2.1 腎損傷模型的建立 將24只ICR小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為4組：對(duì)照組，尾靜脈注射同體積生理鹽水；BEV低劑量組，尾靜脈注射BEV 10 mg/(kg·w)；BEV中劑量組，尾靜脈注射BEV 35 mg/(kg·w)；BEV高劑量組，尾靜脈注射BEV 60 mg/(kg·w)。每周根據(jù)其體重變化調(diào)整用藥劑量。4周末(第28天)留取小鼠24 h尿液冷凍保存,測(cè)24 h尿蛋白量。然后眼球取血檢測(cè)生化指標(biāo)。處死小鼠取其腎組織，進(jìn)行HE染色，免疫組化法及Western blot法測(cè)定腎組織中VEGF、podocin、nephrin蛋白的表達(dá)。

4周后，10、35、60 mg/(kg·w)3個(gè)階梯BEV劑量組，中、高劑量組小鼠全部誘導(dǎo)產(chǎn)生蛋白尿,成功建立腎損傷模型。考慮實(shí)驗(yàn)周期及實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，選取高劑量建立腎損傷模型。

2.2.2 腎損傷模型的建立及給藥干預(yù) 將42只ICR小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為7組。對(duì)照組：尾靜脈注射同體積生理鹽水；BEV組：尾靜脈注射BEV 60 mg/(kg·w)；LOS1組：尾靜脈注射BEV 60 mg/(kg·w)，同時(shí)灌胃給予氯沙坦5 mg/(kg·d)；LOS2組：尾靜脈注射BEV 60 mg/(kg·w)，同時(shí)灌胃給予氯沙坦10 mg/(kg·d)；LOS3組：尾靜脈注射BEV 60 mg/(kg·w)，同時(shí)灌胃給予氯沙坦20 mg/(kg·d)；TGT組：尾靜脈注射BEV 60 mg/(kg·w)，同時(shí)灌胃給予雷公藤多苷10 mg/(kg·d)；聯(lián)合組：BEV尾靜脈注射60 mg/(kg·w)，同時(shí)灌胃給予氯沙坦及雷公藤多苷各10 mg/(kg·d)。每周根據(jù)其體重變化調(diào)整用藥劑量。4周末(第28天)留取小鼠24 h尿液冷凍保存。然后眼球取血檢測(cè)生化指標(biāo)。處死小鼠取其腎組織，進(jìn)行下一步檢測(cè)。

2.2.3 24 h尿液總蛋白定量測(cè)定 將小鼠放入代謝籠內(nèi)，收集24 h的尿液(期間禁食，不禁水)，測(cè)定24 h尿蛋白量。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書測(cè)定(南京建成生物工程研究所)。

2.2.4 血生化指標(biāo)檢測(cè) 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書使用全自動(dòng)多功能生化分析儀測(cè)定血肌酐(Cr)、血尿素氮(BUN)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)等生化指標(biāo)。

2.2.5 光學(xué)顯微鏡觀察腎組織病理改變 取部分腎組織標(biāo)本在4%多聚甲醛中固定，脫水、透明、浸蠟、包埋，常規(guī)切片，厚度2 μm。HE染色，在光鏡下觀察腎組織的病理改變。

2.2.6 免疫組化法觀察VEGF、nephrin、podocin分布 將石蠟切片脫蠟，用微波法修復(fù)抗原(抗原修復(fù)液為檸檬酸鹽緩沖液)。按照免疫組化說(shuō)明書步驟加入一抗(VEGF、nephrin、podocin抗體)4 ℃孵育過(guò)夜，DAB顯色2～6 min，并用自來(lái)水終止顯色，最后封片鏡檢。

2.2.7 Western blot法測(cè)定腎組織中VEGF、podocin、nephrin蛋白的表達(dá) 適量腎組織加入裂解液勻漿，離心，取上清液測(cè)蛋白濃度，樣品電泳后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉-TBST溶液室溫下封閉2 h，洗膜后加入一抗(VEGF、nephrin、podocin抗體)，4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜后HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗室溫孵育1 h，滴加ECL發(fā)光液反應(yīng)2 min。以GAPDH作為內(nèi)參，使用凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果，內(nèi)參與所測(cè)蛋白的比為該蛋白的相對(duì)值。

2.3 結(jié)果

2.3.1 干預(yù)對(duì)24 h尿液總蛋白量的影響 如圖1所示，BEV組尿蛋白水平明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。與BEV組相比，LOS1組、LOS2組、LOS3組、TGT組、聯(lián)合組尿蛋白量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；聯(lián)合組較LOS2組和TGT組相比也明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

圖1 各組小鼠24 h尿蛋白的變化注：與對(duì)照組比較，###P<0.001；與BEV組比較，*P<0.05，***P<0.001；與LOS2組比較，▲▲▲P<0.001；與TGT組比較，△△△P<0.001

2.3.2 各組小鼠血生化分析 各組小鼠ALT、AST、BUN、Cr比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠血生化指標(biāo)比較

2.3.3 光學(xué)顯微鏡觀察腎組織病理改變 如圖2示，光鏡下對(duì)照組小鼠腎小球結(jié)構(gòu)正常；BEV組小鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)萎縮、空泡狀改變；與BEV組相比，LOS1組腎小球結(jié)構(gòu)輕微損傷，LOS2組、TGT組、LOS3組、聯(lián)合組腎小球結(jié)構(gòu)均無(wú)明顯損傷改變。

圖2 各組小鼠腎組織病理改變(HE，400×)

2.3.4 免疫組化法觀察VEGF、nephrin、podocin分布 光鏡下觀察并以染色強(qiáng)度與腎小球陽(yáng)性細(xì)胞百分比綜合計(jì)分進(jìn)行半定量分析，以PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照。切片中胞質(zhì)染為淡黃色至棕褐色者為陽(yáng)性細(xì)胞標(biāo)志。染色強(qiáng)度以多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)的染色特性(染色深淺需與背景著色相對(duì)比)計(jì)分：無(wú)著色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)算方法為每個(gè)視野下陽(yáng)性細(xì)胞面積占總面積的比例:0～5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。每張切片400×鏡下隨機(jī)選取5個(gè)腎小球，將每個(gè)腎小球進(jìn)行染色強(qiáng)度計(jì)分與陽(yáng)性細(xì)胞面積百分比計(jì)分，最后計(jì)算出5個(gè)腎小球平均陽(yáng)性細(xì)胞面積百分比。染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞百分比的乘積:0分為陰性(-)，1～4分為弱陽(yáng)性(+)，5～8分為中度陽(yáng)性(++)，9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

免疫組化結(jié)果見圖3～圖5。結(jié)果表明，對(duì)照組、LOS3組、聯(lián)合組小鼠腎組織VEGF、podocin、nephrin蛋白的表達(dá)均呈現(xiàn)出強(qiáng)陽(yáng)性，BEV組和LOS1組小鼠腎組織VEGF、podocin、nephrin蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)出弱陽(yáng)性或陰性，TGT組和LOS2組小鼠腎組織VEGF、podocin、nephrin蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)出中強(qiáng)陽(yáng)性。

圖3 各組小鼠腎組織VEGF蛋白表達(dá)(免疫組化結(jié)果，400×)

圖4 各組小鼠腎組織podocin蛋白表達(dá)(免疫組化結(jié)果，400×)

圖5 各組小鼠腎組織nephrin蛋白表達(dá)(免疫組化結(jié)果，400×)

2.3.5 Western blot法測(cè)定小鼠腎組織中VEGF、podocin、nephrin蛋白的表達(dá) 如圖6～圖7所示，BEV組較對(duì)照組VEGF、podocin、nephrin蛋白的表達(dá)明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。LOS1組、LOS2組、LOS3組、TGT組、聯(lián)合組蛋白表達(dá)比BEV組明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；聯(lián)合組蛋白表達(dá)明顯高于LOS2組和TGT組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖6 Western blot法檢測(cè)各組小鼠VEGF、podocin、nephrin蛋白表達(dá)

圖7 各組小鼠VEGF、podocin、nephrin蛋白表達(dá)注：A.VEGF蛋白，B.podocin蛋白，C.nephrin蛋白。與對(duì)照組比較，###P<0.001；與BEV組比較，**P<0.01，***P<0.001；與LOS2組比較，▲P<0.05,▲▲P<0.01；與TGT組比較，●P<0.05,●●P<0.01

3 討論

腫瘤血管生成是腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵過(guò)程，并受促血管生成因子和抗血管生成因子的平衡調(diào)節(jié)，其中VEGF是關(guān)鍵的血管生成因子。而且腫瘤組織中VEGF表達(dá)的強(qiáng)度和高血管密度與多種類型腫瘤的預(yù)后不良有關(guān)[11-13]。足細(xì)胞分泌的VEGF在腎小球發(fā)育、維持腎小球結(jié)構(gòu)和功能完整中發(fā)揮重要作用。在生理范圍內(nèi)足細(xì)胞分泌的VEGF增加可中止由足細(xì)胞損傷引起的腎小球發(fā)育惡化[14]。腎臟中VEGF的逐漸耗竭會(huì)導(dǎo)致蛋白尿和腎小球透水性增加[15]，證明BEV(針對(duì)所有形式VEGF的抗體)可導(dǎo)致腎損傷。蛋白尿作為BEV比較常見的不良反應(yīng)之一，研究顯示其具有劑量依賴性[16]，且發(fā)生率也與腫瘤的類型有關(guān)，非小細(xì)胞肺癌患者蛋白尿的發(fā)生率低于結(jié)直腸癌患者[17]。

根據(jù)相關(guān)BEV的實(shí)驗(yàn)研究[18-21]及其臨床使用劑量，在實(shí)驗(yàn)中設(shè)置3個(gè)階梯BEV劑量4周后，中、高劑量組小鼠全部誘導(dǎo)產(chǎn)生蛋白尿,成功建立腎損傷模型，考慮實(shí)驗(yàn)周期選取BEV尾靜脈注射60 mg/(kg·w)。

目前，研究認(rèn)為，BEV相關(guān)蛋白尿與足細(xì)胞表面的蛋白分子表達(dá)異常有關(guān)(如nephrin、podocin、CD2A)[18-19]。Nephrin和podocin位于足細(xì)胞足突之間的裂隙隔膜(SD)處，是腎小球?yàn)V過(guò)屏障形成和功能維持所必須的[22-23]。因此,我們?cè)u(píng)估了使用BEV后小鼠腎臟中這2種蛋白表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平與蛋白尿水平之間呈負(fù)相關(guān)。證明BEV可降低足細(xì)胞VEGF的表達(dá)，下調(diào)nephrin、podocin的表達(dá)，破壞腎小球?yàn)V過(guò)屏障，導(dǎo)致蛋白尿,且具有劑量相關(guān)性。HE結(jié)果也顯示了BEV導(dǎo)致腎小球內(nèi)皮細(xì)胞萎縮、空泡狀改變等病理變化。盡管蛋白尿被認(rèn)為是可能導(dǎo)致腎功能受損的因素，但各組小鼠的血生化指標(biāo)無(wú)顯著差異，表明BEV誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷短期不至于引起明顯的腎功能變化。

蛋白尿在一定程度上限制了BEV臨床使用，無(wú)論是其發(fā)生機(jī)制和預(yù)防處理，目前國(guó)內(nèi)外研究均較少，需要研究加以解決。多數(shù)研究表明，中藥如雷公藤多苷、血管緊張素受體阻斷劑(ARB)在腎小球腎病、糖尿病腎病的臨床治療中有確切療效。雷公藤多苷具有免疫抑制、抗炎、抗癌[24]和修復(fù)足細(xì)胞損傷，增加nephrin、podocin表達(dá)，改善由BEV誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷的作用[20,25]。ARB可能通過(guò)增加由足細(xì)胞等產(chǎn)生的VEGF表達(dá)來(lái)促進(jìn)腎小球修復(fù)[26]。阿西替尼誘導(dǎo)的大鼠蛋白尿與nephrin和podocin的下調(diào)相關(guān)，預(yù)防性給予坎地沙坦可以減輕蛋白尿及上調(diào)nephrin和podocin的表達(dá)[21]。而且有研究顯示，雷公藤多苷和ARB協(xié)同可有效治療2型糖尿病蛋白尿[27]。但關(guān)于二者治療BEV誘導(dǎo)的蛋白尿的研究比較有限。

在使用BEV治療的惡性腫瘤患者中維持腎功能是有利的，可以延長(zhǎng)治療時(shí)間。因此，我們進(jìn)一步評(píng)估了預(yù)防性給予氯沙坦及雷公藤多苷對(duì)BEV引起的潛在腎損害的影響。光鏡下HE及24 h蛋白尿結(jié)果顯示，隨著氯沙坦劑量增加及TGT聯(lián)合用藥，顯著減輕了BEV導(dǎo)致的腎損傷。免疫組化及Western blot等結(jié)果提示，隨著氯沙坦劑量及聯(lián)合用藥上調(diào)VEGF、nephrin、podocin蛋白表達(dá)，且腎組織損傷改善程度與氯沙坦劑量呈正相關(guān)。聯(lián)合組VEGF、nephrin、podocin蛋白表達(dá)比LOS1組和TGT組上調(diào)，表明兩者聯(lián)合用藥減輕BEV誘導(dǎo)的蛋白尿的療效顯著優(yōu)于其任一單藥，兩者具有協(xié)同作用。本實(shí)驗(yàn)證明，LOS及TGT是治療BEV相關(guān)蛋白尿的有效藥物，為臨床治療提供了思路。本研究想法來(lái)源于臨床實(shí)踐，為克服貝伐珠單抗的不良反應(yīng)，本研究只是一種嘗試和探索，未來(lái)還需要在臨床上開展相應(yīng)的研究。