馮云霞，戢太陽，馮協(xié)和，劉 菁

0 引言

狹葉金粟蘭(ChloranthusangustifoliusOliv)為金粟蘭科(Chloranthaceae)藥用植物之一[1]，又名“四塊瓦”、“小四塊瓦”或“四葉對(duì)”等[2]，最早見于清代的《植物名實(shí)圖考》。狹葉金粟蘭在不同的地區(qū)以全草或根莖入藥，其具有活血散瘀、消腫解毒的功效，臨床上多用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和菌痢等[3]。狹葉金粟蘭的化學(xué)成分[4]主要有二聚倍半萜類化合物、單倍體倍半萜類化合物、香豆素類、酰胺類，其提取物具有抗菌[5]和殺蟲[6]作用。研究證明，香豆素類成分是金粟蘭科植物發(fā)揮抗菌消炎作用的主要成分[7]，傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶即是狹葉金粟蘭香豆素類成分中的2種。被《中國藥典》收錄的狹葉金粟蘭同科藥材腫節(jié)風(fēng)還將異嗪皮啶作為含量測定的指標(biāo)之一[8]。目前對(duì)于狹葉金粟蘭的研究較少，主要是成分研究和藥理活性研究[9-11]，對(duì)其質(zhì)量控制尚缺乏相關(guān)研究。本試驗(yàn)建立了HPLC-DAD法測定狹葉金粟蘭不同部位(根、莖、葉)中綠原酸、傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶的含量，以期為狹葉金粟蘭藥材的質(zhì)量控制和狹葉金粟蘭資源的合理開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UltiMate 3000型高效液相色譜儀(DIONEX)(四元梯度泵、二極管陣列檢測器)，LGC-1025M型柱溫箱及Chromeleon色譜數(shù)據(jù)工作站；HC1003型精密天平(上?；ǔ备呖芼=1 mg)；PTY-224型分析天平(美國普力斯特d=0.01 mg)；DFT-100型手提式粉碎機(jī)(上海新諾儀器設(shè)備有限公司，功率：400 W)；HT-9013A型電熱恒溫干燥箱(東莞華臺(tái)測試儀器有限公司)；US-15D超聲波清洗器[中科儀(北京)儀器有限公司，清洗頻率：40 kHz]。

1.2 試藥 狹葉金粟蘭樣品分別于2018年6月23日采自湖北省丹江口市六里坪鎮(zhèn)和2018年7月14日采自湖北省竹山縣上庸鎮(zhèn)，采集的樣品由湖北醫(yī)藥學(xué)院陳吉炎教授鑒定，確定為金粟蘭科植物狹葉金粟蘭ChloranthusangustifoliusOliv。綠原酸對(duì)照品(批號(hào)：101023-201705，純度：99.15%，上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司)、傘形花內(nèi)酯對(duì)照品(批號(hào)：101402-201609，純度：99.2%，中國藥品生物制品檢定所)、異嗪皮啶對(duì)照品(批號(hào)：110821-201501，純度：98.77%，中國藥品生物制品檢定所)；乙腈(色譜純，天津賽孚瑞科技有限公司)；磷酸(分析純，南昌瑞鈴化工有限公司)；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品預(yù)處理 狹葉金粟蘭樣品在采集時(shí)要求選取的植株生長年限一致，采集時(shí)要保證植株完好。將采集到的樣品植株的根、莖和葉分離，每3個(gè)單株作為一個(gè)樣品，共得到根、莖和葉樣品各6份，分別編號(hào)為狹葉金粟蘭根01～06號(hào)樣品、狹葉金粟蘭莖01～06號(hào)樣品、狹葉金粟蘭葉01～06號(hào)樣品。將得到的樣品清除雜質(zhì)，于鼓風(fēng)干燥箱中干燥，用粉碎機(jī)粉碎并過60目篩、備用。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取綠原酸、傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶對(duì)照品適量，用甲醇溶解后制成質(zhì)量濃度分別為0.368 7、0.016 7、0.054 3 mg/ml的溶液，用0.22 μm濾膜過濾，濾液即為混合對(duì)照品溶液，用封口膜封口，置冰箱(2～5 ℃)中保存。

2.2.2 供試品溶液的制備 取預(yù)處理后的狹葉金粟蘭根、莖和葉粉末樣品2 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入75%甲醇50 ml，采用加熱回流法提取1 h，放冷后再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量。補(bǔ)足重量后搖勻，濾過，再取續(xù)濾液，用0.45 μm濾膜過濾，即得。

2.3 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 色譜柱：Phenomenex C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，進(jìn)行梯度洗脫：0～9 min，12%～20%A；9～15 min，20%～25% A；15～25 min，25%～35% A；25～45 min，35%～45% A，45～60 min，45%～20%A；流速：1.0 ml/min；檢測波長330 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μl。

在上述色譜條件下，進(jìn)樣“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液及“2.2.2”項(xiàng)下狹葉金粟蘭根01號(hào)供試品溶液。結(jié)果顯示，綠原酸保留時(shí)間約為8.34 min；傘形花內(nèi)酯保留時(shí)間約為14.76 min；異嗪皮啶保留時(shí)間約為32.05 min；理論塔板數(shù)均不低于7 000；供試品色譜峰的DAD匹配值不低于999.13，說明供試品溶液中的綠原酸、傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶色譜峰與其相鄰的色譜峰分離較好。見圖1。

圖1 混合對(duì)照品與供試品HPLC圖注：A.混合對(duì)照品，B.供試品；1.綠原酸，2.傘形花內(nèi)酯，3.異嗪皮啶

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，分別用甲醇稀釋成含綠原酸6.144 7、7.373 6、9.217 0、12.289 3、18.434、36.868 μg/ml，傘形花內(nèi)酯0.278 7、0.334 4、0.418 0、0.557 3、0.836 0、1.672 0 μg/ml，異嗪皮啶0.904 7、1.085 6、1.357 0、1.809 3、2.714 0、5.428 0 μg/ml系列對(duì)照品溶液。按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量20 μl，記錄峰面積。以對(duì)照品的濃度為橫坐標(biāo)(X)，綠原酸、傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制此3種成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得綠原酸、傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶的回歸方程。其線性范圍、回歸方程和相關(guān)系數(shù)結(jié)果見表1。

表1 綠原酸、傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶回歸方程和線性范圍

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下含綠原酸0.368 68 mg/ml、傘形花內(nèi)酯0.016 7 mg/ml、異嗪皮啶0.054 3 mg/ml的混合對(duì)照品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，測定次數(shù)為6次，記錄綠原酸、傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶的峰面積。測定結(jié)果顯示，綠原酸、傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶峰面積的RSD分別為1.28%、1.16%和1.37%，均在2%范圍內(nèi)，說明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取狹葉金粟蘭根01號(hào)樣品、狹葉金粟蘭莖02號(hào)樣品、狹葉金粟蘭葉05號(hào)樣品各6份，每份2 g，準(zhǔn)確稱定后制備供試品溶液，制備方法如“2.2.2”項(xiàng)下所述，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過后按“2.3”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測定，進(jìn)樣量20 μl，記錄綠原酸、傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶的峰面積。結(jié)果顯示，按含量計(jì)算，狹葉金粟蘭根中綠原酸、傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶的RSD分別為1.19%、1.14%、1.35%，狹葉金粟蘭莖中綠原酸、傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶的RSD分別為1.41%、1.37%、1.18%，狹葉金粟蘭葉中綠原酸、傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶的RSD分別為1.27%、1.33%、1.52%，說明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取狹葉金粟蘭根01號(hào)樣品、狹葉金粟蘭莖01號(hào)樣品、狹葉金粟蘭葉01號(hào)樣品各2 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過后，分別于0、1、2、3、6、9、12、24、48 h按“2.3”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測定，記錄綠原酸、傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶的峰面積。結(jié)果顯示，狹葉金粟蘭根中綠原酸、傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶峰面積的RSD分別為1.48%、1.27%、1.16%，狹葉金粟蘭莖中綠原酸、傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶峰面積的RSD分別為1.31%、1.27%、1.48%，狹葉金粟蘭葉中綠原酸、傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶峰面積的RSD分別為1.54%、1.22%、1.65%，說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取狹葉金粟蘭根01號(hào)樣品6份，每份2 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入75%甲醇50 ml，再加入含綠原酸、傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶質(zhì)量濃度分別為0.368 7、0.016 7、0.054 3 mg/ml的混合對(duì)照品溶液1.0 ml，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過后，按“2.3”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算加樣回收率及RSD，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率結(jié)果(n=6)

2.9 樣品含量測定 分別稱取狹葉金粟蘭根01～06號(hào)樣品、狹葉金粟蘭莖01～06號(hào)樣品、狹葉金粟蘭葉01～06號(hào)樣品各2 g，準(zhǔn)確稱定后制備供試品溶液，制備方法如“2.2.2”項(xiàng)下所述。制備好的供試品溶液按“2.3”項(xiàng)下的色譜條件，測定綠原酸、傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶的峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量。測定結(jié)果見表3。

表3 狹葉金粟蘭不同部位中綠原酸、傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶的含量(μg/g)

3 討論

3.1 檢測波長的確定 二極管陣列檢測器(DAD)具有靈敏度高、噪音低、線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)?！吨袊幍洹分挟愢浩むさ淖畲笪詹ㄩL為342 nm，而綠原酸的最大吸收波長為330 nm，傘形花內(nèi)酯的最大吸收波長為327 nm，試驗(yàn)中對(duì)綠原酸、傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶對(duì)照品溶液進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)在330 nm波長下綠原酸、傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶均有靈敏度高的較強(qiáng)吸收，故最終決定檢測波長330 nm。

3.2 流動(dòng)相的確定 流動(dòng)相體系和流動(dòng)相比例對(duì)所分析成分與相鄰峰的分離效果有主要影響。根據(jù)文獻(xiàn)[12-16]，本試驗(yàn)分別探索了乙腈-0.1%磷酸溶液和甲醇-0.1%磷酸溶液作為流動(dòng)相下，各成分的分析效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙腈-0.1%磷酸溶液流動(dòng)相對(duì)狹葉金粟蘭樣品的分離效果要更好。但以乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行分離時(shí)仍存在綠原酸和相鄰的雜質(zhì)峰分離不好的情況，故本試驗(yàn)又嘗試了改變乙腈和0.1%磷酸溶液的比例，采用梯度洗脫，并通過調(diào)節(jié)流速，控制柱溫，最終將綠原酸和相鄰的雜質(zhì)峰進(jìn)行了很好的分離。故最終確定了流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液，并按“2.3”項(xiàng)下條件進(jìn)行梯度洗脫。

3.3 提取方法的選擇 本試驗(yàn)為了更好地提取狹葉金粟蘭根、莖、葉中的綠原酸、傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶，通過參考文獻(xiàn)[17-19]，對(duì)這3種成分的提取方法進(jìn)行了探索，課題組分別對(duì)比了索氏提取法、超聲提取法和加熱回流法的提取效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加熱回流法提取的綠原酸、傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶含量較另2種方法更高。確定提取方法后，課題組又探索了提取時(shí)間(0.5、1、1.5、2、2.5 h)、料液比(1∶10、1∶25、1∶50、1∶75、1∶100)對(duì)提取效率的影響。結(jié)果顯示，狹葉金粟蘭3個(gè)部位的提取方法都可以確定為：加熱回流法，75%甲醇作為溶劑，提取時(shí)間為1 h，料液比為1∶25。

3.4 含量測定結(jié)果 通過狹葉金粟蘭各部位中綠原酸、傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶的含量測定結(jié)果可知，狹葉金粟蘭根中的綠原酸、傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶含量最高，分別為184.34 μg/g、8.36 μg/g和27.14 μg/g。狹葉金粟蘭各部位中這3種成分的含量趨勢為：根>莖>葉，此結(jié)果與袁琴琴等[14]研究的同屬植物銀線草不同部位異嗪皮啶含量的差異相同，但各部分含量差異不及其研究結(jié)果中的差異之大。狹葉金粟蘭作為藥材使用時(shí)，不同地區(qū)使用的部位不同，有些地區(qū)以全草入藥，有些地區(qū)以根莖入藥，本測定結(jié)果說明，狹葉金粟蘭藥材中的綠原酸、傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶以根中最多，在使用狹葉金粟蘭時(shí)，可對(duì)其不同部位的藥理活性和臨床應(yīng)用進(jìn)行區(qū)別，以達(dá)到最好使用的效果。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)研究建立了HPLC-DAD法測定狹葉金粟蘭不同部位中綠原酸、傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶含量的方法，通過HPLC對(duì)狹葉金粟蘭不同部位中綠原酸、傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶含量進(jìn)行了測定，結(jié)果顯示，狹葉金粟蘭不同部位中綠原酸、傘形花內(nèi)酯和異嗪皮啶的含量次序?yàn)椋焊?莖>葉。試驗(yàn)建立的方法簡便快捷、準(zhǔn)確可靠，專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性高，可為狹葉金粟蘭藥材的資源開發(fā)和利用提供參考依據(jù)。