趙 孟 王玉婷 戢漢斌?

［1.武漢市武東醫(yī)院）武漢市第二精神病醫(yī)院）， 湖北 武漢430084； 2.武漢大學(xué)藥學(xué)院實驗中心， 湖北武漢430072］

抑郁癥是一種持續(xù)的心境低落，甚至有自殘、自殺等行為的精神疾病，有研究認(rèn)為其與遺傳、外界環(huán)境應(yīng)激等相關(guān)［1］，但具體的病理機制尚不明確。臨床報道顯示抑郁癥患者外周血中5?羥色胺（5?HT）和多巴胺（DA）等神經(jīng)遞質(zhì)的水平是顯著降低的，因此大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為中樞系統(tǒng)單胺遞質(zhì)失衡，如5?HT、DA、NE 下調(diào)可能是導(dǎo)致抑郁發(fā)生的主要原因［2?3］。目前，臨床上抗抑郁治療的一線藥物是氟西汀，作為選擇性5?HT 再攝取抑制劑，它能通過抑制突觸間隙對5?HT 的再攝快速逆轉(zhuǎn)中樞及外周單胺遞質(zhì)水平的失衡；但不足的是患者服藥治療后抑郁癥狀緩解相對滯后［4?5］，這表明不僅單胺遞質(zhì)參與了抑郁的生理病理過程，其他因子可能也參與其中。在長期應(yīng)激刺激下，機體下丘腦?垂體?腎上腺皮質(zhì)HPA 軸功能持續(xù)亢進，由于海馬神經(jīng)元腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）水平下調(diào)，海馬結(jié)構(gòu)和功能隨之發(fā)生改變［6］，這可能使抑郁進一步加劇。因此，從天然產(chǎn)物中尋找治療神經(jīng)精神類疾病的活性單體物質(zhì)，彌補現(xiàn)有藥物療效的不足，探討相關(guān)的作用機制是近年來中醫(yī)藥研究的熱點。

金銀花lonicera japonica屬于忍冬科科植物，自古就被譽為清熱解毒的良藥。研究表明金銀花醇提物中富含大量黃酮類物質(zhì)，其中最主要的成分就是木樨草苷（cy?narosid）［7?8］，它可通過血腦屏障，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、提高免疫力等生理功效。然而，金銀花木樨草苷對中樞系統(tǒng)神經(jīng)退行性精神疾病是否有改善作用，能否逆轉(zhuǎn)單胺遞質(zhì)失衡，緩解海馬結(jié)構(gòu)損傷和功能障礙，治療抑郁尚未見相關(guān)文獻報道。因此，本文將探究金銀花木樨草苷對大鼠抑郁行為的改善作用，并探討其是否通過調(diào)節(jié)海馬BDNF 表達(dá)及單胺遞質(zhì)系統(tǒng)發(fā)揮抗抑郁作用。

本研究通過慢性不可預(yù)知性應(yīng)激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）結(jié)合孤養(yǎng)法構(gòu)建大鼠抑郁模型，采用曠場實驗，懸尾實驗和強迫游泳實驗評估藥物治療前后大鼠行為學(xué)的改變；高效液相?熒光分析法測定中樞系統(tǒng)單胺遞質(zhì)5?HT、NE、DA 水 平，Western blot 和RT?PCR 測 定BDNF 蛋白及mRNA 的表達(dá)，初步探討金銀花木樨草苷抗抑郁作用機制，為后續(xù)單體活性物質(zhì)的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 雄性SD 大鼠48 只，體質(zhì)量180～200 g ［湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（湘）2011?0003］，自由覓食、飲水，飼養(yǎng)于自然光暗周期的環(huán)境中。

1.2 試劑與藥物 金銀花（亳州市雙寶中藥材有限公司，一等品）。羧甲基纖維素鈉、鹽酸氟西汀片（批號2079A）購自禮來蘇州制藥有限公司。木樨草苷、5?羥色胺（5?HT）、去甲腎上腺素（NE）、多巴胺（DA）均購自美國Sigma 公司；BDNF 引物由美國Invitrogen 公司合成，TRIzol總RNA 提取試劑盒購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；cDNA Kit 合成試劑盒購自羅氏公司。氟西汀、金銀花木樨草苷用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液現(xiàn)配成混懸液。

1.3 儀器 HH?600 水浴鍋（科華儀器有限公司）；HPLC高效液相色譜儀（日本島津公司）；ANTEC 熒光檢測器（荷蘭安泰克公司）。

2 方法

2.1 金銀花木樨草苷的提取 將文獻方法略微調(diào)整，醇提金銀花木樨草苷［7?8］。將金銀花花瓣粉碎，取50 g 溶于500 mL 70% 乙醇中浸泡24 h，75 ℃回流提取3 h，提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無乙醇味，蒸餾水配成1 g／mL 醇提物，混合液經(jīng)101 大孔樹脂分離得到粗提液，收集后經(jīng)HPLC 測定其含有量。分析采用Cosmosil π?NAP C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），梯度洗脫（0～15 min，甲醇∶ 0.4%H3PO4＝1 ∶ 9；15～40 min，甲醇∶0.4% H3PO4＝2 ∶8；40 min 后，甲 醇 ∶ 0.4% H3PO4＝3 ∶ 7）；體積流 量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波 長350 nm；進樣量20 μL。

將濃縮液干燥成膏（棕褐色，每1 g 生藥含木樨草苷4.74 mg），生理鹽水溶解，配成高、中、低3 個劑量，即100、50、25 mg／kg。

2.2 分組、造模及給藥

2.2.1 分組 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后禁水不禁食24 h，然后給予1%蔗糖水，測定1 h 內(nèi)消耗量。選擇48 只攝入量相近的大鼠，隨機分空白組、模型組、氟西汀組、金銀花木樨草苷組（100、50、25 mg／kg），每組8 只。

2.2.2 造模 空白組大鼠采用合籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境室溫（24±1）℃，相對濕度（60±10）%，正常進食飲水，不給予任何刺激，其余組采用CUMS 結(jié)合孤養(yǎng)法構(gòu)建大鼠慢性應(yīng)激抑郁模型，每籠飼養(yǎng)1 只，連續(xù)4 周每天下午15：00 給予2 種不同的刺激，包括晝夜顛倒（24 h）、禁食（24 h）、禁水（24 h）、4 ℃冰水游 泳（5 min）、45 ℃熱 烘（5 min）、潮濕飼養(yǎng)（潮濕墊料）［9?10］。于實驗前后對6 組大鼠進行行為學(xué)測試，評估抑郁癥狀、造模是否成功。

2.2.3 給藥 實驗邊造模邊給藥，每天上午10：00 灌胃1次?？瞻捉M和模型組均給予0.5% 羧甲基纖維素鈉混懸液（10 mL／kg），鹽酸氟西汀組給予0.5% 羧甲基纖維素鈉配制的氟西汀懸浮液（2 mg／kg），金銀花木樨草苷高、中、低組則分別給予0.5%羧甲基纖維素鈉配制的金銀花木樨草苷懸浮液（100、50、25 mg／kg），連續(xù)4 周。末次給藥后進行行為學(xué)測試，評估完成后進行各個指標(biāo)的檢測。

2.3 行為學(xué)評估 于實驗前和實驗開始第28 天灌胃給藥后1 h，進行曠場實驗、懸尾實驗和強迫游泳實驗，評估各組大鼠行為狀態(tài)。

2.3.1 曠場實驗 參照文獻［9?10］，將各組大鼠放入5×5 的25 格紙箱中（100 cm×100 cm），記錄5 min 內(nèi)運動情況（直立次數(shù)、水平穿過格數(shù)），直立次數(shù)以雙前爪同時抬起為準(zhǔn)，以3 只以上爪同時在1 個格子為穿越1 個水平格子。

2.3.2 懸尾實驗 參考文獻［9?10］，用膠帶黏住大鼠尾端2 cm 的部位，懸掛在距離桌面50 cm 的架子上，頭朝下，前后左右均無攀抓物，一段時間后大鼠活動減少，觀察6 min 的活動情況，大鼠靜止垂直倒懸的時間為懸尾不動時間，其中前1 min 不作記錄，記錄后5 mim 內(nèi)時間。

2.3.3 強迫游泳實驗 參考文獻［9?10］，將大鼠置于一個透明容器內(nèi)（高度為60 cm，直徑為25 cm），保持水位為30 cm，水溫為（25±2）℃。觀察大鼠6 min 的行為狀況，記錄后5 min 內(nèi)游泳不動時間（大鼠在水上漂浮沒有四肢的掙扎，偶爾移動僅是保持頭部露在水面以上）。

2.4 高效液相?熒光法（HPLC?F）測定大鼠海馬單胺遞質(zhì)水平 于實驗第28 天完成行為學(xué)實驗后，斷頭處死各組大鼠，迅速在冰上剝離大腦，取出海馬組織，稱量后置組織冷凍管中，液氮快速冷凍備用。稱取一定量的海馬組織，加入適量預(yù)冷的0.1 mol／L 過氯酸（含0.3 mmol／L EDTA二鈉和0.5 mmol／L 亞硫酸鈉），冰水浴中超聲勻漿，4 ℃避光靜置一段時間后10 000 r／mim 離心10 min，取上清液過濾后，HPLC?F 測定單胺遞質(zhì)水平，取20 μL 過濾液自動進樣測定。條件為Diammonsilim C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相100 mmol／L 枸櫞酸?檸檬酸鈉緩沖液（pH ＝4.0），0.1 mmol／L EDTA，16% 甲醇；體積流量0.8 mL／min；熒光檢測器激發(fā)波長254 nm，發(fā)射波長340 nm，單胺遞質(zhì)水平單位以ng／g 表示。

2.5 RT?PCR 檢測 稱取各組大鼠海馬50 mg，采用TRIzol法提取總RNA，然后將1 μg 總RNA 通過cDNA Kit 試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄。熒光定量PCR 在LightCycler＠480（Roche 公司）設(shè)備中進行，每個樣品設(shè)置3 個重復(fù)，并以GAPDH作為內(nèi)參，定量PCR 特異產(chǎn)物通過溶解曲線分析，以2-ΔΔct表示相對基因表達(dá)變化，引物序列見表1。

表1 引物序列

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 21.0 軟件對數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗，計量數(shù)據(jù)以（）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 金銀花木樨草苷含有量測定 根據(jù)文獻方法提取分離金銀花木樨草苷，并采用HPLC 進行含有量測定［7?8］，根據(jù)對照品質(zhì)量濃度（X，mg／mL）和峰面積（Y）進行線性回歸，得方程為Y＝323.86X-61.62（r＝0.999）。由圖1A 可知，木樨草苷色譜峰保留時間為25 min，1 g／mL 金銀花醇提物經(jīng)大孔樹脂分離后，其質(zhì)量濃度為4.74 mg／mL。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

3.2 金銀花木樨草苷對抑郁大鼠行為學(xué)的影響 如表2 所示，實驗前各組大鼠水平和垂直自主活動量相近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；4 周后，模型組大鼠水平穿越格數(shù)和直立次數(shù)較空白組降低（P＜0.05）；給予氟西汀和金銀花木樨草苷干預(yù)后，大鼠水平穿格數(shù)和直立次數(shù)與模型組比較增加（P＜0.05），且金銀花木樨草苷對抑郁大鼠自主活動的改善作用隨著給藥劑量升高而增加，其療效接近陽性藥氟西汀。

表2 各組大鼠水平方向運動格數(shù)和直立次數(shù)（， n＝8）

表2 各組大鼠水平方向運動格數(shù)和直立次數(shù)（， n＝8）

注：與空白組比較，?P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05。

由表3 可知，實驗前各組大鼠懸尾和游泳不動時間非常接近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；經(jīng)過4 周慢性應(yīng)激刺激造模后，模型組大鼠懸尾和游泳不動時間延長（P＜0.05）；給予氟西汀和金銀花木樨草苷后，懸尾和游泳不動時間減少（P＜0.05），不動時間縮短了30～50 s，大鼠抑郁不動狀態(tài)得到逆轉(zhuǎn)，且高劑量組效果更優(yōu)，呈現(xiàn)劑量依賴性。

3.3 金銀花木犀草苷對大鼠海馬區(qū)單胺遞質(zhì)水平的影響 圖2A 為神經(jīng)遞質(zhì)NE、DA、5?HT 標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖，峰保留時間分別為4.85、5.35、7.25 min，分離度良好?？瞻捉M海馬組織色譜圖如圖2B 所示，分別在5.0、5.5、7.5 min檢測到NE、DA、5?HT。各組大鼠海馬組織神經(jīng)遞質(zhì)含有量測定結(jié)果見圖2C，與空白組比較模型組大鼠海馬內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5?HT、NE、DA 水平降低（P＜0.05）；藥物干預(yù)后，各組大鼠海馬組織單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平與模型組相比有大幅回升（P＜0.05），其中氟西汀組更明顯，金銀花木樨草苷高劑量組次之，療效與給藥劑量有關(guān)。

3.4 金銀花木犀草苷對大鼠海馬區(qū)BDNF 蛋白和mRNA 表達(dá)的影響 如圖3 所示，與空白組相比，模型組海馬區(qū)BDNF 蛋白和mRNA 表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）；氟西汀和金銀花木樨草苷能改善大鼠抑郁行為，還能使海馬區(qū)BDNF 蛋白、mRNA 表達(dá)上調(diào)，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

4 討論

近年來，中醫(yī)藥發(fā)展迅速，從天然產(chǎn)物中提取有效活性單體治療相關(guān)疾病成為中醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點。本文探究了金銀花木犀草苷對抑郁大鼠行為狀態(tài)的影響，結(jié)果證實了其良好的抗抑郁作用。大鼠經(jīng)過4 周慢性不可預(yù)知性應(yīng)激后，自主活動量較空白組明顯減少，懸尾及游泳不動時間顯著增加。這一結(jié)果和鄧海峰等人的研究一致［10］，在不良應(yīng)激源刺激下，大鼠自主活動減少，興趣喪失，長期處于呆滯狀態(tài)，絕望無助的表現(xiàn)與臨床抑郁癥患者精神運動性抑制、興趣缺失等癥狀相同。給予金銀花木樨草苷和氟西汀治療后，大鼠在曠場試驗中自主活動明顯增加，懸尾及游泳不動時間縮短，證明了金銀花木樨草苷能改善動物的抑郁行為，具有一定的抗抑郁作用。

表3 各組大鼠懸尾不動時間和游泳不動時間（， n＝8）

表3 各組大鼠懸尾不動時間和游泳不動時間（， n＝8）

注：與空白組比較，?P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05。

圖2 金銀花木犀草苷對大鼠海馬區(qū)單胺遞質(zhì)水平的影響

圖3 金銀花木犀草苷對大鼠海馬區(qū)BDNF 表達(dá)的影響

抑郁癥的發(fā)病機制假說眾多，其中單胺遞質(zhì)假說和神經(jīng)營養(yǎng)假說得到廣泛認(rèn)可。單胺遞質(zhì)假說提出抑郁癥的生物學(xué)基礎(chǔ)是中樞系統(tǒng)單胺遞質(zhì)5?HT、NE、DA 的缺乏。大腦5?HT 系統(tǒng)、NE 系統(tǒng)和DA 系統(tǒng)參與了睡眠和情緒等生理活動的調(diào)控過程，而神經(jīng)遞質(zhì)的改變將直接或間接影響相關(guān)受體功能，5?HT 等水平低下的人群易產(chǎn)生抑郁情緒或行為［11］。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠海馬組織中的神經(jīng)遞質(zhì)5?HT、NE、DA 水平顯著下調(diào)，這和王含彥等人的報道相符［12］，在慢性應(yīng)激刺激下，大鼠中樞系統(tǒng)單胺遞質(zhì)水平減少，相關(guān)受體功能紊亂，進而產(chǎn)生抑郁樣行為。海馬區(qū)是應(yīng)激反應(yīng)的高位調(diào)節(jié)中樞，對情緒、學(xué)習(xí)和記憶的調(diào)控有著重要生理作用，臨床報道顯示抑郁癥患者海馬部位的結(jié)構(gòu)和功能均發(fā)生了明顯改變［13］。神經(jīng)營養(yǎng)假說認(rèn)為［14?16］，海馬結(jié)構(gòu)和功能的改變是由于海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，BDNF 具有神經(jīng)保護和抗凋亡作用，其水平升高有助于抑制海馬神經(jīng)元的凋亡。研究表明［17?18］，單胺遞質(zhì)系統(tǒng)與BDNF 的表達(dá)密切相關(guān)，5?HT 等遞質(zhì)可以調(diào)節(jié)其表達(dá)，反之BDNF 也可以保護5?HT 等神經(jīng)元，促進突觸生長，增加突觸間隙神經(jīng)遞質(zhì)的含量。和空白組比較，模型組大鼠海馬區(qū)DBNF 蛋白和mRNA 表達(dá)顯著降低。金銀花木犀草苷可逆轉(zhuǎn)應(yīng)激刺激導(dǎo)致的海馬單胺遞質(zhì)水平的下降，給藥組大鼠海馬區(qū)5?HT、NE 和DA 水平顯著升高，同時BDNF 蛋白及mRNA 表達(dá)也明顯增加，說明金銀花木犀草苷可能是通過上調(diào)海馬區(qū)BDNF 表達(dá)量，逆轉(zhuǎn)海馬結(jié)構(gòu)和功能的改變，減少神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，從而調(diào)節(jié)中樞系統(tǒng)的單胺神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)揮抗抑郁療效，且高劑量組抗抑郁效果優(yōu)于低劑量組。

綜上所述，金銀花木樨草苷可逆轉(zhuǎn)并改善慢性應(yīng)激引起的抑郁樣行為，其可能的機制是上調(diào)海馬BDNF 表達(dá)，增加中樞單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平。