李曉霞 王志萍 ? 蔣雅嫻蘇佳昇劉 笑王孝勛馮 橋

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)， 廣西 南寧530001； 2.廣西高校中藥制劑共性技術(shù)研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣西 南寧530001； 3.廣西國(guó)際壯醫(yī)醫(yī)院， 廣西 南寧530001）

金母方是課題組前期優(yōu)化壯藥經(jīng)驗(yàn)方——婦雅凈方而成，由金剛刺、火炭母、白背葉根等9 味特色壯藥材組成，具有清火毒、除濕毒、滅蟲(chóng)毒、通龍路和水路等功效，臨床上主要用于治療陰道炎、慢性宮頸炎、子宮內(nèi)膜炎、附件炎。方中火炭母、虎杖、黃柏所含有效成分大多為醇溶性物質(zhì)［1］，對(duì)盆腔炎性疾病后遺癥的療效顯著，而且毒性較小，工藝簡(jiǎn)便，質(zhì)量可控［2?4］。該方原劑 型為湯劑，現(xiàn)擬將其改為顆粒劑，選用何種溶劑及工藝進(jìn)行提取是決定該制劑臨床療效的關(guān)鍵。

目前，優(yōu)化中藥復(fù)方提取工藝已成為研究熱點(diǎn)，有學(xué)者以成分含有量或結(jié)合干浸膏提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，正交實(shí)驗(yàn)、星點(diǎn)設(shè)計(jì)或結(jié)合人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化提取工藝［5?7］；還有學(xué)者先以正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，再通過(guò)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證［8］。本實(shí)驗(yàn)選擇抗炎、抑菌活性作為主要考核指標(biāo)，并結(jié)合星點(diǎn)設(shè)計(jì)?效應(yīng)面法來(lái)優(yōu)化壯藥金母顆粒提取工藝。

1 材料

1.1 儀器 Waters e2695 型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司）；SQP 型電子天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］；LDZX?75KBS 型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；DFY?1000型搖擺式高速萬(wàn)能打粉機(jī)（上海精勝科學(xué)儀器有限公司）；HWS?26 型電熱恒溫水浴鍋（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；LPH?250?A 型生化培養(yǎng)箱（廣東泰宏君科學(xué)儀器股份有限公司）；DHG?9140A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；98?1?B 型電子調(diào)溫電熱套。

1.2 試劑與藥物 金剛刺（批號(hào)Y18080604）、火炭母（批號(hào)17070202）、土茯苓（18031901）、白背葉根（批 號(hào) Y18101502 ）、虎 杖（批 號(hào)18051501）、犁頭草（批號(hào)Y18080604）等藥材均購(gòu)自廣西寶正藥業(yè)有限公司，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)韋松基教授鑒定為正品，符合2015 年版《中國(guó)藥典》 一部或《廣西壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》 各藥材項(xiàng)下要求。地塞米松（批號(hào)171702，廣東南國(guó)藥業(yè)有限公司）；營(yíng)養(yǎng)瓊脂（批號(hào)1080331）、水解酪蛋白胨（MH）肉湯（批號(hào)1069061）（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；紅四氮唑［批號(hào)I18007011，阿拉丁試劑（上海）有限公司］。虎杖苷（111575?01603，純度87.3%）、落新婦苷（111798?01504，純度93.9%）對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院）。乙腈、甲醇、磷酸為色譜純；其余試劑均為分析純；水為超純水。

1.3 動(dòng)物 SPF 級(jí)雌性昆明種小鼠32 只，體質(zhì)量（20±2）g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（湘）2016?0002。

1.4 細(xì)菌 金黃色葡萄球菌、大腸桿菌，均由廣西中醫(yī)藥大學(xué)微生物與免疫實(shí)驗(yàn)中心提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 虎杖苷、落新婦苷含有量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 Inertsil ODS?3 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）?水（B），梯度洗脫，程序見(jiàn)表1；體積流量1 mL／min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)291 nm；進(jìn)樣量10 μL。理論塔板數(shù)以虎杖苷計(jì)，不低于3 000；以落新婦苷計(jì)，不低于5 000。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

2.1.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取虎杖苷、落新婦苷對(duì)照品適量，稀乙醇制成每1 mL 分別含兩者32 μg、0.5 mg 的溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液制備 將金母顆粒提取液定容至2 000 mL量瓶中，混勻后精密量取5 mL，4 000 r／min離心10 min，過(guò)0.22 μm 微孔濾膜，即得。

2.1.4 陰性樣品溶液制備 按處方工藝取缺虎杖、缺金剛刺、缺土茯苓的陰性樣品適量，加10 倍量60%乙醇提取2 次，每次1 h，300 目濾布過(guò)濾，濃縮后60%乙醇定容于2 000 mL 量瓶中，精密量取5 mL，4 000 r／min 離心10 min，過(guò)0.22 μm 微孔濾膜，即得。

2.1.5 線性范圍考察 取對(duì)照品溶液適量，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得方程分別為虎杖苷Y＝8×106X＋8 163.1（R2＝0.999 9）、落新婦苷Y＝2×106X＋72 995（R2＝0.999 2），分別在0.010 9～0.314 3、0.117 6～3.380 4 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液適量，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得虎杖苷、落新婦苷峰面積RSD 分別為2.88%、1.50%，表明儀器精密度良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取藥材6 份，按“2.1.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得虎杖苷、落新婦苷峰面積RSD 分別為0.99%、1.47%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一份供試品溶液，于2、4、6、8、12、24 h 在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得虎杖苷、落新婦苷峰面積RSD分別為2.19%、2.96%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取虎杖苷、落新婦苷含有量已知的供試品溶液9 份，精密加入對(duì)照品溶液適量，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得虎杖苷、落新婦苷平均加樣回收率分別為99.46%、100.84%，RSD 均小于5%。

2.2 提取溶劑種類(lèi)篩選

2.2.1 提取物制備 按處方比例稱(chēng)取藥材共109 g，平行2 份，加入10 倍量水、60%乙醇加熱回流提取2 次，每次1 h，濾過(guò)，合并濾液，精密量取2 mL，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算虎杖苷、落新婦苷含有量。將提取液濃縮至近干，取浸膏適量，滅菌純水制成1 000 mg 生藥／mL藥液，依次稀釋至500、250、125、62.5、31.25、15.62、7.81、3.91、1.95 mg 生藥／mL，供體外抑菌實(shí)驗(yàn)用；另取浸膏適量，純水制成708.5 mg 飲片／mL 藥液，供棉球致小鼠肉芽腫實(shí)驗(yàn)用。

2.2.2 棉球致小鼠肉芽腫實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)［9］報(bào)道。32 只小鼠腹腔注射 10% 水合氯醛（0.04 mL／10 g）麻醉后，將已高壓滅菌的5 mg 棉球植于腋下。24 h 后，將小鼠隨機(jī)分為模型組、陽(yáng)性組（地塞米松）、金母顆粒水提物組、金母顆粒醇提物組，每組8 只，均以0.2 mL／10 g 劑量灌胃給予相應(yīng)藥物（模型組給予等量蒸餾水），連續(xù)7 d，于第8 天處死小鼠，打開(kāi)原切口，將棉球連同周?chē)Y(jié)締組織一起取出，剔除脂肪組織，置于60 ℃烘箱中干燥12 h，精密稱(chēng)定質(zhì)量，將其減去原棉球質(zhì)量，即為肉芽腫質(zhì)量，再計(jì)算其抑制率，結(jié)果見(jiàn)表2。由此可知，與模型組比較，金母顆粒水提物組、金母顆粒醇提物組肉芽腫質(zhì)量降低（P＜0.01），以后者更明顯（P＜0.01）。

表2 金母顆粒對(duì)肉芽腫質(zhì)量、抑制率的影響（，n＝8）Tab.2 Effects of Jinmu Granules on the weight and inhib?itory rate of granuloma（， n＝8）

表2 金母顆粒對(duì)肉芽腫質(zhì)量、抑制率的影響（，n＝8）Tab.2 Effects of Jinmu Granules on the weight and inhib?itory rate of granuloma（， n＝8）

注：與模型組比較，??P ＜0.01；與金母顆粒水提物組比較，＃＃P＜0.01。

2.2.3 體外抑菌實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)［9］報(bào)道。將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌菌液在4 000 r／min下離心15 min，棄去溶液，沉淀加生理鹽水制成菌液濃度1×108CFU／mL 的混懸液。在96 孔板最外圍的一圈中加入200 μL 水，往B2～B11、C2～C11、D2～D11、F2～F11、G2～G11 孔里加入“2.2.1” 項(xiàng)下藥液、混懸液各100 μL，往E2～E4、E5～E7 孔里加入混懸液各200 μL，緩慢搖勻后置于生化培養(yǎng)箱中，在37 ℃下培養(yǎng)24 h。配制1%紅四氮唑溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配），過(guò)0.22 μm 微孔濾膜，各取5 μL 加到每孔中，搖勻，置于37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，觀察各孔顯色情況，未顯現(xiàn)粉紅色的最低濃度即為最小抑菌濃度（MIC）。結(jié)果，金母顆粒水提物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的MIC 均為62.50 mg／mL，而醇提 物對(duì)兩者的 MIC 均 為31.25 mg／mL，即其抑菌活性更強(qiáng)，與 “2.2.2”項(xiàng)下結(jié)果一致。

2.2.4 虎杖苷、落新婦苷含有量測(cè)定 取“2.2.1”項(xiàng)下水提液、醇提液各2 mL，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算虎杖苷、落新婦苷含有量。結(jié)果，金母顆粒水提物中兩者分別為0.277 5、1.685 0 mg／g，而醇提物中分別為1.144 5、5.551 2 mg／g，即在后 者中更 高，與“2.2.2” 和“2.2.3” 項(xiàng)下結(jié)果一致。

2.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)篩選 按處方比例稱(chēng)取藥材共109 g，平行5 份，分別加入10 倍量50%、60%、70%、80%、90%乙醇，加熱回流提取2 次，每次1 h，300 目濾布過(guò)濾，合并濾液，真空濃縮回收溶劑至無(wú)醇味，轉(zhuǎn)移到蒸發(fā)皿中，水浴至近干，提取液用滅菌純水制成1 000 mg 生藥／mL 藥液，依次稀釋至500、250、125、62.5、31.25、15.62、7.81、3.91、1.95 mg 生藥／mL，按“2.2.3” 項(xiàng)下方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。由此可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)在50%～90%范圍內(nèi)均能不同程度地抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌增殖，以60%時(shí)最強(qiáng)。

表3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌MIC 的影響（mg／mL）Tab.3 Effects of ethanol concentration on the MICs of Staphylococcus aureus and Escherichia coli（mg／mL）

2.4 星點(diǎn)設(shè)計(jì)?效應(yīng)面法 對(duì)金母顆粒有效成分進(jìn)行分析后，將虎杖苷、落新婦苷含有量權(quán)重系數(shù)均設(shè)定為0.4；干膏率為次要指標(biāo)，故將其權(quán)重系數(shù)設(shè)定為0.2，采用Hassan 法對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換后計(jì)算“歸一值”（d），公式為di＝（Yi-Ymin）／（Ymax-Ymin），其中Ymax為指標(biāo)最大值，Ymin為指標(biāo)最小值，Yi為指標(biāo)i測(cè)定值，i為指標(biāo)數(shù)，再將其進(jìn)一步轉(zhuǎn)換為總評(píng)“歸一值”（OD），公式為OD＝，其中d1為虎杖苷含有量 “歸一值”，d2為落新婦苷含有量“歸一值”，d3為干膏率“歸一值”。

選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、提取時(shí)間（B）、乙醇用量（C）作為影響因素（提取次數(shù)為非連續(xù)變量，無(wú)法進(jìn)行回歸處理，故按前期單因素試驗(yàn)結(jié)果將其固定為2 次），落新婦苷、虎杖苷含有量及干膏率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)3 因素5 水平試驗(yàn)。因素水平見(jiàn)表4。

表4 因素水平Tab.4 Factors and levels

按處方比例稱(chēng)取藥材共109 g，按表4 參數(shù)加熱回流提取2 次，300 目紗網(wǎng)過(guò)濾，收集濾液，測(cè)定提取液中虎杖苷、落新婦苷含有量及干膏率，計(jì)算OD值（Y），結(jié)果見(jiàn)表5。

對(duì)表5 數(shù)據(jù)分別進(jìn)行多元線性回歸、二項(xiàng)式擬合，方程Y＝-0.860 66＋0.013 828A＋0.003 249B＋0.055 85C（R2＝0.384 0，P＝0.046 5）、Y＝-4.150 96 ＋0.092 55A＋0.044 78B＋0.138 1C-0.000 234 3AB-0.009 839AC＋0.000 055 62BC＋0.000 302 1A2-0.000 337 5B2＋0.020 36C2（R2＝0.701 7，P＝0.075 3），可知二項(xiàng)式方程R2明顯高于多元線性回歸方程，故本實(shí)驗(yàn)選擇其優(yōu)化提取工藝。方差分析見(jiàn)表6，可知各因素影響程度依次為A＞C＞B，其中A有顯著影響（P＜0.05）。響應(yīng)面分析見(jiàn)圖1。

表5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.5 Design and results of tests

表6 方差分析Tab.6 Analysis of variance

圖1 各因素響應(yīng)面圖Fig.1 Response surface plots for various factors

由此確定，最優(yōu)提取工藝為加熱回流提取2 次，第1 次加10 倍量60%乙醇，第2 次加8 倍量60%乙醇，每次45 min。再按照上述優(yōu)化工藝進(jìn)行3 批驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得OD值分別為0.764 1、0.780 3、0.763 0，平均0.769 1，RSD 為1.26%，表明工藝穩(wěn)定可行，重復(fù)性良好。

3 討論

壯藥金母方原劑型為湯劑，但因其服用、保存不便，故將其制成顆粒劑。該方主要用于治療慢性盆腔炎，其病因?yàn)榍捌诩?xì)菌感染、反復(fù)發(fā)作而形成炎癥［10］，方中主藥金剛刺、土茯苓主要成分為落新婦苷，虎杖主要成分為虎杖苷，兩者均具有抗炎抑菌的作用，可反映全方有效性［11?15］，故本實(shí)驗(yàn)以抗炎、抑菌活性為主要考核指標(biāo)來(lái)篩選提取溶劑。在工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中，乙醇體積分?jǐn)?shù)會(huì)對(duì)安全性、生產(chǎn)成本產(chǎn)生影響，故本實(shí)驗(yàn)又通過(guò)操作簡(jiǎn)便的體外抑菌實(shí)驗(yàn)來(lái)篩選其體積分?jǐn)?shù)。

中藥復(fù)方制劑臨床療效是方中各藥材發(fā)揮協(xié)同作用的結(jié)果，故方中單一成分不能全面反映其整體性和有效性。目前，常選擇有效成分含有量、干膏得率的加權(quán)綜合評(píng)分作為評(píng)價(jià)指標(biāo)［16?18］，故本實(shí)驗(yàn)采用虎杖苷、落新婦苷含有量及干膏率來(lái)綜合評(píng)價(jià)金母顆粒提取工藝的優(yōu)化效果。

另外，以抗炎、抑菌活性為主要考核指標(biāo)時(shí)，金母顆粒最優(yōu)提取溶劑為60%乙醇；以虎杖苷、落新婦苷含有量為主要考核指標(biāo)時(shí)，乙醇最優(yōu)體積分?jǐn)?shù)為70%，兩者不一致。最終確定，以抗炎、抑菌活性為主，從而突出基于該方藥效的核心地位。