王夢穎, 陳燁超, 涂鳳琴, 侯 靖, 楊 明, 盧躍鵬, 王煜紅, 楊 總, 陳 丹*

(1. 武漢食品化妝品檢驗(yàn)所, 湖北 武漢 430014; 2. SCIEX亞太技術(shù)支持中心, 上海 200050)

隨著人們對生活品質(zhì)的追求日益提高,具有清潔、護(hù)膚、美容和修飾等功能[1]的化妝品成了人們?nèi)粘Ｉ畋匦杵?但是彩妝及清潔類護(hù)膚品的過度使用容易讓皮膚變得敏感,受損皮膚在霧霾、花粉或惡劣氣候的持續(xù)暴露下容易出現(xiàn)紅腫、脫皮、發(fā)癢等不良反應(yīng)。不法商家為了抓住敏感肌膚人群的消費(fèi)市場,在化妝品中非法添加一些抗組胺類抗過敏藥物,并宣稱其商品具有鎮(zhèn)靜舒緩、修復(fù)敏感等功效,但抗組胺類藥物在臨床上主要用于蕁麻疹、濕疹、過敏性皮炎等皮膚病以及過敏性鼻炎、過敏性哮喘等呼吸道疾病,含有抗過敏藥物化妝品的長期使用容易造成藥物依賴性皮炎、皮膚色素沉積、角質(zhì)層變薄及皮炎等問題[2],商家在化妝品中非法添加抗過敏藥物的行為嚴(yán)重?fù)p害了消費(fèi)者利益。2015年11月國家食品藥品監(jiān)督管理總局頒布的《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》中明確規(guī)定9種抗組胺類抗過敏藥物(異丙嗪、羥嗪、奮乃靜、西替利嗪、氟奮乃靜、氯丙嗪、氯雷他定、特非那定、賽庚啶)不得作為生產(chǎn)原料和組分添加到化妝品中[3]。為了保證化妝品質(zhì)量安全,保障消費(fèi)者身體健康,需要加強(qiáng)對化妝品中抗過敏物質(zhì)的篩查分析。

目前抗組胺類抗過敏物質(zhì)的常用檢測方法主要包括液相色譜(HPLC)法[4,5]、氣相色譜(GC)法[6]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法[2,7]等。LC-MS由于具有快速簡便、選擇性好等特點(diǎn)被廣泛用于非法添加檢驗(yàn)領(lǐng)域,但其也存在分辨率較低,易出現(xiàn)假陽性等不足。而超高效液相色譜-四極桿-飛行時間高分辨質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF-HRMS)技術(shù)具有高質(zhì)量精度、全質(zhì)量數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)庫檢索等優(yōu)勢[8],其高分辨率能提高定性篩查能力,全質(zhì)量數(shù)據(jù)采集模式能降低陽性樣品遺漏,基于化合物二級碎片圖譜信息的數(shù)據(jù)庫檢索功能能夠增加定性準(zhǔn)確率,同時信息非依賴性采集(SWATH, sequential window acquisition of all theoretical mass spectra)與二級子離子定量技術(shù)相結(jié)合可實(shí)現(xiàn)化合物的準(zhǔn)確定量。隨著UPLC-Q-TOF-HRMS技術(shù)的日益成熟,其精確相對分子質(zhì)量定性和定量技術(shù)的優(yōu)勢能為化妝品中違禁使用藥物的測定提供有效解決方案。

本實(shí)驗(yàn)采用固相萃取凈化技術(shù)結(jié)合高分辨質(zhì)譜檢測,建立了基于UPLC-Q-TOF-HRMS技術(shù)的乳液類化妝品中9種抗過敏藥物的篩查和定量方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑及材料

X-500R超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜儀(美國SCIEX公司), ME204分析天平(瑞士Mettler toledo公司), Vortex-Genie2渦旋振蕩儀(美國Scientific Industries公司), Allegra 64R高速冷凍離心機(jī)(美國Beckman coulter公司), Milli-Q超純水機(jī)(德國Merck Millipore公司),固相萃取裝置(美國安捷倫公司),超聲波清洗機(jī)(英國Prima公司)。

包含鹽酸異丙嗪、鹽酸羥嗪、奮乃靜、鹽酸西替利嗪、氟奮乃靜、鹽酸氯丙嗪、氯雷他定、特非那定、賽庚啶等9種抗過敏物質(zhì)的混合液體標(biāo)準(zhǔn)品,每種化合物質(zhì)量濃度均在100 μg/mL左右(天津阿爾塔科技), Oasis PRiME HLB固相萃取小柱(200 mg, 3 mL,美國Waters公司), LC-C18固相萃取小柱(200 mg, 3 mL,德國CNW Technologies公司), Oasis HLB固相萃取小柱(200 mg, 6 mL,美國Waters公司),甲醇、乙腈和甲酸為色譜純(德國Merck公司),實(shí)驗(yàn)用水均為經(jīng)Milli-Q超純水機(jī)純化后的高純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確量取質(zhì)量濃度均約為100 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品母液1 mL于100 mL容量瓶中,用乙腈定容至刻度線,得到質(zhì)量濃度為1.00 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液A,取A溶液1 mL于10 mL容量瓶中,用乙腈定容至刻度線,得到質(zhì)量濃度為0.100 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液B。

分別準(zhǔn)確移取B混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0、10、20、50、100 μL, A混合標(biāo)準(zhǔn)溶液20、50、100、200 μL于進(jìn)樣小瓶中,用乙腈溶液定容至1 mL,得到質(zhì)量濃度分別為0、1、2、5、10、20、50、100、200 μg/L的純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取0.50 g乳液樣品于10 mL離心管中,加入4 mL乙腈,渦旋1 min,超聲處理10 min后于冷凍離心機(jī)中10 000 r/min離心10 min,取上清液過PRiME HLB柱,將流出液過0.22 μm有機(jī)濾膜后上機(jī)檢測。

1.4 儀器條件

1.4.1色譜條件

色譜柱:Waters XBridge C18(150 mm×2.1 mm, 5 μm);柱溫:40 ℃;進(jìn)樣量:10 μL;流動相:A相為0.1%甲酸水溶液,B相為乙腈;梯度洗脫程序:0～1.0 min, 3%B; 1.0～1.5 min, 3%B～15%B; 1.5～7.0 min, 15%B～45%B; 7.0～19.0 min, 45%B～98%B; 19.0～22.0 min, 98%B; 22.0～22.1 min, 98%B～3%B; 22.1～25.0 min, 3%B;流速:0.5 mL/min。

1.4.2質(zhì)譜條件

離子源:電噴霧離子源;掃描模式:正離子掃描;母離子掃描范圍:m/z100～1 000;離子源溫度:550 ℃;噴霧電壓:5 500 V;去簇電壓:65 V;霧化氣:379.22 kPa (55 psi);輔助霧化氣:379.22 kPa (55 psi);氣簾氣:241.32 kPa (35 psi)。質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集模式:采用信息依賴性采集模式(IDA)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)譜庫信息采集,利用SWATH模式進(jìn)行樣品質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。采用SCIEX OS 1.5軟件(美國SCIEX)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和處理。

1.5 化合物標(biāo)準(zhǔn)譜庫建立和定性、定量分析方法

準(zhǔn)備質(zhì)量濃度為50 μg/L包含9種目標(biāo)化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行上機(jī)檢測,采用IDA采集數(shù)據(jù),得到9種化合物的精確相對分子質(zhì)量、保留時間、同位素峰、特征碎片離子質(zhì)譜圖,建立包含上述信息的化合物標(biāo)準(zhǔn)譜庫,9種化合物的標(biāo)準(zhǔn)信息見表1。

實(shí)驗(yàn)樣品經(jīng)前處理后進(jìn)樣檢測,將采集得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SCIEX OS中數(shù)據(jù)分析模塊,將樣品質(zhì)譜信息與自建的化合物標(biāo)準(zhǔn)譜庫進(jìn)行比對。在相同的實(shí)驗(yàn)條件下,如果被測樣品在提取相應(yīng)分子離子的質(zhì)量色譜圖中出現(xiàn)了與標(biāo)準(zhǔn)品保留時間一致的色譜峰、精確質(zhì)量數(shù)偏差不高于5×10-6(5 ppm)、同位素豐度比差異不高于10%、二級質(zhì)譜圖譜庫匹配得分大于70分且兩個定性子離子豐度比誤差低于20%時,則可判斷被測樣品中存在相應(yīng)的化合物[9]。上述定性判定依據(jù)滿足歐盟法規(guī)(SANTE/11945/2015)中關(guān)于高分辨質(zhì)譜應(yīng)用于定性分析時的判定,即每個化合物對應(yīng)兩個質(zhì)量精度在5×10-6以內(nèi)的離子且兩個離子的豐度比誤差低于30%的規(guī)定。將樣品中被測化合物定量離子提取色譜峰的峰面積代入相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線中,計算得到樣品中被測化合物的濃度。

表 1 9種抗過敏藥物的Q-TOF-HRMS數(shù)據(jù)庫

1.6 基質(zhì)效應(yīng)評價

基質(zhì)效應(yīng)在質(zhì)譜分析中普遍存在,特別是在電噴霧電離模式下,共流出干擾物會對目標(biāo)離子造成不可預(yù)期的離子抑制或增強(qiáng)效應(yīng)[10]。本實(shí)驗(yàn)中通過基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的參數(shù)對比來評價護(hù)膚水的基質(zhì)效應(yīng)。準(zhǔn)確稱取0.50 g空白乳液樣品于10 mL離心管中,按1.3節(jié)中方法處理樣品,得到空白基質(zhì)溶液。取7支小瓶,分別加入0、5、10、20、50、100、200 μL混合標(biāo)準(zhǔn)使用液A,用空白基質(zhì)溶液定容至1 mL,得到質(zhì)量濃度分別為0、5、10、20、50、100、200 μg/L的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液,將上述基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液與1.2節(jié)中溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液一起進(jìn)行上機(jī)檢測,得到空白基質(zhì)和純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線。基質(zhì)效應(yīng)η=(基質(zhì)匹配曲線斜率-溶劑曲線斜率)/溶劑曲線斜率×100%[11,12],η的絕對值隨著基質(zhì)效應(yīng)的增強(qiáng)而變大,η為正值說明基質(zhì)增強(qiáng),負(fù)值則為基質(zhì)抑制。當(dāng)η絕對值<20%時表示基質(zhì)效應(yīng)微弱,η絕對值在20%～50%范圍內(nèi)時表示具有中等強(qiáng)度基質(zhì)效應(yīng),基質(zhì)效應(yīng)絕對值大于50%時表示基質(zhì)效應(yīng)較強(qiáng)[13,14]。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器方法優(yōu)化

2.1.1色譜方法

對9種化合物進(jìn)行初步的正負(fù)離子掃描發(fā)現(xiàn),在ESI+模式下可得到[M+H]+的分子離子峰,因此選擇正離子掃描模式,并嘗試在流動相中加入一定量的甲酸以增強(qiáng)離子化效率。實(shí)驗(yàn)比較水-乙腈與0.1%甲酸水-乙腈作為流動相體系時化合物的分離情況和響應(yīng)強(qiáng)度,結(jié)果見表2,表中數(shù)據(jù)顯示在加入甲酸的情況下大部分化合物母離子峰響應(yīng)提高,因此選擇0.1%甲酸水-乙腈作為流動相,并根據(jù)化合物出峰情況調(diào)整流動相洗脫梯度。結(jié)果表明,在1.4節(jié)方法下9種化合物均能出峰,且峰形良好。

表 2 兩種流動相體系下9種化合物的提取離子響應(yīng)強(qiáng)度

圖 1 羥嗪的二級碎片裂解途徑Fig. 1 Fragmentation pathway of hydroxyzine

圖 2 不同體積乙腈和甲醇作為提取溶劑時加標(biāo)樣中9種化合物的響應(yīng)強(qiáng)度Fig. 2 Response intensities of the nine compounds in spiked samples extracted with different volumes of acetonitrile and methanol

2.1.2質(zhì)譜方法

為了提高數(shù)據(jù)采集效率,實(shí)驗(yàn)中采用信息非依賴性SWATH掃描模式。與達(dá)到判定條件才能觸發(fā)二級掃描的信息依賴性IDA模式不同,它是一種全景式、連續(xù)性、高通量的數(shù)據(jù)非依賴性質(zhì)譜數(shù)據(jù)獲取方式,它通過對化合物母離子的質(zhì)量范圍進(jìn)行智能窗口劃分,采集每個窗口內(nèi)所有母離子的二級碎片,然后通過軟件去卷積技術(shù)進(jìn)行二級碎片歸屬。在本實(shí)驗(yàn)中首先用SWATH模式采集一個空白基質(zhì)樣品,得到樣品的總離子流信息,對在1～25 min內(nèi)檢測到的所有化合物依照質(zhì)量數(shù)的大小進(jìn)行排序,通過軟件根據(jù)相對分子質(zhì)量對其進(jìn)行連續(xù)平均分段,以該分段為依據(jù)設(shè)置SWATH掃描參數(shù)[15,16]。樣品中的化合物在色譜分離、質(zhì)譜檢測后得到詳細(xì)化合物分子信息,根據(jù)母離子峰保留時間、精確質(zhì)量數(shù)和同位素峰比值可以確定元素組成,由二級子離子碎片圖譜可以判定化合物的分子組成和裂解途徑,圖1展示了羥嗪的裂解途徑。

2.2 前處理方法優(yōu)化

2.2.1提取溶劑選擇

實(shí)驗(yàn)中比較了不同體積乙腈和甲醇對乳液類樣品中目標(biāo)化合物的提取效果。樣品中分別加入等量乙腈和甲醇,渦旋靜置后發(fā)現(xiàn),乙腈提取組中離心管底部出現(xiàn)明顯顆粒沉淀,分析出現(xiàn)這種情況的原因可能是由于乳液主要由水、甘油等多元醇、低碳脂肪酸、具有保濕功效的低聚糖、氨基酸、植物提取液等成分組成[17],乙腈能改變其中的部分低聚糖、多糖和氨基酸的溶解性,使其沉淀析出,這在一定程度上有助于乳液類基質(zhì)中雜質(zhì)的去除。隨后考察了4～8 mL的乙腈和甲醇對提取效果的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2,可以看出,隨著提取體積的增加,9種目標(biāo)物的響應(yīng)強(qiáng)度均有相似的下降趨勢,且整體而言乙腈的提取效果優(yōu)于甲醇,綜合經(jīng)濟(jì)成本和提取效率考慮,選擇4 mL乙腈作為提取溶劑。

2.2.2凈化條件優(yōu)化

樣品經(jīng)乙腈提取后,部分鹽及脂質(zhì)會隨化合物一并被提取出來,為減少它們對檢測結(jié)果的影響,實(shí)驗(yàn)考慮采用固相萃取小柱對提取液進(jìn)行凈化,期望提取液通過凈化柱后,脂質(zhì)等雜質(zhì)被保留在柱上,目標(biāo)物隨提取液流出,隨后便可將提取液直接過膜上機(jī),免去洗脫、氮吹置換溶劑等復(fù)雜操作,以達(dá)到簡單快速凈化的目的。于是考察了C18、HLB及PRiME HLB這3種小柱的凈化效果,結(jié)果經(jīng)C18和HLB固相萃取小柱凈化后的提取液中奮乃靜和氯丙嗪沒有回收,而經(jīng)PRiME HLB處理后,提取液中目標(biāo)化合物均能出峰,由表3中數(shù)據(jù)可以看出,經(jīng)PRiME HLB凈化后,9種目標(biāo)物均具有較高的響應(yīng)強(qiáng)度。同時采用PRiME HLB固相萃取柱對提取液進(jìn)行凈化,能在一定程度上降低雜質(zhì)對目標(biāo)色譜峰的干擾。以異丙嗪為例,從圖3可以看到,與未凈化的提取液相比,經(jīng)PRiME HLB凈化后的提取液中化合物附近干擾峰減少,所以確定前處理采用4 mL乙腈作為提取溶劑,以PRiME HLB固相萃取柱進(jìn)行提取液凈化。

表 4 9種抗過敏藥物采用一級母離子定量時的標(biāo)準(zhǔn)曲線和基質(zhì)效應(yīng)

采用UPLC-Q-TOF-HRMS以SWATH方式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集后,可以采用母離子峰面積定量或二級子離子峰面積定量,前者計算方便,是常規(guī)的定量方式,但存在抗基質(zhì)效應(yīng)能力弱,易被臨近峰干擾的風(fēng)險。后者是基于SWATH連續(xù)數(shù)據(jù)采集模式下的定量方式,采用高精度二級碎片定量分析選擇性更強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)中采用上述兩種定量方式分別對空白基質(zhì)溶液和純?nèi)軇┡渲茦?biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析,觀察曲線線性關(guān)系并比較在不同定量方式下基質(zhì)效應(yīng)的強(qiáng)弱,結(jié)果見表4及表5。

由表中數(shù)據(jù)可知,9種化合物在不同基質(zhì)中采用兩種方式定量時均具有良好線性,線性相關(guān)系數(shù)大于0.99,線性范圍為5～100 μg/L。當(dāng)采用母離子定量時,基質(zhì)對9種化合物均有一定程度的影響,其中對氟奮乃靜的基質(zhì)抑制效應(yīng)達(dá)到了40.81%。而采用子離子碎片定量后,基質(zhì)效應(yīng)減弱,η絕對值控制在20%以內(nèi)。為了增加定量準(zhǔn)確度,本方法選擇采用純?nèi)軇┡渲茦?biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)合子離子峰面積定量進(jìn)行樣品中目標(biāo)物質(zhì)濃度分析。

表 3 加標(biāo)樣品經(jīng)PRiME HLB凈化前后提取母離子色譜峰的響應(yīng)強(qiáng)度

圖 3 加標(biāo)樣品經(jīng)PRiME HLB凈化前后異丙嗪的提取母離子色譜峰圖Fig. 3 Extracted ion chromatograms of promethazine in spiked sample before and after PRiME HLB processing

表 5 9種抗過敏藥物采用二級子離子定量時的標(biāo)準(zhǔn)曲線和基質(zhì)效應(yīng)

表 6 9種抗過敏物質(zhì)在乳液類基質(zhì)中的加標(biāo)回收率、RSD和LOQ (n=6)

圖 4 加標(biāo)樣品中9種抗過敏化合物的提取離子色譜圖Fig. 4 Extracted ion chromatograms of the nine antiallergic compounds in spiked sample Peak identifications: 1. promethazine; 2. hydroxyzine; 3. perphenazine; 4. cetirizine; 5. fluphenazine; 6. chlorpromazine; 7. loratadine; 8. terfenadine; 9. cyproheptadine.

在0.50 g空白乳液樣品中分別添加50、100、300 ng混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),制備加標(biāo)量分別為0.10 mg/kg、0.20 mg/kg和0.60 mg/kg的加標(biāo)樣品,每組進(jìn)行6次平行實(shí)驗(yàn),加標(biāo)量為0.20 mg/kg樣品中9種目標(biāo)化合物的提取母離子色譜圖見圖4,加標(biāo)回收定量結(jié)果見表6。由圖4可以看出,9種目標(biāo)物均能夠正常出峰,響應(yīng)強(qiáng)度高,且具有較好的分離度。由表6中數(shù)據(jù)可以看到,當(dāng)添加水平為0.10 mg/kg時,9種化合物的加標(biāo)回收率為65.6%～107%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為4.1%～9.8%;在添加水平為0.20 mg/kg時,加標(biāo)回收率為70.4%～102%, RSD為1.8%～10%;在添加水平為0.60 mg/kg時,加標(biāo)回收率為65.3%～102%, RSD為1.3%～8.1%,在3個不同水平下加標(biāo)回收率均能滿足實(shí)驗(yàn)日常檢測的要求。

采用標(biāo)準(zhǔn)添加法來確定方法定量限,以10倍信噪比下各待測物質(zhì)的質(zhì)譜響應(yīng)值來計算乳液基質(zhì)中9種抗過敏物質(zhì)的定量限,結(jié)果見表6, 9種抗過敏物質(zhì)中除異丙嗪的定量限為0.10 mg/kg以外,其他8種物質(zhì)的定量限均為0.05 mg/kg,低于《化妝品安全技術(shù)規(guī)范2015版》[3]中基于LC-MS/MS的抗過敏物質(zhì)測定方法中的定量限(0.50 mg/kg),本方法具有更高的靈敏度。

2.5 實(shí)際樣品測定

采用本方法對市售的32份乳液樣品中9種抗過敏物質(zhì)進(jìn)行了測定,結(jié)果未出現(xiàn)陽性樣品,分析原因可能是此次檢測的樣品均為知名品牌產(chǎn)品,產(chǎn)品質(zhì)量有一定的保障。后期將對不同層次品牌進(jìn)行檢測,擴(kuò)大抽檢樣本量。

3 結(jié)論

本文建立了基于UPLC-Q-TOF-HRMS的乳液類化妝品中9種抗過敏物質(zhì)的篩查和定量分析方法,采用基于PRiME HLB小柱的“一步式”凈化方法,提取液經(jīng)過小柱后,不需要進(jìn)行后續(xù)淋洗和洗脫,可直接過膜上機(jī),與王燕芹等[2]采用的PCX小柱凈化法相比,該處理更簡便,耗時更短。采用SWATH數(shù)據(jù)采集模式結(jié)合碎片離子峰面積定量,在降低基質(zhì)效應(yīng)的同時保證了定性定量結(jié)果的準(zhǔn)確度。該方法靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度和線性關(guān)系良好,操作簡便快捷、靈敏可靠,可用于乳液類化妝品中違禁添加抗過敏物質(zhì)的快速篩查和準(zhǔn)確定量。