朱 峰, 姚志建, 霍宗利, 吉文亮, 劉華良, 周 慶, 李愛民, 焦 偉, 谷 靜*

(1. 江蘇省疾病預(yù)防控制中心, 南京 210009; 2. 南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院, 污染控制與資源化研究國家重點實驗室, 南京 210023; 3. 江蘇國創(chuàng)環(huán)?？萍加邢薰? 南京 211100)

解熱鎮(zhèn)痛類藥物主要分為非甾體類藥物和甾體類糖皮質(zhì)激素類藥物,常被用來退熱、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗風(fēng)濕等[1],例如吡羅昔康能減輕不同關(guān)節(jié)炎的疼痛以及治療術(shù)后炎癥[2]。該類藥物不能全部被機(jī)體吸收,通過人體排泄的方式以原型藥物或代謝藥物的形式進(jìn)入環(huán)境水體中,不易降解,且具有較強(qiáng)的生物毒性和富集性[3]。

近年來,解熱鎮(zhèn)痛類藥物的研究多集中于中成藥的非法添加[4-7]、獸藥的非法添加[8]、茶葉等食品的非法添加[9]以及生物樣本[10]的檢測,鮮有檢測環(huán)境水體中解熱鎮(zhèn)痛類藥物的文獻(xiàn)報道[11]。美國EPA-1694方法中僅涵蓋了一種解熱鎮(zhèn)痛類藥物[12]。環(huán)境水體中藥物的殘留質(zhì)量濃度很低,一般都在ng/L水平,通常需要通過富集濃縮才滿足儀器的檢測需求。目前,環(huán)境水體中的痕量藥物殘留通常采用固相萃取法[13-15]、分子印跡法[16]、磁性固相萃取法[17]等進(jìn)行富集濃縮,其中固相萃取技術(shù)的使用最為廣泛。該方法不僅富集倍數(shù)高,且操作簡單、方便,但固相萃取柱價格相對較高。課題組基于前期工作[18],以親水性的N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)以及疏水性的二乙烯苯(DVB)作為原料,將NVP、DVB和2-乙基乙烯苯共聚制得一種親水親油型的雙親性聚合材料(Guochuang hydrophilic material, GCHM),并將此材料填入裝有篩板的SPE管中,從而獲得GCHM固相萃取柱,成功用于水體中4種解熱鎮(zhèn)痛類藥物的富集濃縮,不僅成本低且效果好。

目前,解熱鎮(zhèn)痛類藥的檢測手段主要有表面增強(qiáng)拉曼光譜法[19]、薄層色譜法[20]、電化學(xué)傳感器[21]、液相色譜法[2,4,6]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[5,22]。其中液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法具有靈敏度高、定性能力強(qiáng)的特點,因此,更適合于水體中痕量解熱鎮(zhèn)痛類藥物的檢測需求。本文建立了環(huán)境水體中4種解熱鎮(zhèn)痛類藥物殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測技術(shù),并比較了基于課題組自主研發(fā)的固相萃取柱和商業(yè)化的固相萃取柱。結(jié)果表明,本方法簡單方便、成本低、效果好,適合環(huán)境水體中痕量水平解熱鎮(zhèn)痛類藥物的檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜儀(30A,日本島津公司),三重四極桿質(zhì)譜儀(QTRAP 5500,美國AB公司),全自動固相萃取儀(AQUA Trace ASPE799,日本島津公司), ACQUITY UPLC?HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm,美國Waters公司), GCHM固相萃取柱(500 mg, 6 mL,自主研發(fā)), Bond Elut Plexa固相萃取柱(500 mg, 6 mL,美國Agilent公司), Oasis HLB固相萃取柱(500 mg, 6 mL,美國Waters公司),有機(jī)系微孔濾膜(0.22 μm,津騰公司)。

色譜純甲醇(CH3OH)、乙腈(CH3CN)、甲酸(formic acid, FA)購自德國Merck公司,質(zhì)譜級水購自美國Fisher公司,分析純鹽酸、氨水、乙酸銨(NH4Ac)購自國藥集團(tuán)。對照品:吲哚美辛(Lot. 40121)、美洛昔康(Lot. 40917)購自德國Dr. Ehrenstorfer公司,吡羅昔康(Lot. 232322)、吡羅昔康-D3(Lot. 241931)、美洛昔康-D3(Lot. 252142)購自德國WITEGA公司,苯噻啶(Lot. P552800)購自加拿大Toronto Research Chemicals(TRC)公司。

對照品溶液:分別稱取適量解熱鎮(zhèn)痛類藥物及內(nèi)標(biāo)物,用甲醇溶解配成1 g/L的單一標(biāo)準(zhǔn)儲備液和單一內(nèi)標(biāo)儲備液;分別吸取適量單一標(biāo)準(zhǔn)儲備液配成1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液;分別吸取適量單一內(nèi)標(biāo)儲備液配成1 mg/L的混合內(nèi)標(biāo)使用液。

水樣采自上海、江蘇、廣東,分別選取5個水源水取水點作為采樣點,共計15份水樣,通過陸路或空運(yùn),48 h內(nèi)冷鏈運(yùn)送至實驗室分析。

1.2 儀器條件

1.2.1液相條件

分析柱為ACQUITY UPLC?HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)。流動相A為0.1%(v/v)甲酸水溶液,B相為乙腈。洗脫梯度:0～0.5 min, 95%A; 0.5～2.0 min, 95%A～70%A; 2.0～5.0 min, 70%A～60%A; 5.0～8.0 min, 60%A～20%A; 8.0～10.0 min, 20%A～5%A; 10.0～10.1 min, 5%A～95%A; 10.1～12.0 min, 95%A。柱溫箱溫度為40 ℃,流速為0.3 mL/min,自動進(jìn)樣器溫度為5 ℃,進(jìn)樣體積為5 μL。

1.2.2質(zhì)譜條件

電離方式:電噴霧離子(ESI)源,正離子掃描;監(jiān)測方式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;噴霧電壓:5.5 kV;離子源溫度:550 ℃;氣簾氣:31.5 L/min;輔助氣:6.6 L/min;霧化氣:8.4 L/min;各目標(biāo)物質(zhì)質(zhì)譜參數(shù)見表1。

1.2.3樣品前處理

取500 mL過濾后的水樣,用鹽酸或氨水調(diào)節(jié)pH=7.0±0.2,加入10 μL混合內(nèi)標(biāo)使用液,混勻,用預(yù)先經(jīng)5 mL甲醇、5 mL水活化過的固相萃取柱富集凈化,以20 mL/min的流速上樣,待上樣結(jié)束后,用5.0 mL的純水洗滌,正壓干燥固相萃取柱至近干后,用6.0 mL甲醇洗脫目標(biāo)物。

洗脫液在40 ℃水浴中用氮氣吹至近干,最后用0.5 mL 20%(v/v)的甲醇-水溶液復(fù)溶,渦旋混合2 min,過0.22 μm微孔濾膜后,供UPLC-MS/MS測定。

表 1 4種解熱鎮(zhèn)痛類藥物和2種內(nèi)標(biāo)化合物的質(zhì)譜參數(shù)

圖 1 采用不同流動相體系時4種解熱鎮(zhèn)痛類藥物的總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion chromatograms of the four antipyretic analgesics with different mobile phases a. 5 mmol/L NH4Ac-CH3OH; b. 0.1% (v/v) FA-CH3OH ; c. 0.1% (v/v) FA-CH3CN.

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

用蠕動泵將配制的單一標(biāo)準(zhǔn)溶液以7 μL/min的流速注入QTRAP 5500質(zhì)譜儀中,在Q1母離子掃描模式下,比較正離子掃描模式和負(fù)離子掃描模式,結(jié)果表明各目標(biāo)物質(zhì)均在正離子模式下具有更強(qiáng)的響應(yīng),且各母離子均為[M+H]+峰。進(jìn)一步在子離子模式下,通過調(diào)節(jié)碰撞能,選取各目標(biāo)物質(zhì)的最優(yōu)子離子。以信號最強(qiáng)的子離子作為定量離子,信號次強(qiáng)的子離子作為定性離子,通過優(yōu)化各離子對的去簇電壓和碰撞能,最終確定各目標(biāo)物質(zhì)的質(zhì)譜參數(shù)。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

比較了5 mmol/L NH4Ac-水溶液-甲醇、0.1%(v/v)甲酸水溶液-甲醇以及0.1%(v/v)甲酸水溶液-乙腈作為流動相時,各目標(biāo)物質(zhì)的分離及響應(yīng)情況。如圖1a、1b所示,當(dāng)流動相中加入酸后,各目標(biāo)物質(zhì)的總體響應(yīng)強(qiáng)度得到了明顯的提高,這主要是因為各目標(biāo)物質(zhì)均在正離子模式下進(jìn)行監(jiān)測,而酸能提高分析物在正離子模式下的響應(yīng)強(qiáng)度,因此采用0.1%(v/v)甲酸水溶液作為水相,進(jìn)一步比較了以甲醇和乙腈作為有機(jī)相時各目標(biāo)物的分離及響應(yīng)情況。如圖1b、1c所示,當(dāng)使用乙腈作為有機(jī)相時,各目標(biāo)物分離度更好,且響應(yīng)值與使用甲醇時無明顯區(qū)別。雖然乙腈的洗脫能力通常要較甲醇強(qiáng),可能會導(dǎo)致有些物質(zhì)因出峰快而不能實現(xiàn)基線分離,但在本實驗中,使用乙腈不僅縮短了分析時間,而且各目標(biāo)物具有更好的分離效果。最終本研究選用了0.1%(v/v)甲酸水溶液和乙腈作為流動相,4種解熱鎮(zhèn)痛類藥物及2種內(nèi)標(biāo)化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的多反應(yīng)監(jiān)測色譜見圖2。

圖 2 4種解熱鎮(zhèn)痛類藥物及2種內(nèi)標(biāo)化合物的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖Fig. 2 Chromatograms of the four antipyretic analgesics and the two internal standard compounds under MRM mode

2.3 固相萃取柱的選擇

基于本課題組前期工作[18],合成了一種具有親水親脂雙親屬性的NDAM-40填料。該填料對水體中的藥物及個人護(hù)理品具有較好的吸附性能。基于此填料研發(fā)了GCHM固相萃取柱,價格約為同類型商業(yè)化柱的一半左右。為了評估GCHM固相萃取的性能,與目前應(yīng)用最為廣泛的Waters HLB固相萃取柱和Agilent Bond Elut Plexa固相萃取柱進(jìn)行了比較。從圖3可知,4種目標(biāo)物質(zhì)在Waters、Agilent、GCHM固相萃取柱上的絕對回收率(未經(jīng)內(nèi)標(biāo)校正)分別在38.8%～97.6%、47.1%～81.7%、69.6%～102.1%范圍內(nèi),其中3種分析物在GCHM固相萃取柱上具有更高的絕對回收率,且4種分析物的絕對回收率均高于69.6%。對于PIZ, GCHM的富集效果為Waters HLB的1.8倍。綜上所述,本課題組研發(fā)的固相萃取柱對于選定的4種解熱鎮(zhèn)痛類藥物具有更好的綜合富集效果。

圖 3 目標(biāo)化合物在不同固相萃取柱上的絕對回收率(n=6)Fig. 3 Absolute recoveries of the target compounds on different solid phase extraction columns (n=6) Error bars represent one standard deviation of the six duplicates.

2.4 pH值對萃取效果的影響

圖 4 目標(biāo)化合物在不同pH下的絕對回收率(n=6)Fig. 4 Absolute recoveries of the target compounds with different pH values (n=6)

各目標(biāo)物質(zhì)的質(zhì)子化狀態(tài)是保留效率和萃取效率的重要參數(shù),由樣品的pH值所決定。比較了pH分別為3、7、9時,各目標(biāo)物質(zhì)在GCHM固相萃取柱上的富集效果。如圖4所示,當(dāng)pH值為3時,PIZ的絕對回收率僅為32.1%;當(dāng)pH值為7時,PIZ的絕對回收率提高了一倍多;進(jìn)一步提高pH值到9時,除PIZ的絕對回收率略有上升(3.3%),其余3種物質(zhì)的絕對回收率均呈下降趨勢。PIZ、PIR、MEL、IND 4種物質(zhì)的pKa值分別為6.9、6.3、4.1、4.5,介于弱酸性和中性之間。因此,當(dāng)體系呈堿性時,酸性目標(biāo)物解離度增大,呈離子化狀態(tài),導(dǎo)致其在雙親固相萃取柱上的保留能力減弱,這也解釋了當(dāng)pH值從7增加到9時,PIR、MEL、IND 3種弱酸性物質(zhì)的絕對回收率降低。而PIZ的pKa接近中性,因此酸性條件或堿性條件都可能會增加其解離度,故而雙親固相萃取柱對其吸附能力降低。綜上所述,pH值為7時,4種解熱鎮(zhèn)痛類藥物整體富集效果最佳,故本實驗選擇在pH值為7時對樣品進(jìn)行富集凈化。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)在液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)中普遍存在,主要是由于共提取物與目標(biāo)分析物在電噴霧離子源上存在競爭效應(yīng),通常以基質(zhì)抑制效應(yīng)為主[23,24]。不含目標(biāo)分析物的空白水樣按樣品前處理方法處理,獲得空白基質(zhì)溶液,用該基質(zhì)溶液稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)使用液,用該基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液中各目標(biāo)物的響應(yīng)值與純?nèi)軇┫♂屗玫耐瑵舛葮?biāo)準(zhǔn)液的響應(yīng)值進(jìn)行比較,從而評估目標(biāo)物的基質(zhì)效應(yīng)。當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)大于100%時,表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng),反之,則為基質(zhì)抑制。結(jié)果如圖5所示,除PIR表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)外,其余3種物質(zhì)均表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)。4種物質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)在82.8%～102.2%之間,表明水樣經(jīng)GCHM固相萃取柱凈化后,基質(zhì)去除效果明顯,但由于各目標(biāo)物在過柱時存在絕對損失(見圖3),因此為了使定量結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠,本實驗采用同位素內(nèi)標(biāo)校正法來消除前處理過程中目標(biāo)物的損失以及基質(zhì)效應(yīng)帶來的影響。

圖 5 目標(biāo)分析物的基質(zhì)效應(yīng)(n=6)Fig. 5 Matrix effect of the target analytes (n=6)

2.6 方法學(xué)評價與質(zhì)量控制

將混合標(biāo)準(zhǔn)使用液用20%(v/v)的甲醇-水配制成1～100 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,加入混合內(nèi)標(biāo)使用液,使內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為10 μg/L。內(nèi)標(biāo)法定量時,PIZ與PIR以PIR-D3為內(nèi)標(biāo),MEL與IND以MEL-D3為內(nèi)標(biāo)。以目標(biāo)化合物與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)的峰面積比值對質(zhì)量濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線,4種目標(biāo)物質(zhì)的線性相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.995。在空白基質(zhì)水樣中加入較低水平的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液,使各目標(biāo)物質(zhì)在水樣中的質(zhì)量濃度為10 ng/L,按照優(yōu)化好的方法進(jìn)行富集濃縮,將富集濃縮后的樣品上UPLC-MS/MS分析,獲得各物質(zhì)的信噪比數(shù)據(jù)。以3倍信噪比(S/N=3)計算各物質(zhì)的方法檢出限,以10倍信噪比(S/N=10)計算各物質(zhì)的方法定量限。4種目標(biāo)物的方法定量限均在1～5 ng/L之間。詳細(xì)結(jié)果見表2。

在不含目標(biāo)分析物的水樣中添加5、20和50 ng/L的標(biāo)準(zhǔn)使用液,加入內(nèi)標(biāo)后按照優(yōu)化好的前處理方法進(jìn)行樣品處理,低、中、高3個加標(biāo)水平各平行測定6次,考察其回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。由表2可見,3個加標(biāo)水平的平均回收率分別在85.6%～99.0%、91.2%～101.4%、88.9%～106.4%范圍內(nèi),相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別在2.1%～5.6%、1.4%～5.4%、3.1%～4.5%范圍內(nèi)。

2.7 實際樣品檢測

對上海、江蘇、廣東3省市的15份水源水進(jìn)行了檢測。結(jié)果僅在一份水樣中檢測出IND,質(zhì)量濃度為6.8±0.3 ng/L,表明3省市水源水受4種解熱鎮(zhèn)痛類藥物污染的影響較小。

表 2 4種解熱鎮(zhèn)痛類藥物的方法學(xué)參數(shù)

3 結(jié)論

本研究基于水中有機(jī)污染物富集最常用的固相萃取技術(shù),用自主研發(fā)的固相萃取填料,建立了SPE-UPLC-MS/MS分析水中4種解熱鎮(zhèn)痛類藥物的方法。該方法簡單方便,能滿足水體中痕量解熱鎮(zhèn)痛類藥物檢測的需求。GCHM固相萃取柱的成本較低,效果也優(yōu)于兩款最具代表性的同類型商品化小柱,預(yù)計未來可替代此類價格較高的進(jìn)口產(chǎn)品,亦能滿足水體中其他類似結(jié)構(gòu)或性質(zhì)的化合物的富集凈化,值得推廣應(yīng)用。