王娟娟，賈金萍，張俊杰

山西大學(xué)大型科學(xué)儀器中心（太原 030006）

柚子是蕓香科柑橘屬的一種水果，其果實(shí)鮮食甘酸可口，沁人心脾，令人贊不絕口，具有消炎防菌、化痰止咳、理氣清腸、下氣消食、補(bǔ)血健脾等功效。柚子是佳果，又是良藥。然而，厚厚的柚皮往往被棄之不用，其實(shí)柚皮不僅可作為居室里的空氣清新劑，還有食療功效。柚皮占整個(gè)柚子質(zhì)量的40%～55%[1-2]，不僅含有維生素和礦物質(zhì)這些人體必需的營(yíng)養(yǎng)素，還含有多種對(duì)人體健康有益的非營(yíng)養(yǎng)性生理活性成分，如黃酮類化合物、多糖、果膠、香精油等，這些成分高于柚果實(shí)，具有較高保健和藥用價(jià)值[3-8]。

柚皮苷（naringin）全稱4, 5, 7-三羥基-黃烷酮-7-鼠李糖葡萄糖苷，是一種二氫黃酮類化合物，主要存在于柚、橘、橙等柑橘類水果的外層果皮中。柚皮苷具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化、平喘、鎮(zhèn)咳、祛痰、抗衰老、降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化等廣泛的生物活性，是重要的醫(yī)藥原料。試驗(yàn)研究大都集中于柚皮中柚皮苷的提取純化方面[6,9-13]，很少關(guān)于直接飲用柚皮水的研究報(bào)道。

網(wǎng)上和民間都流傳著許多種簡(jiǎn)單可行的柚子皮治療咳嗽的做法，如開水沖泡、沸水煎煮等服用方法[14-17]。柚皮雖是止咳良藥，但尚缺乏科學(xué)依據(jù)證明其有效性及如何才能使其更有效。

因此，采用高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀分析測(cè)定開水沖泡和沸水煎煮柚皮水提液中止咳化痰成分柚皮苷含量，研究干燥后及-18 ℃冷凍期間柚皮水提液中柚皮苷含量的變化規(guī)律，為合理用藥提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮柚皮取自琯溪蜜柚，產(chǎn)地為福建省。

甲醇、乙腈、乙酸（色譜純，Thermo Fisher Scientific公司）；柚皮苷對(duì)照品（百靈威科技有限公司）；純凈水（娃哈哈）。

1.2 儀器與設(shè)備

Thermo fisher U3000超高效液相色譜儀，配置在線脫氣機(jī)、四元梯度泵、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器（Thermo Fisher Scientific）；Thermo Scientific Q Extractive質(zhì)譜儀（Thermo Scientific，Germany），Syncronis C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；十萬(wàn)分之一天平（奧豪斯儀器有限公司）；美的電磁爐；海爾冰箱。

1.3 方法

1.3.1 檢測(cè)條件

色譜條件：色譜柱Syncronis C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相，乙腈（A），0.1%乙酸水（B）。梯度洗脫：0～0.5 min，5% A；0.5～3 min，5%～95% A；3～5 min，95% A；5～5.2 min，95%～5%A；5.2～7 min，5% A；流速0.25 mL/min；柱溫45 ℃；進(jìn)樣量1 μL。

質(zhì)譜條件：離子源，電噴霧離子源（ESI）；掃描方式，負(fù)離子同時(shí)掃描；噴霧電壓2.7 kV；鞘氣流速35 psi；輔助氣流速10 psi；毛細(xì)管溫度320 ℃；探頭加溫器溫度300 ℃；最大噴霧電流100 A；S-Lens分辨率55；掃描范圍m/z150～1 000；質(zhì)量分辨率70 000。

1.3.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取10.0 mg柚皮苷對(duì)照品置于100 mL量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

1.3.3 供試品溶液的制備

1) 采用開水沖泡、沸水煎煮2種方法。具體過(guò)程：將鮮柚皮切成1 cm×2 cm大小的塊，精密稱取5.0 g柚皮，分別用100 mL開水沖泡3，5，10，15和20 min，適量沸水煎煮3，5，10，15和20 min，將水提液移至100 mL容量瓶中用純凈水定容，搖勻，微孔濾膜（0.22 μm）過(guò)濾后作為供試溶液。

2) 將一部分鮮柚皮塊自然晾干（含水量78.34%），精密稱取1.1 g干柚皮，用適量沸水煎煮15 min，將水提液移至100 mL容量瓶中用純凈水定容，搖勻，微孔濾膜（0.22 μm）過(guò)濾后作為供試溶液。

3) 將剩余鮮柚皮塊置于-18 ℃冰箱中保存，分別在冷凍2，4，6和8個(gè)月時(shí)取樣檢測(cè)，每次精密稱取5.0 g柚皮，用適量沸水煎煮15 min，將水提液移至100 mL容量瓶中用純凈水定容，搖勻，微孔濾膜（0.22 μm）過(guò)濾后作為供試溶液。

按1.3.1的液相色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)行檢測(cè)，柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品和柚皮苷試驗(yàn)樣品的提取離子圖見(jiàn)圖1和圖2。

圖1 柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品的提取離子流圖

圖2 柚皮苷樣品的提取離子流圖

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別精密吸取0.5，1.0，2.0，3.0和4.0 mL對(duì)照品溶液，分別置于10 mL量瓶中，用純凈水定容至刻度，搖勻。以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，柚皮苷對(duì)照品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其回歸方程為Y=4.654 88×107X+1.653 87×107（R2=0.998 7），線性范圍為4.738～39.446 μg。

1.3.5 精密度試驗(yàn)

以開水沖泡10 min柚皮水溶液進(jìn)樣1 μL，連續(xù)重復(fù)6次，測(cè)定峰面積，柚皮苷相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.96%。

1.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取沸水煎煮3 min柚皮水溶液，每隔1 h進(jìn)樣1 μL，觀察6 h內(nèi)穩(wěn)定性，RSD為2.90%。

1.3.7 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取6份同一批柚皮，各5 g，分別用沸水煎煮3 min后進(jìn)樣1 μL，柚皮苷峰面積的RSD為2.46%，表明方法重復(fù)性良好。

1.3.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取9份5 g柚皮，分別加入低、中、高3個(gè)濃度的柚皮苷對(duì)照品（分別相當(dāng)于開水沖泡10 min柚皮水溶液中柚皮苷含量的80%，100%和120%），按1.3.3的方法開水沖泡10 min柚皮制備供試品溶液，取1 μL進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，求得平均回收率為98.11%，RSD為1.53%。

1.3.9 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 16.0 for Windows（SPSS Inc.，USA）軟件進(jìn)行方差分析，用Tukey法進(jìn)行多重比較，p＜0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 柚皮中柚皮苷提取條件

柚皮苷易溶于熱水，通過(guò)加熱處理可使其溶出[11]。根據(jù)柚皮苷特性，分別研究不同開水沖泡時(shí)間、沸水煎煮時(shí)間對(duì)柚皮中柚皮苷溶出量的影響。

2.1.1 開水沖泡時(shí)間的確定

開水沖泡柚皮不同時(shí)間后，柚皮水提液中止咳化痰成分柚皮苷含量的變化如圖3所示。在3～20 min內(nèi)，隨著開水沖泡時(shí)間增加，柚皮水提液中柚皮苷含量基本呈現(xiàn)逐漸增加趨勢(shì)。開水沖泡柚皮5和10 min時(shí)水提液中柚皮苷含量無(wú)顯著差異（p＞0.05），開水沖泡柚皮20 min時(shí)水提液中柚皮苷含量升高到11.61 μg/mL，顯著高于沖泡3，5，10和15 min時(shí)（p＜0.05），開水沖泡柚皮20 min后，水溫較低，不適宜飲用。綜合考慮，開水沖泡柚皮20 min較為適宜。

圖3 開水沖泡時(shí)間對(duì)柚皮水提液中柚皮苷含量的影響

2.1.2 沸水煎煮時(shí)間的確定

沸水煎煮柚皮不同時(shí)間后，柚皮水提液中止咳化痰成分柚皮苷含量的變化如圖4所示。在3～20 min內(nèi)，隨著沸水煎煮時(shí)間增加，柚皮水提液中柚皮苷的含量呈現(xiàn)先增加后下降趨勢(shì)。沸水煎煮柚皮5，10，15和20 min時(shí)水提液中柚皮苷含量均顯著高于3 min時(shí)（p＜0.05），沸水煎煮柚皮15 min時(shí)水提液中柚皮苷含量達(dá)到最大值（24.36 μg/mL），繼續(xù)煎煮，柚皮苷含量下降。沸水煎煮柚皮20 min時(shí)降至19.62 μg·mL-1，與煎煮5和10 min時(shí)相比差異不顯著（p＞0.05）。這一結(jié)果表明，煎煮20 min時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，過(guò)度加熱會(huì)導(dǎo)致柚皮苷的分解，從而導(dǎo)致柚皮苷含量降低，類似的結(jié)果在文獻(xiàn)[18-19]中提及。因此，最佳沸水煎煮柚皮時(shí)間為15 min。

圖4 沸水煎煮時(shí)間對(duì)柚皮水提液中柚皮苷含量的影響

2.1.3 柚皮有效利用方法的確定

在試驗(yàn)分析基礎(chǔ)上，將開水沖泡20 min、沸水煎煮3 min、沸水煎煮15 min時(shí)的柚皮水提液中柚皮苷含量作比較，如圖5所示。開水沖泡柚皮20 min和沸水煎煮柚皮3 min這2種方法的水提液中柚皮苷含量無(wú)顯著差異（p＞0.05），推測(cè)其止咳化痰效果基本相同。與開水沖泡柚皮20 min時(shí)相比，沸水煎煮柚皮15 min時(shí)水提液中柚皮苷含量顯著提高（p＜0.05），由此可見(jiàn)，柚皮苷易溶于熱水，通過(guò)加熱處理可使柚皮苷溶出更多，該結(jié)論與楊秋明等[11]的研究結(jié)果一致。因此，確定沸水煎煮柚皮15 min為柚皮有效利用的最佳方法。

圖5 柚皮不同利用方法的比較

2.2 干燥對(duì)柚皮中柚皮苷含量的影響

柚皮干燥后，沸水煎煮柚皮15 min時(shí)水提液中柚皮苷的含量下降為鮮柚皮的58.58%（p＜0.05），如圖6所示。結(jié)果表明，柚皮苷在干燥過(guò)程中有顯著降解，將柚皮干燥后存放，并不能有效利用柚皮。

2.3 冷凍期間柚皮中柚皮苷含量的變化

為延緩柚皮苷的降解，將鮮柚皮塊置于-18 ℃冰箱中凍藏。冷凍8個(gè)月后進(jìn)行水提，柚皮水提液中柚皮苷含量測(cè)定結(jié)果如圖7所示。冷凍后柚皮苷含量同樣呈明顯下降趨勢(shì)（p＜0.05），但其下降速度較干燥后小得多，柚皮中柚皮苷分別在第2和第4個(gè)月時(shí)有顯著降解，其中第2個(gè)月水提液中柚皮苷含量為未凍藏時(shí)的85.39%，第4個(gè)月為未凍藏時(shí)的70.69%；而第4～6個(gè)月呈緩慢下降趨勢(shì)，差異不顯著（p＞0.05），6個(gè)月以后又快速下降，至第8個(gè)月時(shí)，柚皮水提液中柚皮苷含量已下降為未凍藏時(shí)的45.53%，柚皮化痰止咳效果大大降低。

圖6 干燥后柚皮水提液中柚皮苷含量的變化

圖7 冷凍期間柚皮水提液中柚皮苷含量的變化

3 討論與結(jié)論

柚皮味辛甘苦，性溫，無(wú)毒，具有化痰，消食，下氣，快膈等功效，在《唐本草》《本草求原》《列子》《本草綱目》《四川中藥志》等文獻(xiàn)中均有記載[20]。采用開水沖泡、沸水煎煮方法提取柚皮中的止咳化痰成分柚皮苷，并用GC-MS分析，同時(shí)研究干燥后及-18 ℃冷凍期間柚皮水提液中柚皮苷含量的變化規(guī)律。結(jié)果表明，鮮柚皮沸水煎煮15 min水提液中柚皮苷含量最高，可達(dá)24.36 μg/mL；柚皮干燥后，柚皮水提液中柚皮苷含量下降至14.27 μg/mL，柚皮苷有顯著降解；鮮柚皮冷凍2，4，6和8個(gè)月后，水提液中柚皮苷含量分別為未凍藏時(shí)的85.39%，70.69%，65.60%和45.53%，柚皮苷含量冷凍2個(gè)月和4個(gè)月時(shí)下降極顯著，冷凍4個(gè)月到6個(gè)月之間變化不大，6個(gè)月以后又快速下降。因此，選擇沸水煎煮15 min作為柚皮利用的最佳方法，將鮮柚皮冷凍可有效延緩柚皮苷的降解，冷凍保存不超過(guò)6個(gè)月為宜。在民間，柚皮用于止咳歷時(shí)已久，但缺乏合理應(yīng)用的科學(xué)依據(jù)，試驗(yàn)為有效利用柚皮這一天然資源提供參考依據(jù)。