鄭鵬 王波 王前

摘 要：沙棘（Hippophae rhamnoides）是一種具有藥用價值的植物，沙棘果油具有抗氧化、抗炎癥及抗腫瘤等多種藥理作用。為了探討沙棘果油對H2O2造成氧化性損傷的細胞生長的影響及其抗氧化性，該研究選擇H2O2對RAW264.7細胞氧化損傷模型，通過DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）自由基清除實驗檢測沙棘果油體外抗氧化能力，用[3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽]MTT法和流式細胞儀檢測超氧化物陰離子熒光探針（DHE）信號，分別檢測不同濃度沙棘果油對H2O2損傷細胞的存活率和超氧化物陰離子水平。結(jié)果表明：（1）在DPPH自由基清除實驗中，當沙棘果油濃度小于4.9%時，沙棘果油的抗氧化能力大于維生素C。（2）通過MTT法發(fā)現(xiàn)，濃度為3.125%的沙棘果油對H2O2損傷細胞的存活率顯著升高（P<0.01）。（3）從DHE檢測發(fā)現(xiàn)，在同一檢測時間點，隨著沙棘果油濃度增加，DHE陽性細胞比例顯著下降（P<0.01）;在不同檢測時間點，隨著沙棘果油濃度增加，DHE陽性細胞比例顯著升高（P<0.01）。沙棘果油對過氧化氫誘導的RAW264.7細胞氧化損傷模型有一定修復(fù)作用，可能與細胞內(nèi)超氧化物陰離子水平受到抑制有關(guān)，它具有抗氧化性損傷的潛能。

關(guān)鍵詞：沙棘果油，抗氧化性，MTT法，DHE，過氧化氫損傷模型

中圖分類號：Q943.2

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2020）09-1349-08

Abstract：The sea buckthorn fruit （Hippophae rhamnoides） oil is medically claimed as having phytoantioxidant，antiinflammatory， and anticancerous properties in humans. To explore the hydrogen peroxide of the sea buckthorn fruit oil on mouse monocyte macrophages （RAW264.7 cells） oxidative damage model. By spectrophotometry，scavenging effects of sea buckthorn fruit oil on DPPH free radicals; In vitro antioxidant activity was assessed on RAW264.7 cells against hydrogen peroxide （H2O2） induced cytotoxicity. The antioxidant effect was determined by measuring the cell dye MTT[3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide] reducing assay. Then the survival rate of RAW264.7 cells was determined by MTT assay，and the expression of superoxide anion was determined by flow cytometry labeling with dihydroethidium（DHE）. The results were as follows：（1）Compared with the antioxidant capacity of vitamin C，when the concentration of sea buckthorn fruit oil was less than 4.9%，the antioxidant capacity of sea buckthorn fruit oil was higher than vitamin C. （2） Comparing to the H2O2 group，3.125% sea buckthorn fruit oil group had higher survival rate（P<0.01）. （3） Comparing to the H2O2 group，the proportion of DHE-positive cell was significantly decreased in the same time （P<0.01） and it was negative effect with concentration of sea buckthorn fruit oil，the proportion of DHE-positive cell was significantly increased at the same concentration（P<0.01），and which was related positive effect with concentration of sea buckthorn fruit oil （P<0.01）. These results support the protective effects of sea buckthorn fruit oil against hydrogen peroxide-induced toxicity in vitro with the underlying mechanisms of inhibiting oxidative stress. Taken together，these results clearly indicate that sea buckthorn fruit oil has significant potential as a natural antioxidant agent，which could be a potential source for the discovery of natrual antioxidant health product.

Key words：

sea buckthorn fruit oil，oxidation resistance，MTT，DHE，hydrogen peroxide damage model

人體在代謝過程中會產(chǎn)生活性氧自由基（ROS），包括超氧陰離子（O-2） 、羥自由基（·OH）、過氧化氫

（H2O2） 和脂質(zhì)過氧化物的中間產(chǎn)物（Chauhan et al.，1997）。在正常的生理情況下，線粒體需要消耗約2% 的氧產(chǎn)生的ROS，由呼吸鏈底物端釋放出電子還原氧分子單電子，產(chǎn)生ROS的前體

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O-2和H2O2。在很多疾病以及衰老時，體內(nèi)氧自由基會產(chǎn)生異常積累。過量的ROS會導致細胞損傷或細胞凋亡。ROS的活潑性和氧化反應(yīng)能力都很強，能通過氧化作用攻擊細胞的生物大分子物質(zhì)（ 核酸、蛋白質(zhì)、糖類、脂質(zhì)） 。當人體處于亞健康狀態(tài)時，自由基異常累積會引發(fā)疾病。近年來，天然抗氧化劑因其安全、高效、能滿足亞健康人群日常保健需求的特點而受到廣泛關(guān)注。

沙棘（Hippophae rhamnoides）是一種具有藥用價值的植物，為多年生落葉灌木或小喬木，適應(yīng)性強，能顯著改善生態(tài)環(huán)境（丁健等，2016）。沙棘果油是從沙棘的果肉中提取的油液，是沙棘的精華，食用安全性高（林黎等，2018）。目前，沙棘對調(diào)節(jié)血脂（邊慶榮等，1999）、促進微循環(huán)（吳英等，2000）、抗炎、調(diào)節(jié)免疫（車錫平等，2000）以及抗癌（李忌等，2008）等方面的研究已有報道。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，沙棘果油對酒精引起小鼠骨髓細胞微核率和肝臟損傷有一定改善作用（王波，2019）。劉鳳云（2005）研究發(fā)現(xiàn)，沙棘果油中含有棕櫚油酸、棕櫚酸、油酸、亞油酸和不飽和脂肪酸，這些都是人體不能自身合成的脂肪酸，此外還含有維生素C、維生素E和胡蘿卜素等多種生物活性物質(zhì)。魏安琪（2018）研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物、多酚類化合物、維生素類、多肽類、多糖類物質(zhì)等均可作為天然抗氧化劑使用。趙二勞等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，沙棘果油在體外具有抗氧化性，但此研究僅利用DPPH自由基清除實驗和Fenton實驗在體外檢測了沙棘果油的抗氧化活性，而其在體內(nèi)的抗氧化效果仍不清楚。然而，目前對日常可攝入食品中的天然抗氧化成分含量的研究較少，尤其是在低濃度下的抗氧化能力研究更為缺乏，沙棘果油作為常用的保健品，有必要在細胞水平上對其抗氧化能力進行深入研究。

ROS具有性質(zhì)活潑和反應(yīng)性強的特點，既易還原又易氧化，但其本身并不穩(wěn)定。對其檢測的手段有以下幾種：電子自旋共振法（ESR）、高效液相色譜法、氣相色譜法、化學發(fā)光法、熒光分析法、分光光度法以及電化學方法。但是，這些檢測手段能夠直接測定的方法卻相當有限，因此迫切需要開發(fā)直接測定ROS或其他自由基的檢測方法（呂惠萍等，2015）。

本研究通過H2O2氧化刺激RAW264.7細胞建立氧化損傷的細胞模型，并對沙棘果油進行干預(yù)，先通過細胞存活率等指標的檢測，再通過熒光探針（DHE）檢測細胞內(nèi)超氧化物陰離子水平，檢測DHE陽性細胞比例，間接反映體內(nèi)ROS水平，從多角度探討沙棘果油對氧化損傷的治療，以期為人們正確認識沙棘果油的保健功能特性以及沙棘果油產(chǎn)品的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1樣品和試劑 樣品：RAW264.7細胞（小鼠單核巨噬細胞），由中國科學院上海分院細胞庫提供。試劑：細胞培養(yǎng)試劑和消耗材料購于Gibco公司;胰蛋白酶、過氧化氫、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）購于國藥集團化學試劑有限公司;沙棘果油購于山西五臺山沙棘制品有限公司;培養(yǎng)基購于Hyclone公司;96孔板購于Corning公司;超氧化物陰離子熒光探針（dihydroethidium，DHE）購于碧云天生物技術(shù)研究所;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 設(shè)備 二氧化碳孵育箱（HERE cell150）購于Thermo 公司;酶標儀 （AD340）購于Beckmann公司;流式細胞儀（accurl C6）購于BD公司。

1.2 方法

1.2.1 DPPH自由基清除實驗 以維生素C這個天然的抗氧化劑作為陽性對照，采用DPPH法評估沙棘果油體外的抗氧化活性，為沙棘果油體內(nèi)抗氧化能力的檢測提供濃度依據(jù)。

取6%沙棘果油（無水乙醇溶解）為樣品，設(shè)置維生素C（標準溶液，6%，超純水溶解）為陽性對照。沙棘果油與維生素C各設(shè)置6個濃度梯度，即6%、3%、1.5%、0.75%、0.375%、0.1875%。取96孔板，每個濃度梯度設(shè)置8個復(fù)孔，每個孔先加入100 μL樣品溶液后加入DPPH（0.24%乙醇溶液）。設(shè)置空白對照（100 μL樣品溶液+100 μL無水乙醇）、陰性對照（100 μL無水乙醇+100 μL DPPH工作液）。避光常溫下放置20 min，通過紫外-可見分光光度法測定在517 nm吸光度，取平均值。根據(jù)公式計算每個濃度的DPPH清除率，做折線圖。

計算公式：清除率（%）=[（1-（A樣品-A空白）/A對照）]× 100 %。

1.2.2 RAW264.7細胞培養(yǎng) 將RAW264.7細胞置于含有10%FBS、1%P/S的1640培養(yǎng)基以及在溫度37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進行孵育，取對數(shù)生長期細胞用培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為1×104個待用。

1.2.3 MTT溶液的配制 用生理鹽水溶解1 g的MTT固體，定容，配制成5 mg·mL-1，在無菌環(huán)境下過0.22 μm濾膜除菌分裝，盡量避光，存放于-4 ℃的冰箱下備用。

1.2.4 H2O2氧化損傷模型建立 將培養(yǎng)基重懸細胞接種于96孔板中（每板細胞數(shù)量約1×106個）。每孔加200 μL培養(yǎng)基，搖勻，過夜培養(yǎng)。第二天，吸出每孔廢液，通過1.2的DPPH實驗可以發(fā)現(xiàn)，沙棘果油在濃度5%以下均有較好的抗氧化性。分別加入濃度為5.000%、2.500%、1.250%、0.625%、0.313%、0.156%的H2O2培養(yǎng)基。每組有一個空白對照。24 h后加入每孔200 μL的MTT（5 mg·mL-1）培養(yǎng)基。放置4 h（37 ℃，5% CO2）后每孔加入150 μL DMSO。用搖床搖10 min（37 ℃）后使用酶標儀在490 nm處檢測吸光度，得出適于實驗的H2O2濃度后使用不會明顯影響細胞生長的沙棘果油濃度進行MTT實驗。

3 討論與結(jié)論

本研究首次利用H2O2氧化損傷細胞模型檢測天然低劑量的沙棘果油的抗氧化性。通過體外DPPH法發(fā)現(xiàn)，沙棘果油的濃度在5%以下具有較好的抗氧化性，說明沙棘果油在使用時濃度并非越高越好。通過MTT法我們發(fā)現(xiàn)，沙棘果油在一定濃度范圍內(nèi)提高了受氧化損傷細胞的存活率。在細胞水平上進一步驗證了沙棘果油具有較好的抗氧化性（曹韋等，2016）。即使在日常攝入量較少的情況下也能夠發(fā)揮抗氧化功效，有利于進一步闡明常見天然抗氧化劑在人體內(nèi)的活性機制與藥用價值，對于預(yù)防自由基誘發(fā)的疾病，保護人體健康具有積極意義。

H2O2是一種重要的活性氧，大量存在會造成細胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，導致細胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的增多（范東艷等，2018）。超氧陰離子自由基（O2-·）是細胞內(nèi)氧氣發(fā)生單電子還原反應(yīng)產(chǎn)生的活性氧自由基（ROS）產(chǎn)物（張雯等，2017）。本研究中，沙棘果油提高了H2O2氧化損傷細胞存活率的結(jié)果提示，沙棘果油可能降低了胞內(nèi)過量O2-·的產(chǎn)生。Dickinson et al.（2011）研究發(fā)現(xiàn)，當機體產(chǎn)生過量O2-·后，可以激活細胞的自噬或凋亡信號通路，導致細胞死亡，最終引發(fā)多種疾病。DHE是最常用的檢測細胞內(nèi)超氧化物陰離子水平的熒光探針。通過流式細胞儀靈敏地監(jiān)測O2-·陽性細胞的比例，結(jié)果進一步驗證了沙棘果油減少了O2-·陽性細胞的數(shù)量，這可能是沙棘果油對氧化損傷細胞保護的作用途徑之一。實驗發(fā)現(xiàn)，沙棘果油在使用6 h內(nèi)效果較好，但隨著時間的延長，O2-·陽性細胞的比例有所增加，可見沙棘果油對氧化損傷細胞的保護能力減弱，提示沙棘果油可能需要少量多次使用才能達到較好的效果。這為日常沙棘果油的使用量及使用次數(shù)提供了一定的理論指導（張雯等，2017）。除了O2-·以外，沙棘果油是否還參與其他通路抑制氧化應(yīng)激過程還需要進一步研究。沙棘果油的成分較為復(fù)雜，盡管我們知道沙棘果油中含有維生素類，但沙棘果油降低超氧陰離子自由基的功效具體是哪個成分仍需進一步驗證。本研究結(jié)果為沙棘果油在細胞水平上的抗氧化研究以及進一步開發(fā)沙棘果油提供了理論依據(jù)。

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（責任編輯 蔣巧媛）