朱亞華 姜 濤 陳修報(bào) 劉洪波 楊 健,①

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無(wú)錫漁業(yè)學(xué)院 無(wú)錫 214081；2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江中下游漁業(yè)生態(tài)環(huán)境評(píng)價(jià)與資源養(yǎng)護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心 無(wú)錫 214081)

草魚(Ctenopharyngodon idellus)是“四大家魚”之一，在我國(guó)淡水漁業(yè)經(jīng)濟(jì)中占據(jù)著舉足輕重的地位。近年來(lái)，由于生境破壞、水利設(shè)施的修建、過(guò)捕等因素，其天然資源急劇下降(沈玉幫等, 2011)。為達(dá)到漁民增收、資源恢復(fù)等目標(biāo)，國(guó)家實(shí)施了大規(guī)模增殖放流的政策，草魚屬農(nóng)業(yè)部《關(guān)于“十三五”水生生物增殖放流工作指導(dǎo)意見(jiàn)》中的主要品種。值得注意的是，一些傳統(tǒng)標(biāo)記方法受到很多限制，如切鰭法只適用于短期標(biāo)志；掛牌法主要適用于大型魚類(羅新等,2011)；分子標(biāo)記成本高且檢測(cè)相對(duì)復(fù)雜(李樹華等,2014)等。因此，探索適合草魚(特別是魚苗)增殖放流標(biāo)記和評(píng)價(jià)方法刻不容緩。

耳石存在于大多數(shù)硬骨魚類的內(nèi)耳的膜迷路內(nèi)，有矢耳石、微耳石和星耳石3 種類型，對(duì)魚類的聽覺(jué)和身體的平衡有重要的作用(Campana, 1999)。耳石標(biāo)記常用的熒光物質(zhì)包括鹽酸四環(huán)素(Tetracycline hydrochloride, TCH)、土霉素(Oxytetracycline, OTC)、鈣黃綠素(Celcein, CAL)、茜素紅S(Alizarin red S)和茜素絡(luò)合物(Alizarin complexone, ALC)，其中，ALC使用最廣且效果較好(宋昭彬等, 1999; 付自東等,2005)。此前，草魚耳石的研究多集中在形態(tài)比較及類群判別(宋昭彬等, 2003a、b; 曾祥波等, 2012)、年齡鑒定及與生長(zhǎng)的關(guān)系(宋昭彬等, 2001b; 李建軍等,2010)、孵化期推算(管興華等, 2007; 張國(guó)等, 2013)等方面，尚未見(jiàn)有相關(guān)化學(xué)標(biāo)記研究。本研究利用ALC 對(duì)草魚仔魚的耳石進(jìn)行標(biāo)記，探討此方法對(duì)該魚種的適用性，為今后草魚相關(guān)的大規(guī)模標(biāo)記提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)在中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心南區(qū)實(shí)驗(yàn)基地開展。實(shí)驗(yàn)所用的仔魚苗由基地于2019 年5 月19 日采購(gòu)(3 日齡)。根據(jù)陳真然(1963)的劃分標(biāo)準(zhǔn)，將其歸為仔魚(圖1)。魚苗采購(gòu)后，置于裝有經(jīng)48 h 曝氣自來(lái)水的玻璃缸(長(zhǎng)×寬×高為100 cm ×45 cm×50 cm)中暫養(yǎng)。暫養(yǎng)過(guò)程中投喂蛋黃水，每日投喂2 次，每日清理魚體排泄物及換水1 次，換水量為養(yǎng)殖水體的1/4。隨機(jī)選取規(guī)格基本一致[平均全長(zhǎng)為(8.31±1.21) mm，平均體重為(0.06±0.02) g]的草魚仔魚，放入桶中作為供試魚，于2019 年5 月25 日開始茜素絡(luò)合物(ALC)標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，標(biāo)記期間不喂食，浸泡標(biāo)記24 h 后，移到恢復(fù)養(yǎng)殖缸(長(zhǎng)×寬×高為50 cm×50 cm× 40 cm)中進(jìn)行養(yǎng)殖，在恢復(fù)養(yǎng)殖期間，前期繼續(xù)投喂蛋黃水，待草魚達(dá)到30 日齡后開始投喂粉狀普通配合飼料，每日投喂2 次，每日清理魚體排泄物及換水1 次，換水量占養(yǎng)殖水體的1/4。在暫養(yǎng)及整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間均正常充氣增氧，水溫在23～32℃之間，自然光照，不控光周期。

圖1 本研究所用草魚仔魚及其3 類耳石Fig.1 The larval Ctenopharyngodon idellus and its three types of otoliths

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

本研究的茜素絡(luò)合物購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司，包裝規(guī)格為1 g/瓶。實(shí)驗(yàn)分為2 個(gè)階段，第1 個(gè)階段為浸泡標(biāo)記階段。參考邱晨等(2018)的方法，使用茜素絡(luò)合物對(duì)鯉(Cyprinus carpio)仔魚的浸泡濃度，實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組及標(biāo)記組(100 mg/L)，各組隨機(jī)選擇100 尾魚進(jìn)行24 h 浸泡實(shí)驗(yàn)。浸泡標(biāo)記期間，統(tǒng)計(jì)12、24 h 對(duì)照組及標(biāo)記組的個(gè)體急性死亡情況。第2 個(gè)階段為恢復(fù)養(yǎng)殖階段。浸泡標(biāo)記結(jié)束后，將標(biāo)記組實(shí)驗(yàn)魚移出，放到恢復(fù)養(yǎng)殖缸中繼續(xù)養(yǎng)殖。本研究樣本采集分為2 個(gè)階段，在恢復(fù)養(yǎng)殖的0～40 d中，標(biāo)記組和對(duì)照組每5 d 定期取樣，每次取樣5 尾，以設(shè)置樣本重復(fù)。取至第40 天后，每10 d 取樣1 次，同樣每次取樣5 尾，以確保樣本重復(fù)，直至取樣到第60 天結(jié)束。取樣之后，利用電子天平測(cè)量其體重，電子游標(biāo)卡尺測(cè)量其全長(zhǎng)(數(shù)據(jù)分別精確至0.001 g 和0.01 mm)。0～20 d 的樣品先保存在100%無(wú)水乙醇中，然后置于4℃的冰箱中冷藏，25～60 d 的樣品直接放入自封袋中，于–20℃冰箱中冷凍。在恢復(fù)養(yǎng)殖期間，統(tǒng)計(jì)標(biāo)記組和對(duì)照組死亡數(shù)，并及時(shí)移出死魚。

1.3 耳石樣品的摘取、制備及檢測(cè)方法

將樣本魚置于載玻片上，放于解剖鏡下，用解剖針將耳石從聽囊中快速取出。先用去離子水清洗去除耳石表面的雜質(zhì)及黏液，然后用無(wú)水乙醇脫水、干燥，使用電子探針微區(qū)分析儀(JXA-8100，日本電子株式會(huì)社)對(duì)3 類耳石形態(tài)進(jìn)行掃描拍照(圖1)。參考邱晨等(2018)對(duì)鯉仔魚熒光標(biāo)記的處理措施，使用無(wú)色透明指甲油將耳石包埋固定在載玻片上(無(wú)需打磨)，待指甲油凝固后，避光保存(St?ter et al, 2019)。在OLYMPUS BX51 型顯微鏡(日本)的可見(jiàn)光、藍(lán)色激發(fā)光(WBS)和綠色激發(fā)光(WGS)下對(duì)其進(jìn)行觀察，比較最適光源，并利用顯微鏡自帶的Stream start 軟件進(jìn)行圖譜拍照和圖像處理。在進(jìn)行耳石浸泡標(biāo)記的時(shí)滯觀察時(shí)，先將耳石打磨至露出核心，再在其表面用無(wú)色透明指甲油二次固定。使用OLYMPUS BX51 型顯微鏡對(duì)耳石日輪數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)。耳石標(biāo)記效果參照歐陽(yáng)斌等(1999)的方法按無(wú)(–)、微弱(+)、較明顯(++)、明顯(+++)和非常明顯(++++) 5 個(gè)等級(jí)進(jìn)行記錄。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2010 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和制圖。同時(shí)，利用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，對(duì)實(shí)驗(yàn)魚生長(zhǎng)差異進(jìn)行顯著性分析，設(shè)定差異顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 ALC 標(biāo)記對(duì)草魚仔魚生存及生長(zhǎng)的影響

在24 h 的ALC 浸泡過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均未出現(xiàn)死亡，存活率為100%。在浸泡過(guò)程中，標(biāo)記組仔魚的游泳能力正常，沒(méi)有表現(xiàn)出任何異常行為，說(shuō)明100 mg/L 的ALC 標(biāo)記對(duì)草仔魚產(chǎn)生的影響較小或者未產(chǎn)生影響。浸泡標(biāo)記24 h 后，移到恢復(fù)養(yǎng)殖缸中繼續(xù)養(yǎng)殖。在恢復(fù)養(yǎng)殖的0～60 d 內(nèi)，統(tǒng)計(jì)標(biāo)記組和對(duì)照組的死亡數(shù)，截止第60 天取樣，標(biāo)記組死亡2 尾，對(duì)照組死亡9 尾，樣本數(shù)統(tǒng)計(jì)不包括死亡數(shù)。

隨著恢復(fù)養(yǎng)殖天數(shù)的增加，魚體發(fā)生明顯變化，各個(gè)器官逐漸發(fā)育完全，接近成魚。觀察發(fā)現(xiàn)，標(biāo)記組和對(duì)照組在魚體發(fā)育的成熟度上沒(méi)有明顯差異，其攝食和游泳能力均正常。對(duì)樣本的平均體重及平均全長(zhǎng)計(jì)算可以看出(圖2)，草魚仔魚的體重及全長(zhǎng)隨恢復(fù)養(yǎng)殖天數(shù)增加而逐漸增加。同時(shí)，0～10、20～40 d標(biāo)記組與對(duì)照組的平均體重存在顯著差異(P<0.05)，15、50、60 d 標(biāo)記組樣本魚的平均體重與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。5～10、20～35 d 標(biāo)記組與對(duì)照組的平均全長(zhǎng)差異顯著(P<0.05)，0、15、40～60 d 標(biāo)記組樣本魚的平均全長(zhǎng)與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。綜合來(lái)看，標(biāo)記組和對(duì)照組的平均體重及平均全長(zhǎng)的差異性呈無(wú)規(guī)律性。

圖2 不同取樣天數(shù)標(biāo)記組和對(duì)照組草魚仔魚的平均體重和平均全長(zhǎng)變化(n=5)Fig.2 Changes of average body weight and average total length of larval Ctenopharyngodon idellus of the marking group and control group at different sampling day (n=5)

2.2 茜素絡(luò)合物浸泡標(biāo)記草魚仔魚耳石效果檢測(cè)

2.2.1 草魚仔魚3 類耳石的ALC 浸泡標(biāo)記效果 在熒光顯微鏡的可見(jiàn)光及2 種激發(fā)光源下觀察草魚仔魚矢耳石、微耳石和星耳石的標(biāo)記效果，發(fā)現(xiàn)草魚仔魚微耳石的標(biāo)記效果最好，矢耳石次之(圖3)。微耳石的形狀為橢圓形，經(jīng)過(guò)ALC 浸泡標(biāo)記過(guò)的耳石在其上面形成了一個(gè)明顯的橘紅色標(biāo)記環(huán)，且微耳石的日輪輪紋清晰，在顯微鏡的可見(jiàn)光下，能清楚地計(jì)數(shù)日輪數(shù)目。同樣，矢耳石的標(biāo)記環(huán)也清晰可見(jiàn)，形狀為箭矢形，具有中間厚兩端薄的特點(diǎn)，隨著生長(zhǎng)天數(shù)的增加，觀察到的標(biāo)記環(huán)逐漸模糊。在本實(shí)驗(yàn)中，星耳石的熒光標(biāo)記結(jié)果有2 種，一種是耳石的標(biāo)記部分表現(xiàn)為一個(gè)小點(diǎn)或一個(gè)小環(huán)，另一種是觀察不到任何標(biāo)記現(xiàn)象。因此，草仔魚微耳石的熒光標(biāo)記效果最佳，是觀察草魚仔魚標(biāo)記效果的理想選擇。以下內(nèi)容以微耳石為依據(jù)進(jìn)行比較。

圖3 恢復(fù)養(yǎng)殖第20 天時(shí)草魚仔魚矢耳石、微耳石和星耳石分別在可見(jiàn)光、藍(lán)色激發(fā)光和綠色激發(fā)光下的標(biāo)記效果Fig.3 The marking effect of sagitta, lapillus and asteriscus of larval Ctenopharyngodon idellus under visible, blue excitation and green excitation lights at the 20th day of recovery culture after ALC immersion

2.2.2 微耳石經(jīng)ALC 浸泡標(biāo)記后在3 種光源下的信號(hào)檢測(cè)效果 在可見(jiàn)光、藍(lán)色激發(fā)光和綠色激發(fā)光下，對(duì)微耳石進(jìn)行拍照觀察，發(fā)現(xiàn)標(biāo)記強(qiáng)度明顯不同(表1)。所有微耳石在可見(jiàn)光、藍(lán)色激發(fā)光和綠色激發(fā)光下，均能看到1 個(gè)明顯的標(biāo)記環(huán)，但三者對(duì)標(biāo)記產(chǎn)生的顏色反應(yīng)不同(圖3)。在可見(jiàn)光下，ALC 浸泡過(guò)后在耳石上看到一個(gè)深紅色的標(biāo)記環(huán)，但隨著恢復(fù)養(yǎng)殖天數(shù)的增加，深紅色標(biāo)記環(huán)的顏色逐漸變淡，甚至完全觀察不到。在藍(lán)色激發(fā)光下，微耳石上形成一個(gè)橘紅色的標(biāo)記環(huán)，與沒(méi)有標(biāo)記的綠色部分形成強(qiáng)烈反差，顏色鮮艷，容易觀察。在綠色激發(fā)光下，ALC浸泡過(guò)后，耳石上形成一個(gè)深紅色的標(biāo)記環(huán)，沒(méi)有被標(biāo)記部分呈淡橘紅色，二者顏色相近，容易造成混淆，且標(biāo)記環(huán)與未標(biāo)記部分界線不容易區(qū)分，對(duì)于識(shí)別準(zhǔn)確的標(biāo)記日輪產(chǎn)生一定的干擾。因此，對(duì)于草魚仔魚熒光標(biāo)記來(lái)說(shuō)，藍(lán)色激發(fā)光為較理想的觀察光源。

2.2.3 不同恢復(fù)養(yǎng)殖天數(shù)草魚仔魚微耳石在藍(lán)色激發(fā)光下的ALC 標(biāo)記檢測(cè)效果 觀察不同恢復(fù)養(yǎng)殖天數(shù)下的微耳石(圖4)可以看到，熒光標(biāo)記信號(hào)強(qiáng)度呈先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)。在第0 天取樣時(shí)，即浸泡完成當(dāng)天取樣，就能在耳石上觀察到一個(gè)明顯的標(biāo)記環(huán)，且標(biāo)記環(huán)清晰，說(shuō)明ALC 在浸泡當(dāng)日就在耳石上積累形成了標(biāo)記。第5 天時(shí)，已能看到耳石標(biāo)記環(huán)外面的新區(qū)域，與標(biāo)記環(huán)里的區(qū)域形成強(qiáng)烈反差，標(biāo)記環(huán)觀察更為清晰。第10～40 天的耳石標(biāo)記環(huán)強(qiáng)度基本沒(méi)有發(fā)生變化，熒光信號(hào)強(qiáng)度穩(wěn)定，為最佳觀察時(shí)間段。但從第50 天和第60 天的耳石標(biāo)記強(qiáng)度來(lái)看，熒光信號(hào)強(qiáng)度有下降趨勢(shì)，標(biāo)記環(huán)略模糊，但仍然具有很強(qiáng)的可見(jiàn)性。

表1 草魚仔魚微耳石在3 種不同光源下的檢測(cè)效果Tab.1 Detection effect of lapillus of larval Ctenopharyngodon idellus under three different light sources

圖4 不同恢復(fù)養(yǎng)殖天數(shù)下草魚仔魚微耳石在藍(lán)色激發(fā)光下ALC 標(biāo)記效果比較Fig.4 Comparison of ALC marking effect on lapillus of larval Ctenopharyngodon idellus at different day of recovery culture

2.3 草魚仔魚經(jīng)ALC 浸泡后耳石標(biāo)記出現(xiàn)和消失的時(shí)滯

以浸泡標(biāo)記第5 天的微耳石為例(圖5)，在顯微鏡下，3 種可見(jiàn)光下的耳石相同位置上能觀察到顏色不同的標(biāo)記環(huán)。在可見(jiàn)光下對(duì)耳石的部分進(jìn)行放大，觀察日輪并計(jì)算耳石熒光信號(hào)標(biāo)記出現(xiàn)和消失的時(shí)滯。由于草魚仔魚的日齡為生長(zhǎng)輪數(shù)目加1(宋昭彬等,2001)，因此，具有第一日輪的草魚為2 日齡，完整的日輪由明帶和暗帶共同組成。草魚仔魚浸泡當(dāng)日為9 日齡，開始浸泡標(biāo)記時(shí)間為17:00，此時(shí)，第8 日輪的明帶已經(jīng)形成，暗帶開始形成；而浸泡結(jié)束時(shí)草魚仔魚為10 日齡，此時(shí)，第9 日輪的明帶已經(jīng)形成，暗帶尚未形成。從耳石的熒光標(biāo)記環(huán)來(lái)看，耳石的熒光標(biāo)記信號(hào)在第9 日輪的明帶和暗帶上，在第9 日輪前后都無(wú)熒光信號(hào)出現(xiàn)。即在浸泡當(dāng)晚，耳石第8 日輪暗帶形成的過(guò)程中，熒光物質(zhì)并沒(méi)有隨著碳酸鈣進(jìn)入耳石，即為浸泡開始與標(biāo)記出現(xiàn)的時(shí)滯，約12 h。當(dāng)浸泡完成后，第9 日輪的暗帶開始形成，此時(shí)，仔魚已經(jīng)不處于熒光物質(zhì)溶液中，其上面存在的熒光標(biāo)記信號(hào)即為浸泡結(jié)束與標(biāo)記消失的時(shí)滯，約12 h。因此，熒光標(biāo)記環(huán)的產(chǎn)生和消失與浸泡的開始和結(jié)束均存在約12 h 的時(shí)滯。

圖5 恢復(fù)養(yǎng)殖第5 天時(shí)草魚仔魚微耳石標(biāo)記環(huán)出現(xiàn)和消失時(shí)滯推算Fig.5 The time lag for the appearance and disappearance of ALC marker ring in the lapillus of larval Ctenopharyngodon idellus at the 5 d recovery culture

3 討論

3.1 草魚仔魚3 對(duì)耳石標(biāo)記差異性特征

曾祥波等(2012)研究發(fā)現(xiàn)，草魚的矢耳石和微耳石在魚體孵化時(shí)便已存在，而魚體的星耳石則在第12 天出現(xiàn)，相對(duì)較晚，此現(xiàn)象在各種不同種類的魚體存在(付自東等, 2005; 趙亞鵬等, 2013)。由于3 對(duì)耳石在生長(zhǎng)階段變化的差異性，先前的研究對(duì)象主要集中在微耳石和矢耳石上(宋昭彬等, 2003a、b; 徐永江等, 2016; 付自東等, 2005)，星耳石的研究較少。草魚仔魚的矢耳石在剛孵化的時(shí)候?yàn)閳A形，隨著日齡的增加，逐漸向兩端生長(zhǎng)，變成兩端薄中間厚的箭矢形；微耳石最初的形狀為圓形，此外，還觀察到部分微耳石的2 個(gè)核心緊緊相鄰，其日輪清晰，便于觀察，隨著日齡的增加，耳石逐漸生長(zhǎng)為橢圓形。在本研究中，浸泡當(dāng)日仔魚為9 日齡，浸泡24 h 之后為10 日齡，故仔魚的星耳石尚未發(fā)育出來(lái)，在觀察中看不到熒光物質(zhì)留下的標(biāo)記環(huán)，但部分個(gè)體的星耳石上又能觀察到一個(gè)微弱的橘紅色標(biāo)記環(huán)，說(shuō)明在浸泡當(dāng)日有部分個(gè)體已經(jīng)發(fā)育出了星耳石，發(fā)育之后星耳石為一豆形，其核心十分模糊，不具有一個(gè)明顯的原基，但隨著日齡的增加，星耳石逐漸發(fā)育完全，形狀逐漸規(guī)則，向圓形過(guò)渡，輪紋清晰。本研究中所有樣本魚理論上處于同一發(fā)育日齡，由于魚體新陳代謝的差異，不能完全保證所有魚體具有完全一致的胚胎孵化周期(St?ter et al, 2019)，因此，不同的魚苗日齡之間存在偏差，故能在極個(gè)別的樣本魚的星耳石上看到微弱的標(biāo)記環(huán)。還有一種可能是星耳石的發(fā)育存在個(gè)體差異，受外界環(huán)境的影響，比如水溫、營(yíng)養(yǎng)、壓力等，部分個(gè)體加快了其形成時(shí)間。

ALC 標(biāo)記環(huán)能夠長(zhǎng)期存在于耳石上，但隨著時(shí)間的增加，標(biāo)記環(huán)會(huì)逐漸模糊(王正鯤等, 2015)，特別是在可見(jiàn)光下看到的深紅色標(biāo)記環(huán)(邱晨等, 2019)。何春林等(2008)在對(duì)重口裂腹魚(Schizothorax davidi)進(jìn)行ALC 標(biāo)記時(shí)，在可見(jiàn)光下觀察到的標(biāo)記環(huán)也較微弱。在本研究50 d 和60 d 的樣本中，在可見(jiàn)光下幾乎看不到此標(biāo)記環(huán)，而在藍(lán)色激發(fā)光和綠色激發(fā)光下依然能夠清晰地看到，但沒(méi)有前期的標(biāo)記環(huán)清晰。這可能是由于恢復(fù)養(yǎng)殖時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，新的日輪在不斷形成，耳石在不斷變大，厚度增加而減弱了熒光的穿透性(Iglesias et al, 1997; Noda et al, 2013)。另外，進(jìn)行浸泡標(biāo)記時(shí)，魚體年齡很小，標(biāo)記日輪靠近中心，之前經(jīng)過(guò)標(biāo)記的日輪與后面長(zhǎng)出來(lái)的新的日輪形成對(duì)比，長(zhǎng)出的區(qū)域越多，顯得標(biāo)記環(huán)越小，也增加了標(biāo)記檢測(cè)的難度。司飛等(2019)對(duì)牙鲆(Paralichthys olivaceus)進(jìn)行鍶標(biāo)記時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著標(biāo)記部分所占比重的減少，某種程度可能會(huì)影響耳石上鍶標(biāo)記的檢出效果。

3.2 草魚仔魚耳石ALC 標(biāo)記環(huán)出現(xiàn)和消失的時(shí)滯特征

ALC 對(duì)多種魚類均有較好的標(biāo)記效果(Vigliola,1997; Skov et al, 2001; Liu et al, 2009; 趙亞鵬等,2013; Lü et al, 2014)。但關(guān)于浸泡開始和結(jié)束與熒光標(biāo)記信號(hào)的產(chǎn)生和消失是否存在時(shí)間差的研究卻很缺乏。邱晨等(2018)通過(guò)對(duì)鯉仔魚的觀察發(fā)現(xiàn)，其熒光標(biāo)記信號(hào)的產(chǎn)生和消失與浸泡開始和結(jié)束的時(shí)間均有1 d 的時(shí)滯。在本研究中，熒光標(biāo)記環(huán)的產(chǎn)生和消失與浸泡的開始和結(jié)束均存在約12 h 的時(shí)滯。這可能與不同種類的魚具有不同的代謝速率有關(guān)。熒光標(biāo)記在魚類耳石中沉積的原理是魚的新陳代謝促使熒光物質(zhì)隨著碳酸鈣進(jìn)入耳石，參加下一輪的碳酸鈣沉積，隨著時(shí)間的增加，帶有熒光物質(zhì)的碳酸鈣積累越來(lái)越多，逐漸形成一個(gè)熒光標(biāo)記環(huán)(徐永江等,2016)。魚苗的日齡越低，其新陳代謝速率越快，仔魚的代謝速率要高于稚魚和成魚。本研究浸泡當(dāng)日的魚苗為9 日齡，正處于代謝旺盛的時(shí)期，對(duì)熒光物質(zhì)具有較好的吸收，熒光物質(zhì)隨著碳酸鈣一起沉積在耳石上，形成了肉眼可見(jiàn)的標(biāo)記環(huán)。在進(jìn)行時(shí)滯觀察時(shí)，由于日輪中還存在部分亞日輪，會(huì)影響日輪的正確計(jì)數(shù)，在進(jìn)行時(shí)滯觀察前，需要先將耳石進(jìn)行打磨，直至暴露出核心為止。姜濤等(2016)在對(duì)刀鱭(Coilia nasus)耳石幾種前處理方法所得年輪的觀察中發(fā)現(xiàn)，橫截面法比矢狀面法更有優(yōu)勢(shì)。在本研究中，打磨后的耳石矢狀面已經(jīng)能直接清晰地看到日輪，并且無(wú)需酸蝕。打磨之后進(jìn)行拋光，再用無(wú)色透明指甲油進(jìn)行二次包埋，增加耳石的透光性，即可得到較為準(zhǔn)確的日輪數(shù)目。

3.3 草魚仔魚耳石ALC 標(biāo)記實(shí)驗(yàn)條件的特征

對(duì)于本研究中的草魚仔魚來(lái)說(shuō)，在100 mg/L 的ALC 溶液中浸泡標(biāo)記24 h，經(jīng)無(wú)色透明指甲油包埋的耳石(無(wú)需打磨)可以明顯觀察到熒光標(biāo)記，能取得理想的效果。對(duì)比可見(jiàn)光和不同熒光下不同耳石的標(biāo)記效果，發(fā)現(xiàn)微耳石是檢測(cè)熒光標(biāo)記最適宜的耳石類型，且在藍(lán)色熒光下觀察效果最佳。邱晨等(2018)對(duì)鯉仔魚的浸泡時(shí)間選為48 h，在本研究中對(duì)浸泡時(shí)長(zhǎng)進(jìn)行了優(yōu)化，選擇24 h 作為草魚仔魚的浸泡時(shí)長(zhǎng)，以期能在較短時(shí)間下獲得理想的熒光標(biāo)記效果，減少熒光物質(zhì)浸泡對(duì)魚苗的傷害，節(jié)約成本。同時(shí)，在經(jīng)過(guò)長(zhǎng)達(dá)60 d 的恢復(fù)養(yǎng)殖后，仍能取得不錯(cuò)的熒光標(biāo)記效果。熒光標(biāo)記一般用來(lái)標(biāo)記仔魚(Yang et al, 2016)，考慮到魚體生理脅迫的耐受力及魚體發(fā)育的差異性，不同種類、不同規(guī)格魚體的最佳浸泡濃度和浸泡時(shí)間也不一樣，而浸泡濃度的多少和浸泡時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)標(biāo)記效果有著決定性的作用(王正鯤等, 2015; 何春林等,2008; 趙亞鵬等, 2013)。本研究中，由于草魚仔魚剛孵化時(shí)，星耳石尚未發(fā)育(曾祥波等, 2012)，即使發(fā)育之后星耳石的核心也十分模糊。標(biāo)記初期如果正好在星耳石產(chǎn)生之時(shí)，則標(biāo)記環(huán)相對(duì)模糊，但邱晨等(2018)研究表明，星耳石是鯉仔魚熒光標(biāo)記的最佳選擇，從極個(gè)別草魚仔魚已經(jīng)發(fā)育出來(lái)的星耳石上的標(biāo)記環(huán)也可以看出，一旦星耳石發(fā)育形成，ALC 標(biāo)記同樣對(duì)星耳石具有很好的適用性，能夠在其上形成標(biāo)記環(huán)。如果使用星耳石來(lái)觀察熒光標(biāo)記，研究星耳石從何時(shí)開始生長(zhǎng)且到何時(shí)開始長(zhǎng)出清晰且有規(guī)律的生長(zhǎng)是重要環(huán)節(jié)。在進(jìn)行熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中，不僅僅是區(qū)分到仔稚魚，根據(jù)耳石形成的特點(diǎn)具體到某日齡的魚進(jìn)行標(biāo)記能夠得到更好的效果。因此，在下一步工作中，作者將進(jìn)行不同日齡的草魚在不同濃度茜素絡(luò)合物和不同浸泡時(shí)間下的比較研究，以便確定最適的浸泡規(guī)格、浸泡時(shí)間及浸泡濃度，同時(shí)，標(biāo)記之后將進(jìn)行更長(zhǎng)期的養(yǎng)殖觀察以確定其持久性。

4 結(jié)論

本研究首次通過(guò)100 mg/L 的茜素絡(luò)合物對(duì)草魚仔魚進(jìn)行1 d 浸泡實(shí)驗(yàn)，獲得了理想的標(biāo)記結(jié)果。在可見(jiàn)光、藍(lán)色激發(fā)光和綠色激發(fā)光下，在3 種耳石上均能觀察到明顯的標(biāo)記環(huán)，其中，微耳石的標(biāo)記效果最好，矢耳石次之；藍(lán)色激發(fā)光的檢測(cè)效果最佳，綠色激發(fā)光次之；在可見(jiàn)光下，耳石日輪數(shù)目的觀察清晰度最高。魚體浸泡開始和結(jié)束的時(shí)間與熒光標(biāo)記環(huán)出現(xiàn)和消失的時(shí)間均存在約12 h 的時(shí)間差，同時(shí)，在長(zhǎng)達(dá)60 d 恢復(fù)養(yǎng)殖的情況下，仍然能在耳石上檢測(cè)到明顯的標(biāo)記環(huán)。相關(guān)結(jié)果能夠?qū)窈蟛蒴~仔魚的增殖放流工作效果的有效評(píng)估提供理論參考、技術(shù)支撐以及條件優(yōu)化的思路。