鄒 瑩 郭曉萌 萬(wàn)曉媛 邱 亮 張慶利①

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海水養(yǎng)殖病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室青島市海水養(yǎng)殖流行病學(xué)與生物安保重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島 266071；2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306)

蝦血細(xì)胞虹彩病毒(Shrimp hemocyte iridescent virus, SHIV)和紅螯螯蝦虹彩病毒(Cherax quadricarinatus iridovirus, CQIV)是近年報(bào)道的、虹彩病毒科中可感染甲殼類(lèi)的2種新發(fā)病毒(Xu et al, 2016; Qiu et al,2017)，對(duì)對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)構(gòu)成了威脅。2014年，SHIV首次在浙江一養(yǎng)殖場(chǎng)的凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)中被發(fā)現(xiàn)。隨后幾年的流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國(guó)沿海包括河北、山東、江蘇、浙江和福建等省部分區(qū)域養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦中均有SHIV檢出(Qiu et al,2017、2018)。Xu等(2016)研究顯示，紅螯螯蝦(Cherax quadricarinatus)中分離到的一種虹彩病毒(CQIV)對(duì)凡納濱對(duì)蝦也具有較強(qiáng)致病性。

SHIV基因組為雙鏈DNA，長(zhǎng)度約為166 kb，與CQIV的基因組同源性為99.97%。2019年，國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)將二者作為2個(gè)病毒株，統(tǒng)一命名為十足目虹彩病毒1(Decapod iridescent virus, DIV1)，并將其歸入虹彩病毒科的一個(gè)新屬——十足目虹彩病毒屬(Decapodiridovirus)(Xu et al, 2016; Qiu et al, 2017、2019; 陳形, 2019)。目前，虹彩病毒科共有6個(gè)屬，其中， 蛙 病 毒 屬(Ranavirus) 、 腫 大 細(xì) 胞 病 毒 屬(Megalocytivirus)和淋巴囊腫病毒屬(Lymphocystivirus)均可感染魚(yú)類(lèi)等脊椎動(dòng)物(Chinchar et al, 2011; Kurita et al, 2012)。例如，大鯢虹彩病毒(Giant seaperch iridovirus, GSIV)感染會(huì)導(dǎo)致大鯢(Andrias davidanus)全身水腫、多臟器受損，該病毒的流行使大鯢養(yǎng)殖業(yè)遭受了重大打擊(孟彥, 2013)；而新加坡石斑魚(yú)虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus, SGIV)則會(huì)引起石斑魚(yú)全身性疾病，威脅石斑魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展(Teng et al, 2008; Li et al, 2014)。研究發(fā)現(xiàn)，DIV1可感染凡納濱對(duì)蝦、紅螯螯蝦、羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)、克氏原螯蝦(Procambarus clarki)和脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda)的造血組織和血細(xì)胞，被感染細(xì)胞出現(xiàn)核固縮，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)嗜堿性包涵體(Qiu et al, 2017、2019)。感染DIV1后的對(duì)蝦出現(xiàn)肝胰腺顏色變淺、空腸空胃、停止攝食、活力下降等癥狀(Qiu et al, 2017、2019)。

目前，DIV1的檢測(cè)主要依賴Qiu等(2018)基于ATPase 基 因(GenBank 登 錄 號(hào)：KY681040)建 立 的TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR和套式PCR檢測(cè)方法(陳蒙蒙, 2017; 邱亮, 2018)。由于DIV1實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)檢測(cè)儀器設(shè)備要求較高，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，無(wú)法實(shí)現(xiàn)在取樣現(xiàn)場(chǎng)對(duì)患病對(duì)蝦進(jìn)行快速檢測(cè)。而環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)具有擴(kuò)增效率高、擴(kuò)增速度快、恒溫?cái)U(kuò)增無(wú)需復(fù)雜儀器設(shè)備等特點(diǎn)，非常適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)(Priyanka et al, 2019; Jiang et al, 2012; Shirato, 2019)，目前已被廣泛應(yīng)用于人類(lèi)、動(dòng)物衛(wèi)生和食品相關(guān)病原微生物的檢測(cè)(Notomi et al, 2015; Wong et al, 2018; Silva et al,2020)。因此，本研究基于DIV1的主要衣殼蛋白基因建立了其LAMP檢測(cè)技術(shù)，以期為DIV1病原的實(shí)驗(yàn)室和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)及防控提供新的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

參考Qiu 等(2017)的方法，對(duì)購(gòu)自山東日照的健康凡納濱對(duì)蝦進(jìn)行DIV1 人工感染實(shí)驗(yàn)，并使用基因組DNA 提取試劑盒(天根, 北京, 中國(guó))提取健康個(gè)體和患病個(gè)體的基因組DNA。利用NanoDrop 2000c 測(cè)定所提取 DNA 的質(zhì)量和濃度(Thermo Scientific,Waltham, 美國(guó))，然后，將DNA 保存于–80℃冰箱備用。研究中用到的蝦肝腸胞蟲(chóng)(EHP)、致急性肝胰腺壞死病副溶血弧菌(VpAHPND)、對(duì)蝦偷死野田村病毒(CMNV)、傳染性皮下及造血組織壞死病病毒(IHHNV)、白斑綜合征病毒(WSSV)、桃拉綜合征病毒(TSV)和黃頭病毒(YHV)等病原陽(yáng)性核酸均來(lái)源于作者實(shí)驗(yàn)室。

1.2 DIV1-LAMP 引物設(shè)計(jì)

本研究利用Primer Explorer V5.0 軟件，根據(jù)DIV1 的衣殼蛋白基因序列(GenBank 登錄號(hào)為ATE87157.1)，設(shè)計(jì)了3 對(duì)LAMP 擴(kuò)增引物(表1)，包括2 條內(nèi)引物、2 條外引物以及2 條環(huán)引物。由上海生工生物技術(shù)有限公司合成該引物。

表1 DIV1-LAMP 反應(yīng)引物序列Tab.1 Primer sequences for DIV1-LAMP assay

1.3 DIV1-LAMP 反應(yīng)條件優(yōu)化

以DIV1 陽(yáng)性核酸為模板，25 μl LAMP 初始反應(yīng)體系中包含2.5 μl 10×Isothermal amplification buffer、4 mmol/L MgSO4、1.2 mol/L Betaine、1.2 mmol/L dNTPs、1.6 μmol/L DIV1-FIP/BIP、0.2 μmol/L DIV1-F3/B3、0.8 μmol/L LF/LB、6.4 U Bst 2.0 WarmStart?DNA 聚合酶、0.8 μmol/L EvaGreen?及適量的水，于實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀(Bio-Rad, California, 美國(guó))中設(shè)置8 個(gè)溫度梯度(58.0℃～68.0℃)，反應(yīng)50 min (50 個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)1 min)；MgSO4終濃度按照3.2、4.0、4.8、5.6 mmol/L，dNTPs 終濃度按照0.8、1.0、1.2、1.4 mmol/L 進(jìn)行反應(yīng)體系正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化；Bst 2.0 WarmStart?DNA 聚合酶用量按照3.2、4.8、6.4、8.0、9.6 U 進(jìn)行添加；核酸染料EvaGreen?終濃度分別按照0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 μmol/L 的添加量進(jìn)行優(yōu)化。每個(gè)待優(yōu)化指標(biāo)的單個(gè)變量設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，依據(jù)擴(kuò)增Ct值和SD 值選出最佳反應(yīng)條件。

1.4 DIV1 的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備

以DIV1陽(yáng)性核酸為模板，通過(guò)DIV1-F3/B3引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲取DIV1靶基因核酸目的片段。將純化的目的片段接入pMD18-T載體(TaKaRa, 大連, 中國(guó))進(jìn)行克隆和測(cè)序驗(yàn)證，對(duì)測(cè)序驗(yàn)證正確的克隆擴(kuò)大培養(yǎng)。隨后，用質(zhì)粒提取試劑盒(Omega Inc.,Norcross,美國(guó))提取pMD18-DIV1質(zhì)粒，利用NanoDrop 2000c測(cè)定質(zhì)粒濃度。用TE緩沖液將pMD18-DIV1質(zhì)粒10倍梯度稀釋成質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，置于–80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 DIV1-LAMP分析靈敏度檢驗(yàn)和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

使用梯度稀釋的pMD18T-DIV1 質(zhì)粒(3.54×109～100拷貝/反應(yīng))和無(wú)RNA 酶H2O 作為模板，獲得DIV1的LAMP 擴(kuò)增曲線以確定該方法的檢測(cè)靈敏度，使用BioRad CFX96 軟件(版本6.0.14)，以擴(kuò)增的Ct值(y)相對(duì)于pMD18-DIV1 質(zhì)粒濃度的對(duì)數(shù)值(x)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。每個(gè)濃度設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。

1.6 DIV1-LAMP 分析特異性檢驗(yàn)

分別以EHP、VpAHPND、CMNV、IHHNV、WSSV、TSV 和YHV 等病原的陽(yáng)性DNA 或cDNA 為模板，檢驗(yàn)本研究所建立的LAMP 方法的特異性。反應(yīng)以3.54×105拷貝/反應(yīng)pMD18-DIV1 質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，以未感染DIV1 的對(duì)蝦組織DNA 為陰性對(duì)照，以無(wú)RNA 酶的水為空白對(duì)照。

1.7 DIV1-LAMP 方法可重復(fù)性和可重現(xiàn)性檢驗(yàn)

按照世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)《水生動(dòng)物疫病診斷手冊(cè)》中檢測(cè)方法確認(rèn)章節(jié)的要求，對(duì)新建立的DIV1-LAMP 檢測(cè)方法進(jìn)行可重復(fù)性和可重現(xiàn)性分析。LAMP 檢測(cè)方法組內(nèi)可重復(fù)性測(cè)試，采用10 倍濃度梯度稀釋的質(zhì)粒為模板，對(duì)每個(gè)濃度的模板設(shè)置3 次平行測(cè)試，利用平行測(cè)試產(chǎn)生的Ct平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)來(lái)計(jì)算組內(nèi)變異系數(shù)CV?？芍噩F(xiàn)性則以不同實(shí)驗(yàn)室環(huán)境條件下LAMP 檢測(cè)方法對(duì)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線的穩(wěn)定性來(lái)評(píng)定，并利用SPSS 軟件單因素方差分析(One-way ANOVA)對(duì)擴(kuò)增Ct值進(jìn)行差異顯著性分析。

1.8 DIV1-LAMP 方法對(duì)實(shí)際樣品的檢驗(yàn)

利用本研究建立的LAMP 方法對(duì)人工感染DIV1的凡納濱對(duì)蝦樣品進(jìn)行定性分析，同時(shí)，利用TaqMan熒光定量PCR 對(duì)上述樣品進(jìn)行定性和定量分析，并對(duì)比DIV1-LAMP 檢測(cè)方法和TaqMan 熒光定量PCR的分析結(jié)果。

1.9 基于FTA 卡和LAMP 的DIV1 現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)方法

利用1.2 μl GeneFinder?替換DIV1-LAMP 反應(yīng)體系中的EvaGreen?，并將其通過(guò)粘附劑預(yù)先封閉于200 μl PCR 小管管蓋內(nèi)，PCR 管內(nèi)添加30 μl DIV1 LAMP 反應(yīng)預(yù)混液(不含模板和熒光染料EvaGreen?)；按照Whatman FTA 卡說(shuō)明書(shū)，利用其提取4 尾人工感染DIV1 的凡納濱對(duì)蝦組織核酸及2 尾健康對(duì)蝦組織核酸，將核酸分別加入上述含有30 μl DIV1 LAMP反應(yīng)預(yù)混液的PCR 小管內(nèi)，同時(shí)，設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照；在64.4℃條件下，保溫50 min，然后，通過(guò)在 90℃條件下保溫 3 min 使預(yù)置在管蓋內(nèi)的GeneFinder?染料脫落進(jìn)入LAMP 反應(yīng)預(yù)混液，完成擴(kuò)增產(chǎn)物染色。PCR 小管內(nèi)有擴(kuò)增產(chǎn)物生成，則顯示為熒光綠色，表明樣品為DIV1 陽(yáng)性；PCR 小管內(nèi)無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物生成，則顯示為橙黃色，表明樣品為DIV1陰性。

2 結(jié)果

2.1 DIV1 的LAMP 反應(yīng)體系條件的優(yōu)化

LAMP優(yōu)化結(jié)果顯示，擴(kuò)增反應(yīng)溫度在64.4℃時(shí)，Ct值(15.44)和重復(fù)間Ct值標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD值)(0.09)最小(圖1a)。在64.4℃擴(kuò)增溫度下，綜合考慮擴(kuò)增Ct均值及重復(fù)測(cè)試Ct值標(biāo)準(zhǔn)偏差最小、成本經(jīng)濟(jì)和方法穩(wěn)定等因素，確立優(yōu)化后的擴(kuò)增反應(yīng)預(yù)混體系中dNTPs和MgSO4的濃度分別為1.2和4.0 mmol/L (圖1b)，Bst 2.0 WarmStart?DNA 聚 合 酶 的 用 量 為6.4 U(圖1c)，EvaGreen?的用量為0.8 μmol/L (圖1d)。

2.2 DIV1-LAMP 分析靈敏度檢驗(yàn)與標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

使用優(yōu)化后的LAMP 反應(yīng)體系對(duì)10 倍梯度稀釋的pMD18-DIV1 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品在3.54×109～3.54×102拷貝/反應(yīng)范圍內(nèi)均有較強(qiáng)的熒光信號(hào)(圖2a)，說(shuō)明本研究建立的DIV1的LAMP 檢測(cè)方法對(duì)質(zhì)粒模板的檢測(cè)下限可低至3.54×102拷貝/反應(yīng)。在3.54×109～3.54×103拷貝/反應(yīng)的起始模板濃度范圍內(nèi)，pMD18-DIV1 起始模板濃度對(duì)數(shù)值與擴(kuò)增反應(yīng)Ct值之間具有良好的線性關(guān)系(圖2b)。其關(guān)系曲線為Ct=–2.918 Lg(Sq)+39.331，R2=0.996。

圖1 十足目虹彩病毒(DIV1) LAMP 反應(yīng)體系的優(yōu)化Fig.1 Optimization of DIV1-LAMP reaction

圖2 十足目虹彩病毒(DIV1) LAMP 方法以pMD18-DIV1 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板產(chǎn)生的擴(kuò)增曲線(a)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(b)Fig.2 Amplification curve (a) and standard curve (b) of DIV1-LAMP detection method by using pMD18-DIV1 plasmid standard as templates

2.3 DIV1-LAMP 分析特異性檢驗(yàn)

以DIV1、EHP、VpAHPND、CMNV、IHHNV、WSSV、TSV 和YHV 等主要蝦類(lèi)病原DNA 或cDNA為模板進(jìn)行DIV1-LAMP 檢測(cè)的特異性分析，結(jié)果顯示，只有當(dāng)檢測(cè)樣品含有DIV1 陽(yáng)性核酸時(shí)，擴(kuò)增反應(yīng)才產(chǎn)生“S”形擴(kuò)增曲線，其他病原的核酸均無(wú)陽(yáng)性擴(kuò)增曲線(圖3)。該結(jié)果說(shuō)明，本研究建立的DIV1-LAMP 方法與上述其他常見(jiàn)的對(duì)蝦病原無(wú)交叉反應(yīng)，可特異性檢測(cè)DIV1。

圖3 十足目虹彩病毒(DIV1) LAMP 方法的分析特異性Fig.3 Analytical specificity of shrimp hemocyte iridescent virus (DIV1) LAMP assay

2.4 DIV1-LAMP 方法可重復(fù)性和可重現(xiàn)性分析

以3.54×109～3.54×103拷貝/反應(yīng)的pMD18-DIV1質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，對(duì)DIV1-LAMP 檢測(cè)方法的可重復(fù)性進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果顯示，在起始模板濃度為3.54×109～3.54×103拷貝/反應(yīng)的范圍內(nèi)，DIV1-LAMP檢測(cè)方法組內(nèi)和組間檢測(cè)的變異系數(shù)CV 分別小于1.89%和1.63% (表2)，說(shuō)明在此起始模板濃度范圍內(nèi)該方法穩(wěn)定性較好。

以3.54×109～3.54×103拷貝/反應(yīng)的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，在3 個(gè)不同實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下進(jìn)行DIV1 可重現(xiàn)性分析，結(jié)果顯示，在上述模板濃度范圍內(nèi)DIV1-LAMP反應(yīng)的組間Ct值的P 值均大于0.05 (表3)，說(shuō)明不同環(huán)境下，該方法擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線與即時(shí)檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)品曲線差異不顯著。說(shuō)明本研究建立的DIV1-LAMP 方法在不同實(shí)驗(yàn)室環(huán)境具有良好的可重現(xiàn)性。

表2 十足目虹彩病毒(DIV1) LAMP 檢測(cè)組內(nèi)和組間重復(fù)性Tab.2 Intra-assay and inter-assay variability of DIV1-LAMP assay

表3 DIV1-LAMP 分析法的組間變異性Tab.3 Analysis of variance of inter-assay variability of DIV1-LAMP assay

2.5 DIV1-LAMP 方法對(duì)臨床樣品的檢測(cè)

本研究對(duì)人工感染DIV1 3 d 后的40 尾凡納濱對(duì)蝦樣品(編號(hào)20191114001～20191114040)分別進(jìn)行了LAMP 檢測(cè)和TaqMan 熒光定量PCR 檢測(cè)，結(jié)果顯示，2 種方法對(duì)病毒載量超過(guò)102copies/μl 的樣品定性結(jié)果基本一致；而對(duì)病毒載量低于102copies/μl 的部分樣品，LAMP 方法檢測(cè)結(jié)果與TaqMan 熒光定量PCR 檢測(cè)結(jié)果不一致(表4)，說(shuō)明本方法不適用于分析DIV1 載量低于102copies/μl 的樣品。

2.6 基于FTA 卡和DIV1-LAMP 方法的對(duì)蝦樣品DIV1 現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)

取4 尾人工感染DIV1 的凡納濱對(duì)蝦及2 尾健康凡納濱對(duì)蝦，利用Whatman FTA 卡現(xiàn)場(chǎng)制備核酸，將核酸加入內(nèi)置GeneFinder?、含有DIV1-LAMP 擴(kuò)增反應(yīng)預(yù)混體系的PCR 小管內(nèi)進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，50 min 后進(jìn)行顯色，結(jié)果顯示，陽(yáng)性對(duì)照和4 尾人工感染DIV1 的凡納濱對(duì)蝦樣品對(duì)應(yīng)的PCR 管內(nèi)呈熒光綠色，為DIV1 陽(yáng)性，而陰性對(duì)照及2 尾健康凡納濱對(duì)蝦樣品對(duì)應(yīng)的PCR 管內(nèi)呈橙紅色，為DIV1陰性(圖4)。該結(jié)果說(shuō)明，利用Whatman FTA 卡進(jìn)行核酸現(xiàn)場(chǎng)制備，結(jié)合核酸染料GeneFinder?預(yù)制于擴(kuò)增反應(yīng)體系小管內(nèi)的方法，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)感染DIV1 對(duì)蝦的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

表4 利用DIV1-LAMP 和TaqMan 熒光定量PCR 方法對(duì)人工感染DIV1 凡納濱對(duì)蝦的檢測(cè)結(jié)果Tab.4 Detection results of DIV1-LAMP and TaqMan qPCR for L. vannamei samples artificially infected with DIV1

圖4 利用FTA 卡和DIV1-LAMP 方法現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)凡納濱對(duì)蝦樣品中DIV1 的顯色圖Fig.4 Results of on-site detection of DIV1 in L. vannamei by using FTA card and DIV1-LAMP assay

3 討論

本研究基于DIV1 主要衣殼蛋白基因設(shè)計(jì)DIV1的LAMP 擴(kuò)增引物，在優(yōu)化LAMP 反應(yīng)溫度、各試劑組分濃度和用量的基礎(chǔ)上建立了DIV1-LAMP 實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)技術(shù)。本著成本經(jīng)濟(jì)和體系穩(wěn)定的原則，以求得擴(kuò)增反應(yīng)最小Ct值和SD 值為目標(biāo)，確定優(yōu)化后的DIV1-LAMP 擴(kuò)增溫度和反應(yīng)體系，反應(yīng)溫度在64.4℃時(shí)最佳；優(yōu)化后的反應(yīng)體系中的 MgSO4和dNTPs 濃度分別為 4.0 和 1.2 mmol/L，Bst 2.0 WarmStart?DNA 聚合酶和EvaGreen?的用量分別為6.4 U 和0.8 μmol/L。該技術(shù)通過(guò)Bst 2.0 WarmStart?DNA 聚合酶進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增，利用EvaGreen?染料指示反應(yīng)過(guò)程，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)DIV1 靶基因的實(shí)時(shí)熒光快速檢測(cè)。

以10 倍濃度梯度稀釋的pMD18-DIV1 質(zhì)粒為模板擴(kuò)增并構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增曲線結(jié)果顯示，在3.54×109～3.54×103拷貝/反應(yīng)的范圍內(nèi)，起始模板濃度對(duì)數(shù)值與擴(kuò)增 Ct值間呈良好的線性關(guān)系(R2=0.996)，利用擴(kuò)增Ct值可準(zhǔn)確評(píng)估起始模板拷貝數(shù)，這表明在該濃度范圍內(nèi)，本研究所建立的LAMP方法適合作為DIV1 定量檢測(cè)的有效工具。前期多項(xiàng)有關(guān) LAMP 實(shí)時(shí)熒光定量方法的研究顯示，由于LAMP 反應(yīng)本身的特性，當(dāng)起始模板濃度<1000 拷貝時(shí)，起始模板濃度對(duì)數(shù)值與擴(kuò)增Ct值的相關(guān)系數(shù)明顯降低(Mori et al, 2004; Suzuki et al, 2011; Wei et al,2013; Zhang et al, 2017)。本研究中，DIV1-LAMP 在低拷貝起始模板條件下的定量分析結(jié)果與此前的相關(guān)報(bào)道一致，這也說(shuō)明DIV1-LAMP 方法不適于對(duì)低拷貝(<1000)模板進(jìn)行準(zhǔn)確定量。Qiu 等(2018)基于DIV1 基因組中ATPase 基因(ORF114R)所設(shè)計(jì)的引物和探針，建立了DIV1 的TaqMan 探針熒光定量PCR方法，該方法于實(shí)驗(yàn)室條件下可在2.5 h 內(nèi)完成檢測(cè)，檢測(cè)限低至4 拷貝/反應(yīng)，可用于DIV1 感染早期的檢測(cè)預(yù)警，適用于對(duì)對(duì)蝦苗種、出入境對(duì)蝦樣品等進(jìn)行DIV1 病原的篩查。與已報(bào)道的DIV1 TaqMan 熒光定量PCR 檢測(cè)方法相比，本研究建立的DIV1-LAMP檢測(cè)方法在實(shí)驗(yàn)室條件下可在50 min 完成反應(yīng)，檢測(cè)時(shí)間大大縮短，且成本低廉，可用于發(fā)病對(duì)蝦(一般攜帶較高拷貝病原)樣品的快速檢測(cè)和輔助診斷，適用于水產(chǎn)技術(shù)推廣部門(mén)、研究單位進(jìn)行DIV1 流行病學(xué)調(diào)查的大規(guī)模定性或定量檢測(cè)。

作者實(shí)驗(yàn)室此前比較了基于DIV1 ATPase 基因和衣殼蛋白基因開(kāi)發(fā)的2 種TaqMan 探針熒光定量PCR 檢測(cè)方法，發(fā)現(xiàn)上述2 個(gè)目標(biāo)基因?qū)z測(cè)方法靈敏度和特異性的影響很小。本研究對(duì)人工感染DIV1的凡納濱對(duì)蝦樣品分別進(jìn)行基于 ATPase 基因的TaqMan 熒光定量PCR 方法和基于衣殼蛋白基因的LAMP 方法檢測(cè)，結(jié)果顯示，2 種方法對(duì)病毒載量低于102copies/μl 的部分樣品的檢測(cè)結(jié)果不一致，推測(cè)其原因可能是由于本研究中所建立的DIV1-LAMP 方法不適用于分析病毒載量低于102copies/μl 的樣品所致。

目前，LAMP 技術(shù)在病原檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用已十分廣泛，該技術(shù)也被用于多種水生動(dòng)物相關(guān)致病細(xì)菌、病毒和真菌的檢測(cè)中。如Arunrut 等(2016)報(bào)道一種以膠體金為探針的LAMP-AuNP 方法，可快速檢測(cè)VpAHPND的PirA 基因，檢出限為100 CFU，具有很高的實(shí)用價(jià)值。Zhang 等(2017)和李小平(2018、2019)分別利用RT-LAMP 技術(shù)研發(fā)出對(duì)蝦偷死野田村病毒和行動(dòng)障礙野田村病毒(Movement disorder nodavirus,MDNV)的定量檢測(cè)方法，并通過(guò)將核酸染料添加到反應(yīng)體系中的方法，使 LAMP 檢測(cè)結(jié)果可視化。Kumar 等(2018)利用LAMP 方法與Whatman FTA 卡相結(jié)合的方法，用于檢測(cè)引起對(duì)蝦生長(zhǎng)緩慢的蝦肝腸胞蟲(chóng)(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)的SSU rRNA基因，可實(shí)現(xiàn)對(duì)EHP 的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)?；趯?duì)蝦養(yǎng)殖者、養(yǎng)殖企業(yè)、水產(chǎn)技術(shù)推廣部門(mén)和研究單位等開(kāi)展 DIV1 現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需求，本研究在建立DIV1-LAMP 熒光定量方法的基礎(chǔ)上，通過(guò)結(jié)合Whatman FTA 卡現(xiàn)場(chǎng)制備對(duì)蝦組織核酸和顯色染料預(yù)置的方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)DIV1 的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。整個(gè)檢測(cè)無(wú)需PCR 儀等復(fù)雜或昂貴的儀器設(shè)備，只需溫度計(jì)和保溫杯提供恒溫水浴即可完成檢測(cè)，檢測(cè)過(guò)程不超過(guò)1 h，單個(gè)檢測(cè)反應(yīng)成本相當(dāng)于TaqMan 熒光定量PCR 檢測(cè)方法的1/10 ～ 1/5。

綜上所述，本研究建立并優(yōu)化了一種檢測(cè)DIV1的LAMP 實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)方法，其特異性強(qiáng)，速度快，成本低，適用于在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)對(duì)患病對(duì)蝦進(jìn)行DIV1 的快速檢測(cè)或輔助診斷。同時(shí)，本研究還將Whatman FTA 卡核酸現(xiàn)場(chǎng)制備方法與DIV1-LAMP方法相結(jié)合，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)了DIV1 的現(xiàn)場(chǎng)快速高效檢測(cè)技術(shù)，適用于開(kāi)展養(yǎng)殖對(duì)蝦的DIV1 現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。本研究為DIV1 這一新發(fā)蝦類(lèi)病原提供了可靠的檢測(cè)方法，對(duì)實(shí)現(xiàn)低成本、大規(guī)模、快速DIV1 檢疫，以及控制該病毒性疫病的傳播和流行具有重要意義。

致謝：中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所養(yǎng)殖生物疾病控制與分子病理學(xué)研究室研究生協(xié)助DIV1感染對(duì)蝦取樣和核酸提取，謹(jǐn)致謝忱。