高龍, 張趙文斌, 常江

生物玻璃/聚乳酸多孔微球的制備及其作為細(xì)胞載體的研究

高龍1,2, 張趙文斌1,2, 常江1,2

(1. 中國(guó)科學(xué)院 上海硅酸鹽研究所, 上海 200050; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

具有大孔結(jié)構(gòu)的多孔微球既可以在體外擴(kuò)增細(xì)胞, 還可以作為細(xì)胞的傳輸工具, 通過注射的方式把細(xì)胞輸送到需要修復(fù)的組織部位。生物玻璃雖然生物活性良好, 但難以直接制備成大孔結(jié)構(gòu)的微載體。因此, 本研究將生物玻璃(BG)與聚乳酸(PLA)高分子復(fù)合, 通過復(fù)乳法制備了一種含生物玻璃的多孔微球細(xì)胞微載體。并通過掃描電鏡(SEM)、熱重分析(TGA)、電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OES)等方法研究分析了微球的形貌、組成和離子釋放。通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn), 證明細(xì)胞可以在微球的多孔結(jié)構(gòu)中粘附和增殖, 并且生物玻璃可以促進(jìn)細(xì)胞增殖, 在組織工程中具有潛在應(yīng)用。

多孔微球; 生物玻璃; 聚乳酸; 細(xì)胞微載體; 組織工程

多孔微球細(xì)胞微載體既可以在體外大量擴(kuò)增細(xì)胞[1-2], 又可以作為細(xì)胞和藥物的載體, 通過注射的方法把細(xì)胞或藥物輸送到缺損部位[3-4]。特別是具有開放式大孔結(jié)構(gòu)的微球, 既能夠在體外培養(yǎng)時(shí)幫助細(xì)胞向內(nèi)生長(zhǎng), 又能在注射過程中起到支撐作用, 以保護(hù)微球內(nèi)部的細(xì)胞免于擠壓和摩擦[5]。基于上述的優(yōu)異性能, 微球細(xì)胞微載體已經(jīng)用于骨缺損修復(fù)[6-9]、軟骨再生[10-11]和心肌修復(fù)[12]。但是, 多孔微球細(xì)胞微載體往往缺乏生物活性, 在體外細(xì)胞擴(kuò)增或者體內(nèi)細(xì)胞傳輸過程中, 材料本身沒有促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和分化的生物活性。通過添加生長(zhǎng)因子等方式獲得生物活性, 往往也存在生長(zhǎng)因子脆弱、容易失活和價(jià)格昂貴等弊端。所以, 在組織修復(fù)當(dāng)中迫切需要一種具有良好生物活性的細(xì)胞微載體。

生物玻璃作為一種無(wú)機(jī)材料, 不僅在骨和牙齒的修復(fù)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[13-15], 也被證實(shí)在軟組織修復(fù)中具有良好的生物活性[16]。但是, 生物玻璃難以直接制備成微球細(xì)胞微載體。首先, 生物玻璃難以塑型,制備出來(lái)的微球沒有細(xì)胞培養(yǎng)所需的大孔結(jié)構(gòu)[17]; 其次, 純生物玻璃微球離子釋放速率過快, 其Si離子濃度甚至?xí)^60 μg/mL, 過高的離子濃度可對(duì)細(xì)胞增值有抑制作用, 比如會(huì)抑制成纖維細(xì)胞的遷移和分化[16]。此外, 生物玻璃快速的離子交換, 還會(huì)造成過強(qiáng)的堿性環(huán)境, 產(chǎn)生細(xì)胞毒性。目前, 常見的多孔微球細(xì)胞微載體往往是由高分子材料制備而成的, 雖然具有良好的生物相容性和孔結(jié)構(gòu), 但是, 缺乏刺激細(xì)胞增殖和分化的生物活性。因此, 將生物玻璃與高分子材料復(fù)合, 制備出一種既具有良好生物活性, 又具有多孔結(jié)構(gòu)的微球細(xì)胞微載體, 對(duì)于組織缺損修復(fù)及組織工程應(yīng)用具有重要意義。

因此, 本研究利用復(fù)乳法制備了一種生物玻璃/聚乳酸復(fù)合微球細(xì)胞微載體。首先, 生物玻璃能夠釋放活性離子, 促進(jìn)細(xì)胞在微載體上的粘附和增殖, 并且由于離子的濃度比純生物玻璃微球低, 避免了離子濃度過高對(duì)細(xì)胞的抑制作用。其次, 聚乳酸具有良好的可塑性, 可以制備出貫通的多孔結(jié)構(gòu), 適宜細(xì)胞在其表面和內(nèi)部的粘附和增殖。同時(shí), 聚乳酸材料具有弱酸性, 生物玻璃呈堿性, 與聚乳酸復(fù)合可以避免聚乳酸降解產(chǎn)生的酸性對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不利影響。在本研究當(dāng)中, 詳細(xì)探討了聚乳酸濃度和致孔劑用量對(duì)微球結(jié)構(gòu)的影響。同時(shí), 將復(fù)合微載體用于細(xì)胞的體外擴(kuò)增, 考察了細(xì)胞在微球細(xì)胞微載體表面及內(nèi)部孔結(jié)構(gòu)上的粘附以及細(xì)胞的活力。

1 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)所使用的聚乳酸(PLA), 分子量為100萬(wàn), 購(gòu)于濟(jì)南岱罡生物工程有限公司。生物玻璃, 型號(hào)為45S5, 購(gòu)于昆山華僑科技新材料有限公司。二氯甲烷、明膠和聚乙烯醇(PVA)統(tǒng)一購(gòu)置于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1 BG/PLA微球的制備

BG/PLA微球的制備過程如圖1所示:

首先, 將一定量PLA加入到20 mL二氯甲烷中, 充分溶解后, 加入0.2 g生物玻璃和一定量的致孔劑(6.5%的明膠水溶液)。利用高速剪切乳化機(jī), 在15000 r/min的條件下, 將上述混合液快速乳化, 得到乳液備用。

然后, 將上述乳液加入到50 mL預(yù)冷至2 ℃的0.1% PVA溶液中。在800 r/min的速率下磁力攪拌2 min, 將乳液分散成小球。

最后, 將上述小球收集在800 mL預(yù)冷至2 ℃的0.1% PVA溶液中, 通風(fēng)櫥內(nèi)揮發(fā)去除溶劑。并用大量50 ℃的清水洗去明膠, 獲得多孔微球。

1.2 表征分析

將制備好的微球樣品冷凍干燥好, 置于導(dǎo)電膠上, 噴金后, 用掃描電子顯微鏡(JEM-2100F)觀察其形貌。通過熱重分析儀(TA-Q500), 分析復(fù)合微球中的生物玻璃含量, 升溫速率為10 ℃/min, 最高溫度是700 ℃, 氣氛條件是氮?dú)鈿夥?。Si離子釋放的測(cè)試方法: 將制備的1.0 g復(fù)合微球置于5 mL去離子水中, 在固定的時(shí)間點(diǎn)抽取上清液, 然后利用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OES)獲得浸提液中Si離子的濃度。

1.3 細(xì)胞的增殖

本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hBMSCs, Cyagen Biosciences)。在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱, 5vol% CO2的濕潤(rùn)環(huán)境中培養(yǎng), 每3 d換一次培養(yǎng)液。

圖1 生物玻璃/聚乳酸復(fù)合微球細(xì)胞微載體制備示意圖

細(xì)胞在微球上接種方法如下。100 mL培養(yǎng)皿中, 將5×106個(gè)細(xì)胞與1 mL微球進(jìn)行混合。然后, 加入10 mL培養(yǎng)基, 在培養(yǎng)箱中以75 r/min轉(zhuǎn)速振搖 6 h。最后, 加入20 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至37 ℃、5vol% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)長(zhǎng)期培養(yǎng), 兩天更換一次培養(yǎng)液。到達(dá)預(yù)設(shè)時(shí)間1、3和7 d時(shí), 采用Cell Counting Kit-8 (CCK8, Japan)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活性。用Live-dead考察微球上的細(xì)胞分布以及生存和死亡情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 BG/PLA微球的制備

粒徑是評(píng)價(jià)微球細(xì)胞微載體的一個(gè)重要指標(biāo)。粒徑過小, 不利于細(xì)胞的粘附; 粒徑過大, 不利于注射。研究表明, 直徑約200 μm的微球細(xì)胞微載體能夠同時(shí)滿足細(xì)胞粘附和注射的需求[1]。PLA濃度是決定粒徑的重要因素, 因此本課題組首先對(duì)聚乳酸溶液的濃度進(jìn)行了篩選。

從圖2可以看出, 隨著PLA溶液濃度的增加, 所得到的微球的平均直徑越來(lái)越大。在PLA濃度為10%的時(shí)候, 所制備的微球平均直徑約200 μm, 同時(shí)分布在(200±20) μm范圍內(nèi)的微球比例最大, 約為52%。因此, 選取10%的PLA溶液用于后續(xù)的微球制備。

對(duì)于微球細(xì)胞微載體來(lái)說, 開放的多孔結(jié)構(gòu)既有利于細(xì)胞自由地進(jìn)出, 也適于氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳輸以及代謝廢物的排出。之前的研究表明, 直徑30~50 μm的大孔, 最適于細(xì)胞進(jìn)入微球內(nèi)部進(jìn)行粘附和增殖[1,10-11]。通過調(diào)節(jié)致孔劑用量, 制備出不同孔結(jié)構(gòu)的BG/PLA微球, 結(jié)果如圖3所示。通過微球的SEM照片可以看出, 隨著致孔劑含量的增加, 微球的孔徑越來(lái)越大, 內(nèi)部孔徑之間的貫通性也越來(lái)越好。但是, 當(dāng)致孔劑含量達(dá)到8.0%時(shí), 孔結(jié)構(gòu)過大, 會(huì)破壞微球的球形結(jié)構(gòu)。而致孔劑用量為6.0%時(shí), 所制備的微球既能維持大量30~50 μm的大孔, 微球也能維持完整的結(jié)構(gòu), 是最適宜的用量。

如圖4所示, 對(duì)孔徑的進(jìn)一步定量統(tǒng)計(jì)結(jié)果也表明, 隨著致孔劑含量的增加, 微球上孔的平均孔徑也會(huì)依次增加。當(dāng)致孔劑的用量為6.0%時(shí), 微球上直徑30~50 μm的大孔比例最高, 約為7%。同時(shí), 大量小孔的同時(shí)存在也有助于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳輸和代謝廢物的排出。因此, 本課題組選取6.0%致孔劑用量用于后續(xù)的微球制備。

上述結(jié)果表明, 通過篩選適宜的PLA濃度和致孔劑用量, 可以通過復(fù)乳法制備出粒徑和孔結(jié)構(gòu)都適宜的多孔微球, 滿足體外細(xì)胞三維培養(yǎng)對(duì)微載體結(jié)構(gòu)的要求。這一方法解決了生物玻璃難以塑型的難題, 為生物玻璃材料在組織工程中的應(yīng)用提供了一種新的形式。

圖2 PLA濃度為(a) 5.0%、(b) 7.5%、(c) 10.0%、(d) 12.5%的BG/PLA微球的粒徑分布

圖3 致孔劑用量為(a) 2.0%、(b) 4.0%、(c) 6.0%、(d) 8.0%的BG/PLA多孔微球

圖4 致孔劑用量為(a) 2.0、(b) 4.0、(c) 6.0、(d) 8.0%的BG/PLA微球的孔徑分布

2.2 復(fù)合微球中生物玻璃的含量及Si離子釋放

本課題組通過復(fù)乳法得到了具有多孔結(jié)構(gòu)的微球, 但是, 單純通過SEM照片還無(wú)法確定生物玻璃顆粒是否復(fù)合在微球當(dāng)中。生物玻璃主要通過釋放活性Si離子來(lái)發(fā)揮其促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和分化的生物活性。因此, 首先通過熱重分析, 來(lái)確定微球是否含有生物玻璃。

結(jié)果如圖5所示, 純PLA微球在溫度升高以后, 其有機(jī)高分子PLA會(huì)迅速降解和揮發(fā), 在700 ℃時(shí),殘余的質(zhì)量幾乎為零。而無(wú)機(jī)的生物玻璃在加熱以后, 質(zhì)量變化很小, 在700 ℃時(shí), 殘余的質(zhì)量約為最初質(zhì)量的96.2%。在BG/PLA復(fù)合微球中, 溫度升高以后, PLA的降解揮發(fā)造成質(zhì)量迅速下降, 但是BG則使得質(zhì)量不會(huì)降為0, 在700 ℃時(shí), 殘余質(zhì)量為初始質(zhì)量的4.8%。通過上述結(jié)果, 可以計(jì)算出, 在復(fù)合微球當(dāng)中聚乳酸的質(zhì)量約為95.0%, 生物玻璃的質(zhì)量約為5.0%。

圖5 BG/PLA復(fù)合微球的熱重分析圖

生物玻璃當(dāng)中含有鈉、鈣、硅和磷等多種元素, 可以釋放多種離子。但是, 其促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移等主要是通過釋放活性Si離子來(lái)實(shí)現(xiàn)的[13,18]。因此, 本課題組對(duì)復(fù)合微球活性Si離子的釋放進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果如圖6所示, BG/PLA復(fù)合微球可以穩(wěn)定釋放Si離子, 濃度在1.2~2.2 μg/mL范圍內(nèi)。這說明, 生物玻璃與PLA復(fù)合以后, 仍然可以通過釋放活性離子來(lái)發(fā)揮其生物活性。

上述的熱重分析和離子釋放結(jié)果進(jìn)一步證明了生物玻璃成功地復(fù)合到多孔微球當(dāng)中, 并且仍可通過釋放Si離子來(lái)發(fā)揮其生物活性。同時(shí), 與之前報(bào)道的純生物玻璃微球相比, 其Si離子釋放速率顯著降低, 避免了濃度過高對(duì)于細(xì)胞的抑制, 從而有利于其發(fā)揮良好的生物活性。

2.3 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

為了考察引入生物玻璃對(duì)細(xì)胞在微載體上粘附和增殖的影響, 本課題組分別用生物玻璃的PLA微載體與BG/PLA微載體進(jìn)行體外細(xì)胞擴(kuò)增, 比較其細(xì)胞粘附和增殖情況。

結(jié)果如圖7所示, 在沒有生物玻璃的PLA微載體上, 細(xì)胞也可以進(jìn)行粘附和增殖, 但是細(xì)胞的數(shù)量相對(duì)較少, 并且多分布于微載體的表面, 進(jìn)入內(nèi)部多孔結(jié)構(gòu)的細(xì)胞數(shù)量較少。而在BG/PLA微載體上, 不但細(xì)胞數(shù)量有了顯著增加, 分布也更加廣泛。這說明生物玻璃的引入, 增加了微載體擴(kuò)增細(xì)胞的效率。

此外, 本課題組還采用CCK8對(duì)細(xì)胞的活性進(jìn)行了定量分析。結(jié)果如圖8所示, BG/PLA微球上的細(xì)胞比純PLA微球上的細(xì)胞具有更高的活力。這說明生物玻璃可以明顯地提高細(xì)胞活性, 提高了細(xì)胞體外擴(kuò)增的效率。

細(xì)胞進(jìn)入微球內(nèi)部, 既可以拓寬增殖的空間, 又能減少注射時(shí)細(xì)胞所受的傷害, 是評(píng)價(jià)微球細(xì)胞微載體的重要指標(biāo)[5]。為了進(jìn)一步研究細(xì)胞是否真正進(jìn)入BG/PLA微球細(xì)胞微載體內(nèi)部, 本課題組在微球上分別選取不同深度的截面進(jìn)行分析。如圖9所示, 在BG/PLA復(fù)合微球細(xì)胞微載體的不同深度截面上均有大量的細(xì)胞粘附, 而且存在細(xì)胞的面積與微球相應(yīng)的截面積相當(dāng), 說明細(xì)胞在微球細(xì)胞微載體三維結(jié)構(gòu)中粘附和增殖良好。

圖6 BG/PLA復(fù)合微球的Si離子釋放

圖7 (a)PLA微球和(b)BG/PLA微球上細(xì)胞的活死染色照片

圖8 細(xì)胞在微球上的增殖

圖9 細(xì)胞在BG/PLA微球不同截面上的分布

體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, BG/PLA微球能夠有效地促進(jìn)細(xì)胞的擴(kuò)增。通過釋放活性Si離子, BG/ PLA微球貫穿的大孔結(jié)構(gòu)提供了更大的空間, 從而能夠快速擴(kuò)張細(xì)胞, 滿足組織工程的需求。同時(shí), 微球的剛性結(jié)構(gòu)和活性離子還可以為進(jìn)入其內(nèi)部的細(xì)胞提供良好的保護(hù)作用, 避免其在后續(xù)的注射過程中受到摩擦損傷。對(duì)于細(xì)胞在生物組織中的駐留, 更好地修復(fù)受損組織具有重要意義。

3 結(jié)論

1) 采用復(fù)乳法將生物玻璃與聚乳酸復(fù)合, 能夠獲得具有適宜直徑和貫通大孔結(jié)構(gòu)的復(fù)合微球。

2) BG/PLA復(fù)合微球細(xì)胞微載體能夠穩(wěn)定地釋放活性Si離子, 促進(jìn)細(xì)胞在其表面的粘附和增殖。

3) 細(xì)胞既可以在BG/PLA復(fù)合微球的表面增殖, 還可以進(jìn)入其大孔內(nèi)部, 大大提高了細(xì)胞擴(kuò)增的效率。

4) 本研究所制備的復(fù)合微球細(xì)胞微載體既能夠體外擴(kuò)增細(xì)胞, 又具有合適的粒徑滿足注射的需求, 在組織工程領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

本研究通過細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證了BG/PLA復(fù)合微球在促進(jìn)細(xì)胞粘附及增殖方面的優(yōu)勢(shì)。但仍有一系列科學(xué)問題有待進(jìn)一步研究, 比如: 細(xì)胞進(jìn)入到BG/PLA微球內(nèi)部結(jié)構(gòu)以后, 這一特殊的離子和結(jié)構(gòu)環(huán)境對(duì)細(xì)胞有何影響; BG/PLA復(fù)合微球釋放的活性硅離子能否促進(jìn)細(xì)胞在體內(nèi)組織中的駐留和定向分化等。通過系統(tǒng)的體內(nèi)外生物學(xué)實(shí)驗(yàn)來(lái)回答這些科學(xué)問題以后, 可以進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)BG/PLA復(fù)合微球在骨、心肌、脂肪等組織修復(fù)中的應(yīng)用。

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Bioglass/Polylactic Acid Porous Microspheres: Preparation and Their Application as Cell Microcarriers

GAO Long1,2, ZHANG Zhaowenbin1,2, CHANG Jiang1,2

(1. Shanghai Institute of Ceramics, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200050, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

Porous microsphere cell microcarrier with macroporous structure can not only amplify cells, but also serve as cell delivery tools to deliver cells to damaged tissues by injection. Bioglass (BG) is an inorganic material with excellent biological activity, however, it is difficult to directly prepare microcarriers with macroporous structure. Therefore, in this study, a BG/poly-lactic acid (PLA) porous microspheres was prepared by double emulsion method. The morphology and structure of the microsphere were characterized by SEM, and the load of BG in the microsphere was characterized by thermo gravimetric analysis and its ion release was detected by ICP. Cell proliferation experiments showed that cells could adhere and grow on the surface and inside of the microspheres. The results show that the microsphere with interconnected open-pore microstructure is suit for cell adhesion and proliferation. Bioglass can promote cell proliferation in the microspheres and the obtained BG/PLA composite microsphere has great potential applications in tissue engineering.

porous microsphere; bioglass; polylactic acid; cell microcarrier; tissue engineering

R 318.08

A

1000-324X(2020)10-1163-06

10.15541/jim20190593

2019-11-23;

2019-12-19

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2016YFC1100201); 中國(guó)科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)(XDA16010203) National Key Research and Development Plan of China (2016YFC1100201); The Strategic Priority Research Program of the Chinese Academy of Sciences (XDA16010203)

高龍(1988–), 男, 博士研究生. E-mail: gaolong@sina.cnGAO Long (1988–), male, PhD candidate. E-mail: gaolong@sina.cn

常江, 研究員. E-mail: jchang@mail.sic.ac.cn CHANG Jiang, professor. E-mail: jchang@mail.sic.ac.cn