（云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650224）

藍(lán)舌?。╞luetongue，BT）是發(fā)生于部分反芻動物的一種蟲媒傳播疫病，因病情嚴(yán)重動物的舌頭嚴(yán)重?fù)p傷并呈深藍(lán)色而得名。其病原體是藍(lán)舌病病毒（bluetongue virus，BTV），屬于呼腸孤病毒科環(huán)狀病毒屬[1]。BTV主要感染牛、羊、鹿等反芻動物，其中綿羊最易感。

自19 世紀(jì)首次在南非發(fā)現(xiàn)BT 以來，除南極洲以外的各大洲均發(fā)生過大規(guī)模BT 疫情，對畜牧經(jīng)濟(jì)造成了重大損失[2-3]。目前已知的BTV 血清型共有27 種，其中在我國境內(nèi)發(fā)現(xiàn)的血清型共14 種[4]。雖然我國至今未發(fā)生大規(guī)模BT 疫情，但是自1979 年在云南省師宗縣發(fā)現(xiàn)國內(nèi)首例疫情以來，對BT 的監(jiān)控及防治研究成為國內(nèi)動物病防治的工作之一。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA）、血清中和試驗(yàn)（serum neutralization test，SNT）、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（polymerase chain reaction，PCR）及病毒分離技術(shù)是檢測診斷及分析動物病毒傳染病的主要方法。ELISA、PCR、病毒分離也是目前最常用的BT 監(jiān)測及流行病學(xué)調(diào)查方法。

通常情況下，血清樣品可以用于上述各種檢測及試驗(yàn)。但BTV 具有吸附紅細(xì)胞特性[1，5]，因此無論是PCR 檢測病毒核酸還是從血液中分離BTV，均需要全血樣品而非血清樣品[6-8]。因此，在調(diào)查動物BTV 感染情況時(shí)，通常需要同時(shí)采集抗凝血樣品和血清樣品，前者用于PCR 檢測及病毒分離，后者用于ELISA 檢測病毒抗體或抗原。雖然ELISA 試驗(yàn)通常用于檢測血清樣品，但少數(shù)情況下也使用血漿樣品[9-13]。因此，本試驗(yàn)旨在對比BTV 易感動物同源血漿及血清的ELISA 檢測結(jié)果，以期分析血漿樣品替代血清樣品進(jìn)行ELISA檢測的可行性，從而減少樣品采集工作量及樣品數(shù)量，方便對養(yǎng)殖場牛、羊等動物的BTV 檢測工作。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及材料

1.1.1 主要試劑 BTV 的羊抗血清及兔抗血清：本實(shí)驗(yàn)室制備并保存[14]；HRP 標(biāo)記的羊抗兔二抗：65-6120，Invitrogen 公 司；PBST：0.01 mol/L PBS（B040100-0005，上海生工）加入0.05%的Tween-20（A600560，BIO BASIC INC）；封閉液：含5%特級馬血清（S9050，Solarbio）及0.01%硫柳汞（A600610，BIO BASIC INC）的PBST；抗體稀釋液：含1%脫脂奶粉（完達(dá)山）及0.01%硫柳汞的PBST；TMB：LZ0823B50102，BIO BASIC INC 公司；反應(yīng)終止液：0.625 mol/L H2SO4（7664-93-9，天津渤海化工集團(tuán)供銷有限公司）；Bovine BLU-VP7 Ab ELISA 試劑盒：BG27653，美國TSZ公司。

1.1.2 試驗(yàn)動物 動物全血及血清于2019 年8 月7 日采自云南省德宏州芒市的一家肉牛養(yǎng)殖場。試驗(yàn)所用30 對全血-血清樣品隨機(jī)采自狀態(tài)良好的30 頭牛。

1.2 動物血樣采集及制備

每只動物采集2 管4～5 mL 的全血樣品。其中一支真空采血管含有EDTA 抗凝劑，收集全血樣品；另外一支采血管不含抗凝劑，所采血樣用于血清制備?？鼓獦悠分苯屿o置存放于4 ℃冷庫，48 h 后各吸取約500 μL 上清液，即為血漿樣品。非抗凝血樣品在室溫靜置2 h 后離心（2 000 r/min，5 min），收集上清液，即為血清樣品（本研究所用血清均為清澈的淺黃色血清）。血漿和血清樣品均在4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 ELISA 試驗(yàn)

1.3.1 C-ELISA 檢測BTV 抗體 應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室制備的競爭ELISA（competitive ELISA，C-ELISA）檢測試劑盒[14]測定血漿及血清中的BTV 抗體，方法簡述如下：向高吸附ELISA 板加入50 μL/孔1:1 000 稀釋的BTV 多克隆羊抗血清（用pH9.6 碳酸緩沖液稀釋），4 ℃過夜；PBST 洗板后，加入50 μL/孔的BTV 抗原，37 ℃孵育1 h；洗板后加入200 μL/孔封閉液，37 ℃孵育1 h；甩去封閉液的ELISA 板在通風(fēng)柜吹干后（約2 h）用干凈包裝袋真空封裝，4 ℃保存。取兩塊抗原固定板，一塊用于檢測血漿樣品，另外一塊用于檢測血清樣品。每塊ELISA 板檢測待測樣品30 份、陰性對照樣品1 份、陽性對照樣品1 份，各3 孔重復(fù)。向ELISA板加入40 μL/孔的抗體稀釋液，再分別加入12 μL/孔的待檢樣品、陰性血清、陽性血清；隨后加入50 μL/孔一抗（即100 倍稀釋的抗BTV 的兔抗血清儲存液）；37℃培養(yǎng)箱孵育1 h。用PBST 洗板3 次，加入50 μL/孔1 000 倍稀釋的酶標(biāo)二抗，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育30 min。隨后用PBST 洗板5 次，拍干后加入50 μL/孔TMB 顯色劑，37 ℃避光孵育10 min。加50 μL/孔反應(yīng)終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀讀取450 nm 吸光度（OD）。OD 值結(jié)果換算為抑制率（present inhabitation，PI），PI=（陰性對照OD－樣品OD）/陰性對照平均OD；PI ≥40%判定為陽性[14]。受檢樣品的PI值取3個(gè)平行結(jié)果的平均值，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)差（SD）≥2%時(shí)將偏差最大的PI 值去掉并重新計(jì)算平均值。ΔPI，即PIP－PIS，為血漿樣品（P）平均PI 值減去同源血清樣品（S）平均PI 值的結(jié)果。

1.3.2 ELISA 試劑盒檢測BTV 的VP7 抗體 取2 塊預(yù)包被的ELISA 板，分別用于血漿樣品及血清樣品檢測。每板包括30 份待測樣品（3 孔重復(fù)）、1 份陽性對照血清（因孔數(shù)限制，取2 孔重復(fù)）、1 份陰性對照血清（3 孔重復(fù)）及1 孔空白對照。試驗(yàn)按照試劑盒說明操作?？瞻讓φ湛撞患訕悠芳癏RP 偶聯(lián)試劑，其余步驟同待測樣品。向待測孔加入40 μL/孔稀釋液后再分別加入10 μL/孔待測樣品，向陽性對照孔及陰性對照孔分別加入50 μL/孔試劑盒提供的陽性及陰性標(biāo)準(zhǔn)液，37 ℃孵育30 min；加入150 μL/孔洗液洗板，放置30 s 后甩干，共進(jìn)行5次；加入50 μL/孔HRP 偶聯(lián)試劑，37 ℃孵育30 min后洗板5 次，拍干ELISA 板；先后加入50 μL/孔試劑A 和50 μL/孔試劑B，37 ℃避光孵育15 min；加入50 μL/孔反應(yīng)終止液。使用酶標(biāo)儀讀取OD值。按照說明書標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)陽性對照OD ≥1 及陰性對照OD ≤0.2 時(shí)結(jié)果有效；閾值=陰性對照平均OD+0.15；當(dāng)樣品平均OD ≥閾值即判定為VP7 抗體陽性，否則為陰性。受檢樣品的OD 值取3 孔重復(fù)讀數(shù)的平均值，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)差（SD）≥0.05 時(shí)將偏差最大的一個(gè)讀數(shù)去掉并重新計(jì)算平均值。ODPODS為血漿樣品（P）平均OD 值減去同源血清樣品（S）平均OD 值的結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 C-ELISA 檢測同源血漿及血清BTV 抗體

首先用實(shí)驗(yàn)室自制的C-ELISA 試劑盒檢測樣品中BTV 總抗體。30 份血漿及30 份同源血清各用1 塊ELISA 板檢測，每個(gè)樣設(shè)3 孔重復(fù)。第一次試驗(yàn)所得抑制率（PI）及抑制率差值（ΔPI）結(jié)果（表1、圖1）顯示：整體上看，血漿樣品的抑制率高于或等于同源血清樣品的抑制率；有6 對樣品的ΔPI 明顯過高（ΔPI ≥10%），另外9 對樣品的ΔPI 較大（ΔPI ≥5%），其余樣品沒有明顯差異。該結(jié)果表明，對于同源血漿及血清樣品的檢測，雖然陽性/陰性結(jié)果的判定100%一致，但是對于具體數(shù)據(jù)而言，有20%樣品存在顯著差異，另外30%樣品有較大差異。

表1 15 對血漿-血清樣品的BTV C-ELISA 抑制率差值 %

圖1 30 對同源血漿及血清樣品的抑制率差值（ΔPI）

與清澈的淺黃色血清樣品相比，抗凝血樣品中有不同程度的溶血現(xiàn)象，因此可能造成血漿樣品的品質(zhì)差異，進(jìn)而造成試驗(yàn)誤差。但經(jīng)過審查發(fā)現(xiàn)，血漿樣品的顏色深淺（即溶血程度）與ΔPI 沒有必然聯(lián)系（圖2），例如ΔPI ＞10%的3 號和14號樣品，其顏色與ΔPI ＜5%的4 號和5 號樣品相近。ΔPI 與血漿樣品的顏色深度沒有遞增或遞減關(guān)系。

圖2 部分血漿樣品

考慮到血漿中或多或少的細(xì)胞碎片成分可能影響檢測結(jié)果，對ΔPI ≥10% 的血漿樣品離心（1 500 r/min，1 min），收集上清液，再次進(jìn)行BTV C-ELISA 檢測。為盡量避免操作誤差，每加2 份（6 孔）血漿樣品后即刻加入2 份（6 孔）同源的血清樣品。結(jié)果（圖3）顯示：21 號樣品的ΔPI 依舊很高，但是其他樣品的ΔPI 明顯縮小。綜合兩次C-ELISA 檢測結(jié)果，在30 對樣品中，有1 對樣品（占比3.3%）PI 差值明顯，3 對樣品（占比10%）PI 差值較大，其余樣品（占比87%）無明顯差異（ΔPI 在±5%以內(nèi)）。

圖3 15 對同源血漿及血清樣品復(fù)檢結(jié)果的抑制率差值（ΔPI）

2.2 ELISA 檢測同源血漿及血清BTV VP7 抗體

參照第二次C-ELISA 的加樣方法，用ELISA試劑盒檢測上述樣品的BTV VP7 抗體。結(jié)果（表2 及圖4）顯示：13 號及27 號樣品的ΔOD 偏差明顯（|ΔOD|＞0.1），8 號及12 號樣品ΔOD 偏差較大（|ΔOD|≥0.05），其余樣品ΔOD 不明顯；即同源血漿及血清樣品的OD 值一致率為87%（26/30）。按照試劑盒陽性判定標(biāo)準(zhǔn)，27 號血漿及13 號血清為VP7 抗體陽性，其他均為陰性，結(jié)果一致率為93%（28/30）。

表2 4 對血漿-血清樣品的BTV VP7 ELISA 讀數(shù)差值

圖4 ELISA 檢測同源血漿及血清樣品BTV VP7 抗體的OD 差值（ΔOD）

3 討論

在檢測血液樣品中特定成分時(shí)，因檢測項(xiàng)目不同而需要不同的血液樣品，即全血、血漿、血清[9]。各種ELISA 檢測中，血清是最常用的受檢樣品，少數(shù)情況也使用血漿樣品[9，11，15]。血漿與血清成分的主要差異在于血漿中含有纖維蛋白原、凝血因子、血紅蛋白（溶血時(shí)釋放到血漿中）及人工添加的抗凝劑（本研究中的抗凝劑為EDTA-K2）[9]。血漿中成分較為復(fù)雜，尤其是粗制血漿還可能含有血細(xì)胞或血細(xì)胞碎片，其中某些成分可能干擾ELISA檢測；而血清在制備過程中要經(jīng)歷凝血，有可能造成抗體的損失。

基于簡化BTV 檢測工作的目的，本研究對牛同源血漿和血清的ELISA 檢測結(jié)果進(jìn)行了比較分析。綜合結(jié)果說明：（1）C-ELISA 檢測BTV 總抗體的陽性判定一致率為100%，數(shù)值高度一致（|ΔPI|＜5%）的比率為87%；（2）ELISA 試劑盒檢測BTV VP7 抗體的陽性判定一致率為93%，數(shù)值高度一致（|ΔOD|＜0.05）的比率為87%；（3）溶血對檢測結(jié)果的差異沒有必然聯(lián)系，而離心去除血漿中的沉淀物及嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)操作可以明顯降低檢測誤差。

本研究中的牛同源血漿及血清的抗體水平相當(dāng)，即C-ELISA 檢測BTV 總抗體的|ΔPI|＜5%，ELISA 試劑盒檢 測VP7 抗體的|ΔOD| ＜0.05；結(jié)果的差異程度與ELISA 檢測的板間和平行孔間的實(shí)驗(yàn)誤差相當(dāng)。與之一致的是，賈波等[11]對人同源血漿及血清4 種病原體的抗體或抗原指標(biāo)進(jìn)行ELISA 檢測，說明血漿的抗體水平略低于血清樣品，但這主要?dú)w因于抗凝劑對血漿的稀釋作用（全血中含1/5 體積的抗凝劑）。在BTV 總抗體檢測中，出現(xiàn)1 對反差明顯的樣品（21 號樣品），可能是同源血漿與血清偶然出現(xiàn)的差異，也可能是樣品采集失誤或罕見的實(shí)驗(yàn)誤差造成，因?yàn)樵诘诙蜟-ELISA 檢測中，21 號血漿樣品有2 個(gè)偏高結(jié)果（87.77%、85.58%）和1 個(gè)偏低結(jié)果（65.60%），如果被判定為異常數(shù)據(jù)的那個(gè)數(shù)據(jù)（65.60%）才是真實(shí)結(jié)果的話，那么ΔPI 的結(jié)果將為-0.38%（21號血清PI=65.98%）。在BTV VP7 抗體檢測中，差異特別明顯的兩對樣品為13 號（血漿陰性、血清陽性）和27 號（血漿陽性、血清陰性），也存在類似于21 號樣品的數(shù)據(jù)選擇問題；而且同一個(gè)陰性對照樣品（NC）在2 塊ELISA 板上的ΔOD也達(dá)到了0.052 3，說明板間本身存在較大的試驗(yàn)誤差。

綜上所述，對于ELISA 檢測動物血樣BTV 抗體的試驗(yàn)，血漿樣品可替代血清樣品，溶血程度即血漿顏色不影響檢測結(jié)果，但是粗制血漿中的不可溶雜質(zhì)可能影響檢測結(jié)果，因此需要使用離心除雜后的血漿樣品。此外，當(dāng)樣品檢測結(jié)果介于陽性和陰性的臨界點(diǎn)時(shí)可能出現(xiàn)不同結(jié)果；然而即使是血清樣品，試驗(yàn)操作本身的誤差也可能造成臨界點(diǎn)樣品的誤判。而對于同樣具有紅細(xì)胞吸附特性的其他病毒——流行性鹿出血熱病毒（epizootic hemorrhagic disease virus，EHDV）[1，16]的研究，所涉及的血液樣本采集也可省略血清制備。此外，在野外采集動物血樣用于疫病檢測不方便及時(shí)制備血清的情況下，亦可采集抗凝全血代替血清，隨后在實(shí)驗(yàn)室離心全血后收集血漿用于ELISA 檢測。