潘毅平，郭苗苗，肖升東，閆鵬先，張國慶，賀 筍

（1.天康生物股份有限公司，新疆烏魯木齊 830032；2.天康生物（上海）有限公司，上海 201203）

豬圓環(huán)病毒（porcine circovirus，PCV）是一種無囊膜的單股環(huán)狀DNA 病毒，是最小的DNA病毒之一，目前已發(fā)現(xiàn)PCV1、PCV2、PCV3 以及PCV4。PCV1 為非致病性病毒；PCV2 為致病性病毒，是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）的主要病原；PCV4 與水貂圓環(huán)病毒的基因組一致性最高（66.9%），與其他PCV 基因組的一致性僅為43.2%～51.5%。據(jù)報道[1]，PCV4 檢出豬群患有嚴(yán)重臨床癥狀，并有多種病原微生物共感染現(xiàn)象。

2015 年，美國首次報道了PCV3 在豬群中流行[2]。PCV3 病毒粒子呈二十面體結(jié)構(gòu)，無囊膜，其基因組為單股DNA，全長約2 000 bp，包含3 個主要開放閱讀框（open reading frame，ORF），主要抗原Cap 蛋白與PCV2 Cap 蛋白基因同源性很低，僅30%左右。2016 年起，我國在多個豬場檢測到PCV3。這些豬場無一例外，均出現(xiàn)母豬繁殖障礙、多系統(tǒng)炎癥反應(yīng)和新生仔豬數(shù)量急劇下降等問題[3-5]。PCV3 自發(fā)現(xiàn)以來，已經(jīng)逐漸成為影響我國養(yǎng)豬業(yè)的重要病原體。目前還沒有體外繁殖PCV3 分離株獲得成功的報道，這也在一定程度上制約了PCV3 滅活疫苗的研發(fā)。

研究人員相繼將PCV3 Cap 蛋白在大腸桿菌和桿狀病毒/昆蟲表達系統(tǒng)中表達并成功組裝成病毒樣顆粒（virus-like particle，VLP）[6-8]。但是大腸桿菌表達的PCV Cap 蛋白可溶性低，且有內(nèi)毒素污染，后期去除內(nèi)毒素工藝復(fù)雜且成本較高；昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)表達的VLP 具有很好的免疫效果，但是昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)表達的Cap 蛋白VLP 產(chǎn)量低、生產(chǎn)成本高、工藝復(fù)雜，難以用于動物疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)及應(yīng)用推廣。酵母表達系統(tǒng)作為一個高效的蛋白表達系統(tǒng)，具有成本低、蛋白可溶性表達等優(yōu)點。由于PCV3 Cap蛋白自身核定位序列（NLS）的影響，酵母系統(tǒng)直接表達該蛋白時很容易形成不溶性蛋白聚集。本試驗通過對PCV3 Cap 蛋白NLS進行改造，在酵母系統(tǒng)完成PCV3 Cap 蛋白的表達、純化，成功組裝PCV3 VLP，以期為進一步研發(fā)PCV3 亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料方法

1.1 菌株與載體

菌株P(guān)ichia pastoris X33、載體pPICZαA，均購自Invitrogen 公司。

1.2 主要儀器與試劑

1.2.1 主要儀器 離心機，購自HITACHI 公司；恒溫?fù)u床，購自上海智誠分析儀器制造有限公司；分光光度計，購自上海美普達儀器有限公司；電轉(zhuǎn)儀，購自BIO-RAD 公司。

1.2.2 主要試劑 YEAST EXTRACT（No.2194133）、tryptone（No.2330844），均購自O(shè)XOID 公司；D-sorbitol（No.BCBX1172/MKCF5469）、DTT（No.SLBW1508）、生物素（No.SLBZ4553），均購自Sigma 公 司；HEPES（No.EZ2811E176），購 自BioFROXX 公 司；Zeocin（No.ZEL-40-05），購自invivogen 公司；YNB（No.7332771）購自BD公司；D（+）-無水葡萄糖（No.20180711）、磷酸二氫鉀（No.20190225）、磷酸氫二鉀（No.20180323）、甲醇（No.20181231）、KOH（No.20180919），均購自滬式公司。

1.3 PCV3 Cap 蛋白一級序列預(yù)測及合成

根據(jù)NCBI 中PCV3 Cap 蛋白（GenBank 登錄號ATD53354.1）序列信息，利用cNLS Mapper（http://nls-mapper.iab.keio.ac.jp），將PCV3 Cap 蛋白的NLS 進行突變；優(yōu)化密碼子，并在優(yōu)化核酸序列的5'端添加堿基GCCACC（與起始密碼子ATG 共同形成KOZAK 序列），然后送金唯智公司合成。

1.4 重組PCV3 Cap 蛋白表達載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)染準(zhǔn)備

將合成的序列用TAKARA 無縫克隆試劑盒，經(jīng)同源重組的方式整合到pPICZαA 載體酶切位點PstI 和XbaI 之間，獲得重組質(zhì)粒pPICZαAPCV3。隨后，把上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到Top10 感受態(tài)細胞中培養(yǎng)。在培養(yǎng)平板上挑取單克隆菌落，抽提質(zhì)粒并經(jīng)1%核酸電泳驗證、酶切鑒定為陽性后，將線性化的質(zhì)粒用冷乙醇沉淀方法回收。冷乙醇沉淀的具體操作，參照《分子克隆實驗指南》[9]進行。

1.5 酵母表達PCV3 Cap 蛋白與純化

1.5.1 電轉(zhuǎn)染 將10 μL 線性化質(zhì)粒和90 μL X33感受態(tài)細胞在電轉(zhuǎn)杯中混勻，冰上孵育5 min；然后將電轉(zhuǎn)儀設(shè)定為時間恒定模式，電轉(zhuǎn)參數(shù)為電壓1 200 V、時間5.5 ms、電轉(zhuǎn)杯直徑0.1 cm；電擊后迅速加入4 ℃遇冷的YPDS 培養(yǎng)基，即獲得穩(wěn)定表達目標(biāo)蛋白的細胞庫；然后將細胞庫置于29 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)3 h；最后將菌液涂布到含有3 mg/mL zeocin 的YPDS 平板上，29 ℃避光靜置培養(yǎng)3 d。在此高濃度抗生素篩選出的菌落均是高拷貝菌株。

1.5.2 誘導(dǎo)表達 將上述長出的單菌落轉(zhuǎn)接至含1 mg/mL zeocin 的YPD 平板，然后對PCV3 Cap蛋白菌株進行菌體培養(yǎng)及誘導(dǎo)表達。培養(yǎng)及表達步驟為：挑取酵母單菌落至BMGY 培養(yǎng)基中，250 r/min 29 ℃過夜培養(yǎng)至菌液OD 值為2～6，20 ℃ 3 000 g 離心5 min，拋去上清；用BMM 培養(yǎng)基重懸菌體至菌液OD 值為2 左右，繼續(xù)放在29 ℃培養(yǎng)箱中震蕩培養(yǎng)24 h；然后補加0.5%甲醇，繼續(xù)29 ℃震蕩培養(yǎng)24 h；再次補加0.5%甲醇，同樣的條件繼續(xù)培養(yǎng)24 h。隨后離心收集菌體，拋去上清，再用等體積的裂解液（1×protein loading buffer）進行重懸菌體，沸水浴煮沸10 min。隨后進行SDS-PAGE 分析，根據(jù)SDS-PAGE 結(jié)果挑選出表達量最高的菌株。

1.5.3 純化 用高壓冷凍破碎儀裂解細胞，收取上清；然后用20%硫酸銨沉淀目標(biāo)蛋白，最后用HEPES buffer 重懸。重懸蛋白經(jīng)過分子排阻層析純化，獲取PCV3 Cap 蛋白。

1.6 PCV3 Cap 蛋白VLP 組裝及電鏡觀察

純化蛋白在50 mmol/L HEPES、200 mmol/L NaCl、pH7.4 緩沖液中，自組裝成大小均一的VLP，負(fù)染電鏡觀察顆粒，用4K CCD 相機獲取電鏡照片。

2 結(jié)果

2.1 PCV3 Cap 蛋白序列優(yōu)化

參考GenBank ATD53354.1 序列，利用在線工具cNLS Mapper，對PCV3 Cap 蛋白的NLS 序列進行突變。突變后的序列（Opti-Cap）經(jīng)NLS 預(yù)測網(wǎng)站分析發(fā)現(xiàn)，不再具有NLS 序列特點（圖1）。

圖1 優(yōu)化的PCV3 Cap 蛋白氨基酸序列

2.2 重組PCV3 Cap 蛋白表達載體構(gòu)建與鑒定

重組質(zhì)粒pPICZαA-PCV3 經(jīng)PmeI 酶切后進行1%核酸電泳驗證。結(jié)果（圖2）顯示，重組質(zhì)粒pPICZαA-PCV3 完全線性化。

圖2 重組質(zhì)粒pPICZαA-PCV3 酶切結(jié)果

2.3 重組PCV3 Cap 蛋白表達與鑒定

表達PCV3 Cap 蛋白的菌體裂解后進行硫酸銨沉淀及SEC 純化，將目的蛋白進行12% SDSPAGE 分析，可見大小約27 kDa 的蛋白條帶（圖3-A）。對目的條帶進行MS 分析，鑒定是PCV3 Cap 蛋白。

PCV3 Cap 蛋白經(jīng)負(fù)染制備樣品、電鏡觀察后，用4K CCD 相機獲取電鏡照片（圖3-B），可見均一的顆粒，顆粒直徑約18 nm。

圖3 PCV3 Cap 蛋白鑒定結(jié)果

3 討論

2015 年，美國初次分離鑒定出PCV3 毒株，隨后我國多地發(fā)現(xiàn)PCV3 感染[2-5]。PCV3 陽性豬場出現(xiàn)豬皮炎腎病綜合征、母豬繁殖障礙、多系統(tǒng)炎癥反應(yīng)等癥狀。其中：母豬受孕率降低、流產(chǎn)率增加，產(chǎn)木乃伊胎；仔豬主要表現(xiàn)為呼吸、泌尿、腸道、淋巴、心血管、神經(jīng)、繁殖系統(tǒng)以及皮膚的功能紊亂，致使保育豬體質(zhì)變?nèi)?，容易繼發(fā)感染。

PCV2 疫苗在我國已應(yīng)用推廣多年，PCV2 疫苗對PCV3 感染能否提供保護尚缺乏足夠的證據(jù)。由于PCV3 分離株未能實現(xiàn)體外培養(yǎng)，病原學(xué)研究尚未深入開展，導(dǎo)致PCV3 的滅活疫苗研發(fā)進展受阻。研究人員嘗試通過基因工程平臺拯救PCV3病毒，并在PK15 細胞上傳代成功，這或許會推動PCV3 疫苗的研發(fā)進展[10]。根據(jù)PCV2 亞單位疫苗研發(fā)經(jīng)驗，利用大腸桿菌或細胞直接表達其Cap蛋白制備亞單位疫苗，是一種簡單、有效、安全的疫苗生產(chǎn)方式[11-12]。已有研究[7-8]報道，PCV3 VLPs 組裝成功，并應(yīng)用于檢測試劑盒研發(fā)等。

大腸桿菌表達系統(tǒng)產(chǎn)量高，遺傳背景清楚，但是表達產(chǎn)物的內(nèi)毒素含量高，為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)帶來不便；桿狀病毒/昆蟲細胞表達系統(tǒng)對蛋白的折疊和修飾都較好，但是每次蛋白表達都要控制感染病毒的數(shù)量（即感染MOI 與蛋白表達產(chǎn)量有一定的制約關(guān)系），且生產(chǎn)工序復(fù)雜，因而影響其擴大生產(chǎn)，此外桿狀病毒/昆蟲細胞表達系統(tǒng)生產(chǎn)成本也較高。酵母表達系統(tǒng)在研發(fā)宮頸癌（HPV）疫苗、人乙肝（HBV）疫苗和人諾如疫苗等方面獲得廣泛應(yīng)用。該表達系統(tǒng)具有一定的蛋白修飾功能，而且培養(yǎng)簡單、成本低廉，對于獸用生物制品研發(fā)、生產(chǎn)有很好的應(yīng)用前景[13-15]。PCV3 Cap 蛋白的NLS 序列對其蛋白穩(wěn)定具有重要作用。若完全刪除NLS 序列，其在酵母系統(tǒng)中表達極不穩(wěn)定；保留NLS 序列，則Cap 蛋白在酵母表達系統(tǒng)中易發(fā)生不溶性表達。因此，本研究通過突變PCV3 Cap蛋白NLS 區(qū)序列，使PCV3 Cap 蛋白在酵母細胞實現(xiàn)可溶性表達，從而為PCV3 Cap 蛋白亞單位疫苗的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。